全球CRISPR-CAS9疗法全景图
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来源 |? 美柏医健
作者 |?西北&王不留行
诺贝尔奖（瑞典语：Nobel priset，英语：Nobel Prize）是指根据诺贝尔1895年的遗嘱而设立的五个奖项，包括：物理学奖、化学奖、和平奖、生理学或医学奖和文学奖，旨在表彰在物理学、化学、和平、生理学或医学以及文学上“对人类作出最大贡献”的人士；以及瑞典中央银行1968年设立的诺贝尔经济学奖，用于表彰在经济学领域杰出贡献的人。
2020年10月，瑞典斯德哥尔摩：天气已然转冷，偶尔一阵冷雨飘过，路上的行人不禁握紧了手中的雨伞，或者竖起了大衣的领子。而赶上阳光明媚的时候，三三两两的人们出门郊游，行走在如油画般的森林里。虽然一年一度的诺贝尔奖评选已经开始，这里依然安静。
10月7日，诺贝尔奖委员会宣布，将2020年的诺贝尔化学奖授予法国科学家埃埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和美国女科学家珍妮弗·杜德纳，以表彰她们在基因编辑领域做出的重要贡献。现在，就让我们一起了解一下这个被称为“基因魔剪”的伟大技术以及他们在临床治疗上的进展。
01
CRISPR-CAS9技术发展进程
在介绍本文的主角——CRISPR之前，我们首先了解下基因编辑领域的另外两大利器——ZFN和TALEN。
（1）?ZFN
锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）又称锌指蛋白核酸酶，是第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略。2018年12月，Sangamo Therapeutics宣布启动评估SB-FIX的I/II 期临床试验，对SB-FIX的第一个患者进行给药，实现了全球首个利用ZFN技术在B型血友病患者体内基因组的编辑试验。
ZFN技术诞生于1996年，是一种人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA识别结构域与限制性内切酶的DNA切割结构域融合而成。通过设计锌指DNA结合结构域来靶向定位于不同的DNA序列，ZFN可以结合于基因组中的靶序列，并由DNA切割结构域对靶序列进行切割，从而敲除某个基因或某段序列和/或插入新的基因或某段序列。DNA识别结构域含1～3个锌指蛋白，每个锌指蛋白可以结合一个DNA上的碱基三联体，如GAC，ATA等，几个锌指蛋白串联，可以实现对特异DNA序列的识别；两个DNA切割结构域临近时可以产生核酸内切酶活性，将结合的DNA切割开。
ZFN技术相关的专利主要由美国Sangamo公司持有，该公司在ZFN基因编辑技术上深耕20余年，获得了包括锌指蛋白设计、筛选、优化、实验室及临床应用等多项专利。依托于技术优势，Sangamo在全球范围内开展了广泛的合作：
Sangamo与Pfizer就A型血友病基因疗法以及就神经元疾病基因疗法达成两次合作
2017年5月，Sangamo与Pfizer就一款A 型血友病基因疗法签署了独家全球协作和许可协议，交易金额达5.45亿美元；2018年1月，双方又针对锌指转录因子（ZFP-TFs）基因疗法治疗C9ORF72基因突变项目进行合作，交易金额包括1200万美元的预付款及1.5亿美元的里程碑付款，总额1.62亿美元。
Sangamo与Sanofi子公司Bioverativ合作推进血红蛋白病基因疗法
2018年5月，Sangamo 和Bioverativ合作，共同研发基于ZFN基因编辑技术的自体细胞疗法BIVV003治疗镰状细胞病，美国FDA也已接受BIVV003的IND申请，目前BIVV003项目处于1/2期临床阶段。
Sangamo与Shire合作开发亨廷顿氏病基因疗法
Sangamo与Shire（后被武田收购）合作，共同改造 ZFP-TF，用于选择性靶向 mHTT 基因并抑制其转录从而治疗亨廷顿病（HD）。2019年，该项目取得了不错的临床前数据，后续武田将负责所有临床开发活动，包括提交研究性新药 IND 申请等。
Sangamo与Gilead子公司Kite合作开发下一代自体和异体细胞疗法
2018年年初，Sangamo与Kite签署协议，Sangamo授权Kite使用ZFN 技术进行基因修饰，以开发下一代细胞疗法，用于不同癌症的自体和异体治疗。Sangamo将获得1.5亿美元的预付款，此外，还有资格获得高达30.1亿美元的潜在里程碑付款（基于使用 Sangamo 技术的 10 多个产品的研发、监管和推广里程碑的实现）。
Sangamo与Biogen合作开发神经系统疾病领域项目
2020年2月，Sangamo与Biogen签署了一项全球许可合作协议，合作开发并商业化包括ST-501用于包括阿尔茨海默症在内的多种tau蛋白相关疾病等多个神经系统疾病领域项目。按照此次协议，Sangamo将获得3.5亿美元的预付款，此外，还有潜在的高达23.7亿美元的其他开发、监管和商业里程碑付款。
