FSHW ｜ 基于转录组学解析侧孢短芽孢杆菌抗菌肽抑制单增李斯特菌的分子机制
Introduction
抗菌肽因其抗菌活性及安全性而受到广泛关注。近年来，短芽孢杆菌属（Brevibacillus spp.），特别是侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）被认为是富含抗菌肽的新来源。侧孢短芽孢杆菌抗菌肽大都是阳离子非核糖体脂肽，包括bogorols、brevilaterins、brevibacillins、brevicidines、relacidines和laterocidines等。这些抗菌肽对大多数革兰氏阳性细菌、部分革兰氏阴性细菌、真菌，甚至耐药菌具有高效的抗菌活性。因此，侧孢短芽孢杆菌抗菌肽在食品工业与农业上具有潜在的应用前景。而解析抗菌肽的抗菌机制更是一项重要的研究内容，将为抗菌肽应用奠定理论基础。
目前研究主要通过生化试验研究侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的可能抑菌作用机制，认为细胞膜作用是其主要抗菌方式，但对抗菌肽胁迫下的菌体生理代谢影响研究尚不充分，关于细菌暴露于侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的基因转录情况知之甚少。因此，研究侧孢短芽孢杆菌抗菌肽对致病菌基因转录的影响，有助于深入解析其抗菌分子机制，为食源性致病菌的有效控制提供参考。
北京工商大学食品与健康学院贾英民教授、马爱进教授团队 在研究侧孢短芽孢杆菌抗菌肽brevilaterin B对食源性致病菌单增李斯特菌抑制作用的基础上，基于转录组学分析了brevilaterin B胁迫下单增李斯特菌的应答情况，筛选验证关键差异基因及代谢途径，进而在基因水平上深入探究了brevilaterin B对单增李斯特菌的抑菌机制（图1）。
图1 脂肽brevilaterin B对单增李斯特菌的抑菌模式示意图
Results and Discussion
Brevilaterin B对单增李斯特菌的抑菌作用
Brevilaterin B对单增李斯特菌的最小抑制浓度MIC为1μg/mL，在该浓度下，单增李斯特菌生长受到显著抑制（图2）。通过流式细胞术结果，与未经brevilaterin B处理的单增李斯特菌比较，在4×MIC条件下，单增李斯特菌细胞PI荧光强度增强，表明其活细胞数量显著下降；这与透射电镜观测到的结果一致，4×MIC的brevilaterin B作用导致单增李斯特菌细胞皱缩，质壁分离，壁膜破损，细胞质着色变浅，表明胞内物质显著减少。而经1×MIC的brevilaterin B作用时，细胞数未显著降低，且单增李斯特菌仍具有较为完整的细胞结构，未见明显的壁膜破损，推测在1×MIC条件下，抗菌肽brevilaterin B可能影响了胞内的生理代谢过程。因而通过转录组学深入探究brevilaterin B对单增李斯特菌基因表达的影响。
图2 Brevilaterin B对单增李斯特菌的生长抑制
图3 Brevilaterin B对单增李斯特菌的活细胞数（A，B）及超微结构（C）的影响
Brevilaterin B作用单增李斯特菌的转录组学分析
通过转录组学分析brevilaterin B作用单增李斯特菌的RNA表达水平，共发现1 779个差异表达基因，其中895个上调，884个下调。GO及KEGG分析表明brevilaterin B影响多条细胞膜相关的代谢途径（表1），主要包括抑制肽聚糖生物合成，显著下调细胞壁合成前体相关基因murC、murY、murE与murG（P＜0.05）；抑制甘油磷脂合成，促进磷脂酰甘油降解和转化相关基因plcB、cls-1、cls-2显著上调（P＜0.05）；抑制ATP合成，显著下调atpB等转录基因（P＜0.05）；促进钾离子转运，钾离子调控双组分系统相关基因kdpB等显著上调（P＜0.05）；以及激活应激反应，阳离子抗性相关基因dltA等显著上调。
表1 Brevilaterin B影响单增李斯特菌的差异基因及KEGG代谢途径
同时，基于RT-qPCR技术验证了部分关键途径中的转录基因变化（图4A），发现涉及细胞壁合成途径中murE表达量降低为对照的5.93倍，lmoa2292表达水平提高2.42倍（P＜0.05），表明细胞壁合成过程受到抑制；ATP合成酶中的atpB显著下调4.24倍（P＜0.05），且单增李斯特菌的胞内ATP水平显著降低，与阳性对照gramicidin影响的胞内ATP水平降低的程度相似，表明brevilaterin B阻碍了ATP合成过程；寡肽转运基因oppC与对照相比下调6.46倍（P＜0.05），表明细胞的寡肽转运过程可能受到抑制。
图4 RT-qPCR验证及ATP水平变化
基于生化试验、转录组学及RT-qPCR验证分析，构建了brevilaterin B影响单增李斯特菌的关键代谢途径示意图（图5），主要包括肽聚糖合成、膜转运（ATP结合盒（ABC）转运体、双组分系统）、细胞代谢（氨基酸代谢、脂质代谢）、氧化磷酸化（ATP合成）、群体感应、细胞运动性（细菌趋化、鞭毛组装）等，这些重要通路主要发生在细胞膜上，如脂质的组装和运输Ⅱ、ATP合成和物质跨膜转运；而氨基酸、脂质代谢等途径也与细胞膜合成有间接的关系。
图5 Brevilaterin B影响的单增李斯特菌关键代谢途径示意图
Conclusion
综上所述，在MIC浓度的brevilaterin B作用时，单增李斯特菌的细胞结构仍基本保持完整，但其生长受到显著抑制；进一步经转录组学及RT-qRCR验证分析，在基因水平上揭示了brevilaterin B通过影响细胞膜相关的关键基因表达及代谢途径来抑制单增李斯特菌生长，包括抑制肽聚糖生物合成、膜转运、细胞代谢、ATP合成，促进钾离子转运，并激活应激反应等。该研究进一步完善了侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的抑菌分子机制，为抗菌机制全面深入解析提供了新的思路和理论参考。
第一作者
刘杨柳，女，北京工商大学食品与健康学院博士研究生。主要研究方向为微生物抗菌肽、酶与蛋白质工程等。参与国家自然科学基金、北京市自然基金-市教委合资等项目。近年来在AMB、FSHW等国内外期刊发表学术论文十余篇。
通信作者
