联合体内外多维化学物质组和分子对接策略的炮附子抗炎药效物质基础研究
原标题：联合体内外多维化学物质组和分子对接策略的炮附子抗炎药效物质基础研究
炮附子是东汉时期医圣张仲景通过干热法加工附子制备的炮制品，在《伤寒杂病论》的12个经方中均有应用[1]，具有治疗“风湿相搏，骨节烦疼”的抗炎药效。根据本课题组前期研究[2]，这种与《中国药典》制法相异的特色炮制方法，能有效避免附子水处理法造成的成分流失。且药理实验研究表明，干热法制备的 附子具有更显著的抗炎药效[3]。目前经典理论认为，附子的抗炎药效物质为饮片中的双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱，及苯甲酰乌头碱、苯甲酰中乌头碱、苯甲酰次乌头碱等单酯型生物碱[4]。然而随着中药药物化学学科的不断发展及提取分离、分析鉴定手段的进步，截至目前共发现了100多个附子的化学成分。近年有研究报道一些附子生物碱如附子灵、宋果灵同样具有抗炎作用[5-6]，提示可能还有抗炎药效物质尚未得到发掘，仅以经典成分进行药效研究存在一定的局限性。中药成分复杂，治疗疾病具有多成分相互协调的作用特点，并形成作用机制复杂的系统。因此挖掘更多药效物质，建立多活性成分研究体系更符合中药的治疗特征。
体内外多维化学物质组关联分析充分考虑到中药分离单体成分的困难，以及中药进入体内的原型成分和代谢产物浓度低导致的识别困难，建立了基于超高效液相色谱-质谱靶向数据分析方法，用于中药体外到体内化学物质组的快速定性分析。以体外研究结果为参考，体内研究结果为指导，逐层递进分析， 基于网络药理学筛选出作用于疾病靶点的成分，预测关键靶蛋白[7]。分子对接是利用计算机模拟并预测药物成分与靶蛋白的结合模式，从而筛选出活性较高的化合物。其操作简单、方便快捷，被广泛应用于筛选中药的活性成分和药效物质的研究[8]。
本研究联合体内、外多维化学组与分子对接策略探讨炮附子抗炎的药效物质基础。采用超高效液相色谱-离子阱-静电场轨道阱质谱（UPLC-LTQ- Orbitrap/MS）鉴别炮附子的体内、外化学物质组，利用网络药理学结合文献验证筛选关键靶蛋白，通过分子对接初步筛选炮附子潜在的抗炎药效物质。研究立足于中药化学成分的整体性及对机体的整体调控作用，有层次性和导向性的筛选炮附子抗炎的药效物质，快速地发掘药效成分，提高筛选效率。
1 材料
1.1 仪器、数据库与软件
Thermo Ultimate 3000超高效液相色谱、Thermo LTQ-Orbitrap质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；HC-3518离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BT 125D Sartorius电子天平（德国Sartorius公司）；SB25-12 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Chemspider（http://www.chemspider.com）；Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）；Genecards（http://www.genecards.org/）；GeneMANIA（https:// genemania.org/）；STRING（https://String db.org/）；Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）；Xcalibur 4.2化学工作站；Cytoscape 3.7.2；ChemDraw Professional 15.0；AutoDock Tools-1.5.6；ChemBio3D Ultra 14.0；AutoDock Vina；AutoDock Tools-1.5.6。
1.2 试药与试剂
生附 片（批号190601）购自四川江油中坝附子科技发展有限公司，经北京中医药大学石晋丽教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品；炮附片为北京中医药大学中药炮制系实验室在前期对炮附片炮制工艺及质量控制研究[9-11]的基础上制备，其质量符合《中国药典》2020年版标准；LC-MS级乙腈（批号194036）、甲酸（批号190284）、甲醇（批号205068）均购自美国Thermo-Fisher公司；水为屈臣蒸馏水；其余试剂为色谱纯。
1.3 动物
