miR-190a-5p 靶向 C／EBPα-PU.1 通路促进骨髓巨噬细胞 M1

　　巨噬细胞是机体内具有吞噬功能的免疫细胞，在免疫和炎症反应中发挥重要作用[]。在不同刺激因素的作用下，巨噬细胞可转化成具有不同功能的表型，这个过程称为极化[]。巨噬细胞可分为两种极化类型，经典活化巨噬细胞（M1 型）和替代活化巨噬细胞（M2 型）。M1 巨噬细胞具有强大的抗菌特性并促进炎症反应。M2 巨噬细胞可以抑制免疫应答，参与炎症消退，诱导血管生成[-]。核转录因子 κB（nuclear factor κB，NF-κB）、CCAAT/增强子结合蛋白-α（CCAAT enhancer-binding protein α，C/EBPα）、PU.1 和干扰素调节因子 5 参与 M1 激活，信号传导及转录激活蛋白 6、氧化物酶体增殖活化受体-γ、C/EBPβ 等参与 M2 表型的极化[-]。

　　巨噬细胞在心血管系统中起到了重要的调控作用，早期心肌梗死（心梗）的局部炎症反应影响了梗死后心肌的修复。M2 型巨噬细胞能够吞噬、清除凋亡坏死细胞，以及抑制促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6，诱导抗炎因子 IL-10、转化生长因子-β 发挥抗炎效应。目前的研究[-]已发现 miRNA 在免疫细胞的发育、分化、存活及功能成熟中起重要作用。通过对巨噬细胞极化过程中 C/EBPα 靶点与 miRNA 相互作用进行预测，发现有关 miR-190a-5p 对巨噬细胞极化的影响目前尚未见报道，本文将对此进行研究。通过体外实验发现 miR-190a-5p 能够通过靶向 C/EBPα、PU.1 增强 M2 极化，抑制促炎细胞因子 TNF-α、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）。这些研究表明 miR-190a-5p 具有调控巨噬细胞的极性，进而降低心梗区炎症作用的潜力。

　　雄性 BALB/C 小鼠 10 只，SPF 级，30～45 d 龄，体重 28～30 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK（上海）2016-0009。

　　试剂：miR-190a-5p 模拟物（吉玛公司）、NC-inhibitor（吉玛公司）、miR-190a-5p inhibitor（擎科生物公司）、胎牛血清（Gibco 公司）、DMEM（Gibco 公司）、脂多糖（Sigma 公司）、M-CSF（Peprotech 公司）、Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司）、Trizol 试剂（Invitrogen 公司）、PrimeScrip RT Master Mix 试剂盒（TAKARA 公司）、TB Green Premix Ex Taq（TAKARA 公司），Arg1、iNOS、TNF-α 及内参基因 GAPDH 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。仪器：高速冷冻离心机（Eppendorf 5810R，德国）、紫外-可见分光光度计（Beckman Du730，美国）、荧光定量 PCR 仪（ABI7500，美国）。

　　颈椎脱臼法处死小鼠，剪开股骨、胫骨两端，用 1 mL 无菌注射器吸取 PBS 溶液冲出骨髓；避光裂解红细胞 3 min；PBS 吹打清洗，低温 250×g 离心 3 min，重复清洗 2 遍；加入巨噬细胞集落刺激因子（40 μg/L）条件培养基（90%DMEM+体积分数为 10% 小牛血清+1% 青霉素、链霉素+50 μg/L 巨噬细胞集落刺激因子），37 °C、体积分数为 5% CO2 细胞培养箱培养；培养 3 d 后换液，再培养 4 d 后收集贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞（bone-marrow-derived macrophage，BMDM），为下一步实验做准备。

　　将BMDM种在 6 孔细胞培养板中，5×105/孔，培养过夜待细胞完全伸展后，利用 Zeiss 荧光显微镜观察及采集巨噬细胞形态图像。

　　将处于对数生长期的 BMDM 细胞按 5×105个/mL 接种于 6 孔板中，2 mL/孔，设 M1 组、NC 组、miR-190a-5p 组，每组 3 个复孔培养细胞生长至 90% 融合状态时，加入 200 ng/mL 的脂多糖诱导 1 d，第 2 d NC组及 miR-190a-5p 组按照转染试剂盒 Lipofectamine 3000 操作说明书转染BMDM 细胞，24 h 后换液并收集细胞进行下一步实验。对于抑制 miR-190a-5p 操作过程为将处于对数生长期的 BMDM 细胞按 5×105 个/mL 接种于 6 孔板中，2 mL/孔，设 M2 组、NC-i组、190a-i 组，每组 3 个复孔培养细胞生长至 90% 融合状态时，加入 200 ng/mL 的脂多糖诱导 1 d，第 2 d 三组都加入 IL-4 至浓度为 20 μg/mL 诱导巨噬细胞为 M2 表型 1 d，第 3 d 使用 miR-190a-5p inhibitor 及 NC-inhibitor 按照转染试剂盒Lipofectamine 3000 操作说明书分别转染 190a-i 和 NC-i 组，24 h 后换液并收集细胞进行下一步实验。