贾英民，男，北京工商大学食品与健康学院教授，博士生导师。国务院特殊津贴专家、教育部食品科学与工程类教学指导委员会委员、食品科学技术学会常务理事。主要从事酶与蛋白质工程、食品微生物研究。先后主持“十三五”国家重点专项子课题、“十二五”科技支撑计划项目、国家自然科学基金、北京市自然-市教委合资项目等多项重要研究项目；在Critical Reviews in Food Science and Nutrition, JAFC等国内外期刊发表学术论文100余篇；取得国家发明专利十余项；曾获得省部级科技进步一等奖2项，科技进步二等奖2项；主持“食品微生物学”省级精品课程建设，并获得河北省优秀教学成果一等奖1项；主编国家十五规划教材和面向21世纪教材各一部。
通信作者
马爱进，男，北京工商大学食品与健康学院教授，博士生导师。国务院政府特殊津贴专家，现担任全国肉禽蛋制品标准化技术委员会副主任委员、全国生化检测标准化技术委员会委员，中国菌物学会食用菌采后及加工产业分会副会长、特殊食品抽检监测牵头分析专家委员会委员、Food and Agricultural Immunology编委、河北省核桃营养功能与加工技术重点实验室学术委员会主任等。主要研究领域包括食品及生物技术、标准化等。近年来，主持了科技部国家重点研发计划项目、中国科学院战略性先导科技专项子课题、国家自然科学基金项目等30余项科研项目；主持和参加国家标准70 项，获省部级科技成果奖13 项，主编和参编书籍12 部，在Food Hydrocolloids、Food Chemistry等期刊发表论文80余篇。
Transcriptomics reveals substance biosynthesis and transport on membranes of Listeria monocytogenes affected by antimicrobial lipopeptide brevilaterin B
Yangliu Liua, Yawei Ningb, Zhou Chena, Panpan Hana, Tongxin Zhia, Siting Lia, Aijin Maa,*, Yingmin Jiaa,*
a School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China
b College of Food Science and Biology, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China
*Corresponding authors.
Abstract
Listeria monocytogenes is a worrisome food-borne pathogen threatening global food safety. Our previous study proved that lipopeptide brevilaterin B showed efficient antibacterial activity against L. monocytogenes by interacting with the cell membrane. This research further explored the antibacterial mechanism of brevilaterin B against L. monocytogenes at the sub-minimum inhibition concentration via transcriptomic analysis. Brevilaterin B induced growth inhibition rather than direct membrane lysis in L. monocytogenes at the minimum inhibitory concentration. Transcriptomic analysis showed 1779 difference expressed genes, including 895 up-regulated and 884 down-regulated genes. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis indicated that brevilaterin B influenced multiple pathways of L. monocytogenes, including peptidoglycan biosynthesis, membrane transport (ATP-binding cassette transports, ion transport), cellular metabolism (amino acid and lipid metabolism), ATP synthesis, and activation of the stress response (quorum sensing and bacterial chemotaxis). In conclusion, brevilaterin B affects gene expression related to biosynthesis, transport and stress response pathways on the membrane of L. monocytogenes. The present work provides the first transcriptomic assessment of the antibacterial mechanism of lipopeptide brevilaterin B at the gene level.
Reference:
LIU Y L, NING Y W, CHEN Z, et al. Transcriptomics reveals substance biosynthesis and transport on membranes of Listeria monocytogenes affected by antimicrobial lipopeptide brevilaterin B[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1359-1368. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.037.
文章编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