健康雄 性SPF级小鼠20只，体质量（20±2）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2019-0010。动物饲养于北京中医药大学良乡校区动物实验中心，温度（23±2）℃，湿度（35±5）%。所有实验程序均按照国家法律和地方指南进行。该动物实验获得了北京中医药大学动物伦理委员会的批准（BUCM-4-2020092903-3117）。
2 方法
2.1 基于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS的炮附子体外-体内化学物质组的分析
2.1.1炮附子体外化学物质组分析样品的制备
（1）炮附子供试品的制备：将河砂置热锅内，用武火加热，至滑利容易翻动时，投入净制并大小分档的生附片，不断翻炒，至鼓起，内外皆黄时，取出，筛去河砂，放凉。
（2）炮附子供试品溶液的制备：取炮附子饮片5 g，加10倍量水，浸泡30 min，大火煮沸后保持微沸30 min，倾出第1次煎煮液，4层纱布滤过；药渣再加8倍量水，大火煮沸后保持微沸30 min，倾出第2次煎 煮液，4层纱布滤过，合并2次煎液，减压浓缩至0.1 g/mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.2炮附子体内化学物质组分析样品的制备
（1）动物分组及给药：实验之前进行3 d适应性喂养，自由饮水和进食。小鼠随机分为2组，每组各10只，给药组ig给予剂量为5 g/(kg·d)炮附子水煎液，空白组ig给予剂量为33 mL/(kg·d)蒸馏水，分别给药7 d。
（2）血清 样本的采集和处理：末次ig给药前，小鼠禁食不禁水12 h，于ig后1 h，两组小鼠分别从眼眶静脉丛取血，置于离心管中，静置30 min，在15 000 r/min离心15 min后分离血清，再以15 000 r/min离心10 min，吸取上清液，将同一组别的血清等量混合，以消除个体差异。分别取2组血清400 μL，各加入1200 μL乙腈。冰水浴超声处理10 min，涡旋混匀1 min，将其在12 000 r/min、4 ℃离心15 min，移取上清液，氮气吹干，加入100 μL 70%甲醇水复溶，并在12 000 r/min、4 ℃离心15 min。移取上清液用于UPLC-LTQ-Orbitrap/MS进样分析。
2.1.3分析条件色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH-C 18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～7 min，4%～15% B；7～24 min，15%～30% B；24～30 min，30%～33% B；30～40 min，33%～60% B；40～50 min，60%～100% B；50～52 min，100% B；52～53 min，100%～4% B；53～57 min，4% B；体积流量为0.2 mL/min，进样量为5 μL；柱温为30 ℃。
质谱条件：HESI离子源，正离子模式扫描，质量扫描范围为m/ z 50 ～2000；离子源温度为350 ℃，电离源电压、毛细管电压、管透镜电压分别为4 kV、35 V和110 V；辅助气体积流量为20 arb，鞘气体 积流量为40 arb，二者均为氮气；一级质谱采用傅里叶变换高分辨全扫方式，数据扫描分辨率为30 000；二、三级质谱采用数据依赖性扫描方式获取；运用CID碎解方式。
2.1.4数据分析根据质谱在正离子模式下扫描提供化合物的精确相对分子质量、准分子离子、多级离子碎片信息、保留时间并结合文献报道鉴定炮附子体外原型化学物质组；以体外化学物质组为指导，通过对比空白血清，排除内源性基质的干扰，阐明体内化学物质组。
2.2 基于网络药理学的炮附子抗炎靶蛋白的筛选
2.2.1获取成分靶点与疾病靶点获取入血成分的“Canonical SMILES”或化学结构式，在Swiss Targe t Prediction网站上，选择物种为“Homo sapiens”，进行靶点的预测，构建成分靶点数据库；登陆Genecards，搜索“inflammation”的靶点。选取score＞8的疾病靶点，去重后构建疾病靶点数据库。
2.2.2直接靶点、间接靶点的获取与蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与分析取成分靶点与疾病靶点的交集，得到直接靶点，将直接靶点导入GeneMANIA数据库中，获取间接作用靶点；将直接靶点和间接靶点导入STRING数据库中，获得作用关系结果文件，将文件导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，利用“Network Analyer”功能对PPI网络进行拓扑学分析。以“Degree”值作为参考，结合文献报道，选取靶点作为下一步进行分子对接的靶蛋白。