　　将脂多糖诱导 1 d 的 BMDM 细胞以及转染 NC、miR-190a-5p 模拟物的 BMDM 细胞，利用多聚甲醛（4%）室温固定收取的 EP 管中细胞 30 min，接着用含 2% BSA 的 PBS 洗涤细胞 2 次，用含 5% BSA 的 PBS 封闭细胞表面抗原 15 min，再用 F4/80、CD11b、CD206 抗体孵育 30 min（室温），最后洗涤细胞 2 次，用含 2% BSA 的 PBS 重悬震荡成充分混匀的悬液待上机，用流式细胞仪检测， F4/80、CD11b 双阳性即为巨噬细胞，F4/80、CD206 双阳性即为 M2 巨噬细胞。

　　将脂多糖诱导的 BMDM 细胞，以及转染 miR-190a-5p 模拟物的巨噬细胞经 Trizol（1 mL/孔）处理后，加入 0.2 mL 氯仿，剧烈震荡 15 s，室温静置 2 min 后，12000 r/min，4°C 离心 15 min，吸取上层无色水相，转移入另一 EP 管中（约 0.5 mL），加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10 min 后，12000 r/min，4°C 离心 15 min，弃上清，加入 75% 乙醇 1 mL 洗涤沉淀，12000 r/min，4°C 离心 15 min。弃上清，风干 10～15 min，每管加入 20 μL DEPC 水溶解沉淀。紫外分光光度计测定所提 RNA 的浓度和纯度，含量为 1.5～2.0 g/L，OD260/OD280 在 1.8～2.0 之间。

　　然后按逆转录试剂盒说明书操作要求，将 RNA 逆转录成 cDNA。荧光定量 PCR：按照 SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行 PCR 反应，95°C 预变性 30 s，95°C 变性 5 s，60°C 退火 30 s，40 个循环，每次扩增设置 GAPDH 为内参对照。反应体系为 SYBR Green 染料 5 μL，上游引物 0.2 μL，下游引物 0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 模板 1 μL。制作标准曲线，根据标准曲线扩增效率的一致性，选用 2-ΔΔCt 法分析样本中 iNOS、TNF-α、精氨酸酶-1（ arginase 1，Arg1）、C/EBPα、PU.1 的 mRNA 的相对表达量。荧光定量 PCR 引物序列见。

　　上述方法分组处理好巨噬细胞后，用 4°C 的 PBS 清洗 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，刮取细胞蛋白存于 1.5 mL EP 管中静置冰上 30 min，充分裂解后，4°C、14000 r/min 离心 30 min 弃除上清液，用 BCA 法进行蛋白定量。配制 SDS-PAGE 凝胶，各组等量蛋白上样、电泳分离，电泳后将蛋白转移至 PVDF 膜上。室温下 5% 脱脂牛奶封闭 PVDF 膜 2 h，用 TBST 清洗 PVDF 膜两次，C/EBPα 一抗（1∶1000）孵膜，4°C 过夜。TBST 洗膜 3 次后。室温孵育二抗（1∶5000）1 h，TBST 洗膜 3 次后成像系统显影，GAPDH 为内参，用 Image J 软件进行灰度值分析。

　　数据分析采用 SPSS 22.0 软件。服从正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）描述，组间比较采用 One-Way ANOVA 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

　　本研究已通过上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物伦理与使用委员会批准，批准号：A2020124。

　　巨噬细胞在加入脂多糖的完全培养基中培养 1 d 时，主要呈扁平圆形，透光性较差，煎蛋样，其触角较短，为 M1 型细胞形态特征。转染 NC、miR-190a-5p 模拟物的 BMDM 细胞培养 24 h 后，NC 组主要呈扁平圆形，为 M1 型细胞形态特征。miR-190a-5p 组巨噬细胞触角伸长，透光性较好，细胞呈长索状，为 M2 型细胞形态特征；见。

　　用胰蛋白酶消化 M1、NC、miR-190a-5p 组的巨噬细胞后固定、封闭，再用 F4/80、CD11b、CD206 抗体室温孵育 30 min，最后洗涤细胞重悬上机，用流式细胞仪检测 F4/80、CD11b，圈出双阳性细胞即巨噬细胞，F4/80、CD206 双阳性细胞即为 M2 巨噬细胞。结果显示 M1 及 NC 组F4/80、CD206双阳性率 10% 以下，miR-190a-5p 组接近 50%；见。