2.3 基于分子对接策略的炮附子抗炎药效物质的筛选
2.3.1配体小分子的准备在Pubchem网站中查找入血成分即配体小分子的2D结构并用ChemDraw Professional 15.0绘制，保存为cdx格式；在ChemBio3D Ultra 14.0软件里打开后，依次选择“Calculations”-“MM2”-“Minimize Energy”将配体能量最小化，结果保存为mol2格式；在AutoDock Tools-1.5.6软件里打开mol2文件，进行自动加氢及电荷，将小分子文件转换成pdbqt格式。
2.3.2受体靶蛋白的准备Protein Data Bank 网站中，根据PDB ID下载受体靶蛋白的pdb格式文件；在AutoDock Tools-1.5.6软件里进行极性氢原子添加以及非极性氢的合并，以pdbqt格式保存。
2.3.3对 接过程及结果评价在AutoDock Tools-1.5.6软件设置GridBox的大小，使其完全包裹受体靶蛋白的空腔，以便在对接过程中较全面地搜寻结合位点，将设置的参数文件保存为gpf格式。采用AutoDock Vina对配体和受体进行半柔性分子对接。通过查阅文献报道[12-14]，选取具有显著抗炎疗效的吲哚美辛、醋酸地塞米松及阿司匹林作为本实验的阳性药，将阳性药物分别与抗炎靶蛋白进行分子对接，以阳性药物对接结果的结合自由能（binding energy，? G ）、估计抑制常数（inhibit constant，Ki）[15]的平均值为参考衡量药物小分子与受体蛋白的结合能力，炮附子化学成分与靶蛋白对接结果的? G 和Ki越小，表明结合越稳定。
3 结果
3.1 炮附子体内外化学物质组表征
基于“2.1.3”项的条件，在正离子模式下得到炮附子水煎液及入血成分的总离子流图见图1。鉴别出炮附子水煎液中53个化学成分及37个入血成分，其中包含6个去甲基化代谢物。通过查阅文献报道[16]，这些代谢物的原型成分可能是异塔拉乌头定、尼奥灵、乌头碱、塔拉地萨敏、14-乙酰塔拉胺等，具体数据见表1。
3.2 炮附子抗炎靶蛋白的确定
3.2.1成分作用靶点与疾病靶点的获取根据获取入血成分“Canonical SMILES”格式的分子结构及化学结构式，在Swiss Target Prediction网站上，预测294个可能的成分靶点；共获得去重后的疾病靶点142个。
3.2.2直接靶点、间接靶点的获取与抗炎靶蛋白的选择共得到12个直接靶点与20个间接靶点；基于PPI网络的构建与拓扑学分析，并结合文献报道[17-19]，初步选取Degree值排名前3的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）、纤溶酶原（plasminogen，PLG）为抗炎的靶蛋白，PPI网络的可视化效果图见图2。
3.3 分子对接结果
3.3.1炮附子体内化学物质组与3个靶蛋白的对接结果在炮 附子体内化学物质组与3个靶蛋白的对接结果（表2）中，共筛选出21个潜在的抗炎药效物质。其中可以同时与3个靶点稳定结合的有11个，为卡拉可林、宋果灵、海替生、易混翠雀花碱、黄草乌碱丁、绣线菊碱C、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、三小叶翠雀碱E、裸翠雀亭；能同时与2个靶点稳定结合的有5个，为森布星A、次乌头原碱、附子灵、14-乙酰尼奥灵、森布星B；能与1个靶点稳定结合的有5个，为新乌头原碱、异塔拉乌头定、乌头原碱、尼奥灵、塔拉地萨敏。与TLR4、MMP9、PLG结合力最强的分别为异塔拉乌头定、绣线菊碱C、三小叶翠雀碱E。
3.3.2潜在药效物质与3个靶蛋白氨基酸残基的作用情况炮附子中筛选出的21种潜在的抗炎药效物质与3个靶蛋白氨基酸残基的作用情况见表3。为直观地展示化合物与靶蛋白的结合模式以及化合物与周围氨基酸残基的相互作用，以异塔拉乌头定与TLR4、绣线菊碱C与MMP9、三小叶翠雀碱E 与PLG的结合为例，做出化合物与靶蛋白对接的3D模型与二维平面图，如图3所示。异塔拉乌头定稳定地结合在由Leu212、Phe104、Glu111、Ala107、Arg106、Glu266、His159、Asn185、Lys186、Ser184、Asn114组成的疏水口袋中，其5号氧原子与Thr115、Ser103、Asn265形成3个氢键；MMP9的活性空腔主要由Val 216、Gly215、Gly217、Tyr248、Gly186、Asp185组成，绣线菊碱C很好地占据空腔，其1号氧原子与Tyr218形成1个氢键；三小叶翠雀碱E的2号氧原子与Thr66形成氢键，其环状结构与Gly19、Lys20、Lys21、Cys22、Ser24存在疏水作用。
4 讨论
4.1 体内、外化学物质组的建立
中药经历炮制加工过程的化学成分变化，最终以饮片的形式通过体内传输发挥临床疗效，其功效是药效物质基础经过体外变化和体内吸收、代谢后生物效应的综合体现。因此，明确饮片化学物质组“体外-体内”的传递-转化过程，能为药效物质的筛选提供清晰的路径。本研究基于体内、外多维化学物质组首先对炮附子水煎液中的化学成分进行表征，鉴定得到53个化合物，继而对入血成分进行分析，鉴定出37个化合物，其中6个代谢物主要是由C 19 - 二萜生物碱成分去甲基化转化，这些原型成分可能是潜在的活性成分。文献研究表明，C 19 - 二萜生物碱具有消炎、止痛等多种药理活性[20]，其中双酯型C 19 - 二萜生物碱可能是通过白细胞趋化作用，影响前列腺素的代谢，最终表现出抗炎作用[4]。本研究系统地阐释了炮附子“体外化学物质组-体内化学物质组”的传递，明确了炮附子化学成分经口服由体外传递到体内可能发挥药效的成分，便于炮附子抗炎药效物质的进一步筛选。
4.2 炎症靶蛋白的选择与确定
中药治疗疾病，可能是一种成分作用于多个靶蛋白，也可能是多种成分作用于同一个靶蛋白[21]，因此科学合理地选择具有代表性的靶蛋白，对筛选中药潜在的活性成分具有重要意义。网络药理学通过建立并分析成分-靶点-疾病之间的关系网络，可以预测疾病发生发展过程中的关键靶蛋白。本研究基于网络药理学、构建PPI网络并对其进行拓扑学分析最终根据“Degree”值选择并确定了抗炎的靶蛋白TLR4、MMP9、PLG。研究表明，TLR作为介导天然免疫的重要模式识别受体，在炎症的发生和发展中起着重要作用[22]；TLR4作为关键上游受体，广泛存在于多种细胞表面，在脂多糖介导的免疫反应中极其重要，能选择性的识别细菌脂多糖，激活TLR4信号通路，通过释放促炎因子、趋化因子诱导炎症反应[23]，控制着炎症信号的细胞内转导和核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活化入核，导致众多促炎因子白细胞介素-17（interleukin 17，IL-17）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的释放增加，形成炎症反应[17]。MMP9是明胶酶家族主要成员，在免疫炎症、细胞凋亡等过程中发挥作用。正常情况下MMP9表达水平极低；在炎症状态下，炎症因子、血管细胞粘附分子会诱导MMP9的表达，促进免疫炎症细胞的迁移并上调MMP9活性，与机体的炎症反应密切相关[18]。PLG是一种糖蛋白，纤溶酶原促进纤维蛋白溶解并增强炎症反应[24]，纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活剂抑 制剂影响PLG的水平变化，抑制纤溶酶原激活物因子表达可降低炎性因子水平，减轻炎症反应[19]。以上文献研究进一步佐证了本研究选取靶蛋白的合理性。
4.3 基于分子对接策略进一步筛选炮附子潜在的抗炎药效物质
中药化学成分复杂，使中药药效物质基础的研究面临艰难与挑战，是长期以来制约中药现代化发展的颈瓶[25]。目前对于中药药效物质的研究主要是利用中药指纹图谱、血清药理学、药动学等技术，虽然能够在一定程度上阐明中药的部分药效物质，但实验周期长、成本高且难以全面揭示整体的药效物质基础[26]。基于以上研究现状，本研究采用分子对接技术，通过计算机模拟实现了对中药药效物质大规模地虚拟筛选，缩短了实验周期、节省了实验成本。共筛选出21个潜在的抗炎药效物质，其中卡拉可林、宋果灵、海替生、易混翠雀花碱、黄草乌碱丁、绣线菊碱C、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、三小叶翠雀碱E、裸翠雀亭能与3个抗炎靶蛋白稳定结合。已有文献报道，宋果灵在体外实验中表现出抗风湿活性，其抗炎机制可能与抑制炎性细胞因子的产生和下调缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和TLR4的表达水平有关[27]；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对角叉莱胶引起的大、小鼠后踝关节肿，组织胺引起的皮肤渗透性增加，受精鸡胚浆膜囊上肉芽组织形成均有明显的抑制作用[28]；除此以外，朱瑞丽等[29]发现苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱还对脂多糖刺激的巨噬细胞均有抗炎作用，下调巨噬细胞两种炎症因子TNF-α和IL-6的分泌量，这与本研究虚拟筛选的结果一致。