　　与脂多糖诱导下 M1 组比较，NC 组 M1 表型相关基因 iNOS 和 TNF-α 与 M2 表型相关基因 Arg1 的 mRNA 表达水平无显著变化，miR-190a-5p 作用 48 h 后 iNOS 和 TNF-α 的 mRNA 相对表达量显著降低（P<0.05），Arg1 的 mRNA 相对表达量显著升高（P<0.05）；见。

　　靶基因预测软件发现 miR-190a-5p 与 C/EBPα 的 3'UTR 端存在互补结合位点，我们用 qPCR 验证了 miR-190a-5p 及其靶点 C/EBPα 和下游基因 PU.1 的关系，发现转染 24 h 后，C/EBPα 与 PU.1 mRNA 显著下调（P<0.05）；见。

　　与 M1 组比较，NC 组 C/EBPα（0.92±0.05 vs. 0.81±0.03）和 PU.1（1.01±0.01 vs. 1.01±0.06）蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），miR-190a-5p 转染组与 M1 组相比，蛋白表达水平明显下降（0.50±0.01 vs. 0.81±0.03，0.57±0.09 vs. 1.01±0.06，P<0.05）；加入 miR-190a-5p 抑制剂后，与 M2 组比较，NC-i 组 C/EBPα 和 PU.1 蛋白表达水平差异无统计学意义（0.51±0.02 vs. 0.45±0.03，0.42±0.00 vs. 0.52±0.01，P>0.05），190a-i 组与 M2 组相比，蛋白表达水平明显上调（0.85±0.06 vs. 0.45±0.03，0.96±0.09 vs. 0.52±0.01，P<0.05）；见。

　　巨噬细胞是非特异性免疫的重要组成部分，在炎症和宿主防御中发挥重要作用。M1 型巨噬细胞构成了对病原体的第一道防线。M2 型巨噬细胞能够促进炎症吸收与消退，促进炎性组织修复。多项实验已经证实了可以通过巨噬细胞 M1/M2 型的转换来调节炎症反应。在过去的研究[-]中，miRNA 调控巨噬细胞极化的研究已收获大量成果，这些结果皆表明 miRNA 有望成为治疗巨噬细胞相关疾病的重要角色。因此，了解 miRNA 调节巨噬细胞极化的机制将有助于揭示某种 miRNA 可能是预防或治疗上述疾病的靶点，从而丰富现有的临床治疗手段。但目前巨噬细胞极化的信号通路尚未被全部揭示，许多 miRNA 的靶基因与巨噬细胞极化的关系还不清楚。从以往的研究[-]中可以发现，巨噬细胞极化可被多种 miRNA 调控，但是多个 miRNA 如何协同作用还有待进一步研究。

　　miR-190a-5p 在巨噬细胞以及心梗炎症反应中的生物学作用尚未被清楚描述。在本实验中，我们首次发现 miR-190a-5p 促进 M2 巨噬细胞的极性化，抑制 M1 极化。转染具有 miR-190a-5p 的巨噬细胞导致与 M2 巨噬细胞表型相关的标记物和细胞因子上调，而与 M1 巨噬细胞表型相关的细胞因子和标记物下调。转录调控是调控巨噬细胞极化的重要途径，PU.1 是一种转录因子，可被 Toll 样受体激活引起炎症反应。C/EBPα 转录因子是 PU.1 的上游，直接激活 PU.1 的转录。C/EBPα 和 NF-κB 协同诱导许多基因参与炎症反应。在机制上，我们进一步证明了 miR-190a-5p 通过靶向 C/EBPα 调控巨噬细胞表型，miR-190a-5p 过表达下调巨噬细胞中 C/EBPα 的 mRNA 和蛋白水平，这些发现提示了 miR-190a-5p 可以通过靶向 C/EBPα 的 3'UTR 和调节 PU.1 表达来调控巨噬细胞 M2 极化，降低心梗区炎症反应。

　　巨噬细胞是除了心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞以外心脏中数量最多的实质细胞。当前关于巨噬细胞在心血管疾病中损伤修复、心肌再生和心肌重塑等方面的作用研究得还不够透彻。然而目前已发现许多 miRNA 参与调节巨噬细胞极化，它们通过抑制靶基因的表达来改变 M1/M2 型巨噬细胞表型。使心脏巨噬细胞表型在适当的时间点完成从促炎症到促修复的表型转换，不仅有利于快速清除凋亡、坏死组织，还能加速心肌再生、心脏修复。miRNA 调节心脏巨噬细胞极化并改变巨噬细胞极化相关疾病的进展，以及与其它实质细胞之间的相互作用都值得在将来的研究中进一步探索。

　　利益冲突：无。

　　作者贡献：杨磊实施研究，包括细胞培养、诱导及流式细胞术等，撰写文章； 薛松设计课题及相关技术指导；王亚祥进行收集、整理数据、图片，细胞培养等；连锋设计课题及相关技术指导，对文章进行核对修改等。