卡拉可林、海替生、易混翠雀花碱、黄草乌碱丁、绣线菊碱C、三小叶翠雀碱E、裸翠雀亭鲜有文献报道其抗炎药效，这为后续炮附子抗炎药效物质的开发提供了理论指导。本研究还筛选出新乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉地萨敏、次乌头原碱、乌头原碱等化合物，Li等[5]通过网络药理学分析和高通量筛选表明新乌头原碱、附子灵、尼奥灵是抑制炎症反应的药效物质，其机制可能与抑制NF-κB信号通路的异常活化有关。Liu等[30]通过建立细胞胰腺炎模型发现塔拉地萨敏、次乌头原碱是抗急性胰腺炎的有效成分。Zeng等[31]推测乌头原碱可能是治疗慢性关节炎的主要活性物质，机制是乌头原碱通过抑制NF-κB、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）c1的激活及树突状细胞-特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）的表达，抑制巨噬细胞RAW264.7细胞分化为破骨细胞。以上文献报道进一步佐证了本研究虚拟筛选的药效物质的合理性。此外筛选出的单体化合物森布星A、异塔拉乌头定、海替生、14-乙酰尼奥灵、森布星B的抗炎活性尚不十分明确，有待于进一步地实验验证。
4.4 基于体内外化学物质组联合计算机虚拟筛选的研究模式展望
目前中药活性物质的筛选研究，开始阶段纳入的 单体成分，常来源于一些线上数据库。以常用的中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）为例[32]，研究者根据纳入标准设立较高的筛选阈值，导致大量的经典中药活性成分被剔除。例如，采取口服利用度（oral bioavailability，OB）≥40%，且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的标准[33-34]，已被证实具有显著抗炎药效的乌头碱并不会被纳入筛选的范围内（OB＝7.87%，DL＝0.23）。本研究采用液质联用技术鉴别饮片及血清内的化学成分，以此来代替传统的线上数据库筛选，以体外饮片的鉴别作为“标杆”对照，含药血清的鉴别作为最终结果。这种方法虽不能表征出包含中药全部成分的化学物质组，但保证了纳入对象为吸收入血的中药成分。另一方面，根据Orbitrap高分辨、高灵敏、进样量少的检测特点，使得血容量较少的小鼠也可进行研究，检测限上的响应结果反映了供试体系内相对含量较高的离子，也就是说，鉴别结果为中药体系内含量较高的化学成分，在不考虑彼此效价强度的基础上，这种结果也契合逻辑上的量效关系，即含量越高，药效越强。计算机虚拟筛选模式凭借较好的预测精度及导向性优势，对药效物质的筛选有一定的参考价值，一定程度上避免了研究的盲目性[35]。
本研究采取的体内、外化学物质组联合计算机虚拟筛选的研究模式，基于体外-体内成分挖掘、虚拟多靶标筛选、活性成分预测与文献验证相结合的策略，在理论上评价中药化学成分对效应靶点的结合能力，快速筛选中药的药效物质[36]。对于中药复杂体系的研究具有一定的启示和帮助，然而预测结果仍有可能出现假阳性、假阴性，后期尚需要实现进一步的实验验证。
本研究联合体内、外多维化学物质组和分子对接策略筛选出森布星A、新乌头原碱、卡拉可林、异塔拉乌头定、乌头原碱、宋果灵、海替生、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵等21个化合物与炎症靶点的对接结果优于阳性药，为炮附子潜在的抗炎药效物质。发现卡拉可林、宋果灵、海替生、易混翠雀花碱、黄草乌碱丁、绣线菊碱C、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、三小叶翠雀碱E、裸翠雀亭11个化合物与3个炎症靶蛋白均能稳定结合，可能是值得发掘的具有潜力的药效物质。目前的文献报道可部分验证本研究的筛选结果，但仍有一些药效物质的抗炎效果缺乏文献佐证，今后的研究可进行相关的药理实验进一步验证其抗炎活性并明确量、毒、效的关系，保证临床用药的安全有效。本研究为炮附子抗炎药效物质的筛选及进一步的机制研究提供了理论依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：尹贻慧，张 凯，陈 倩，焦鸣杰，陈冬玲，张 佳，李 飞．联合体内外多维化学物质组和分子对接策略的炮附子抗炎药效物质基础研究 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3785-3795.
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