Sangamo与Novartis共同开发基因调控疗法
2020年7月，Sangamo与Novartis公司签署了一项全球许可合作协议，利用Sangamo的基因组调控技术——锌指蛋白转录因子（ZFP-TFs），开发和商业化基因调控疗法，用以解决包括自闭症谱系障碍和其他神经发育障碍在内的三个神经发育过程相关的疾病。
基于自主研发和广泛的合作，Sangamo构建了丰富的产品线。
▲图1 Sangamo的产品管线
（来自：Sangamo官网）
ZFN技术的一个突出问题是脱靶效应，即核酸酶并未对预先设定的目标DNA序列进行识别和切割，或者虽然识别了正确的位点但是因为Fok I异源二聚体的存在而对其他位点进行了切割。虽然Sangamo优化了锌指蛋白的选择和产品开发进程，但是获得高质量基因编辑产品仍然需要较长的时间和较高的费用，而且具有较高的技术壁垒。
（2）TALEN
转录激活子样效应子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技术诞生于2009年，是继ZFN后的第二代人工核酸酶技术，其利用TALEN蛋白核酸酶结合域氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间存在着恒定对应关系，从而组装出能特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白。目前应用该技术的公司包括Cellectis，该公司的技术特点是通过TALEN基因编辑技术，对健康捐赠者的T细胞进行基因编辑，敲除TCR等相关基因的表达，以降低或者消除异体细胞输注引起的异体排斥作用而只发挥抗肿瘤作用，目前该公司也有一系列的相关技术项目正在开发阶段，具体如以下产品线所示。
▲图2 Cellectis的产品管线
（来自：Cellectis官网）
相比于ZFN技术，TALEN技术具有效率高、特异性高和构建过程简单等优势，但仍存在着脱靶现象，成本也比较高。
（3）CRISPR
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律间隔成簇短回文重复序列）是生命进化过程中，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器。简单来说就是病毒把自己的基因整合到细菌内，利用细菌的系统为自己的基因复制服务。而细菌为了防止病毒感染，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（后来命名为CRISPR序列）和Cas基因。位于CRISPR中间的间隔序列就是获得性的，病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而是更易侵入那些没有间隔序列的细胞。
CRISPR/Cas9是第三代人工核酸内切酶，同ZFN、TALEN一样可用于各种复杂基因组的编辑。该技术起源于1987年，日本Nakata研究组在分析大肠杆菌（Escherichia coli）中基因iap及其临近序列（flanking regions）时，偶然发现位于iap的3’端有29个碱基的高度同源序列重复出现，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开来。随后的十年期间（1989年-1999年），陆续有相关研究指出类似的重复序列存在于多种细菌及古生菌中。2000年，Mojica和同事通过比对发现这种重复元件存在于20多种细菌及古生菌中，并将这种核酸序列命名为短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSRs），因为这些序列在不同的细菌中具有高度保守性，所以大家猜测他们一定发挥重要的生物学功能。
到了2002年，Jansen实验室通过生物信息学分析，发现这种新型DNA序列家族只存在于细菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中没有被发现，并将这种序列称为规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。他们将临近CRISPR 位点的基因命名为cas（CRISPR-associated），并发现了4个cas基因（分别命名为cas1，cas2，cas3，cas4）。2005年，Mojica，Bolotin和Pourcel三个研究组指出CRISPR中的间隔序列来自于外来的噬菌体或质粒，其中Mojica实验室更是惊喜地发现病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而易侵入那些没有间隔序列的细胞，由此他们提出CRISPR可能与RNAi类似，参与细菌的免疫功能的假说。
2007年，CRISPR能在细菌的免疫功能中起作用的假设首次得到实验证实。Horvath研究组发现嗜热链球菌被病毒入侵后整合了来自病毒基因组中新的间隔区序列，同样的病毒再次入侵时细菌就有了抗性，使其免受攻击。而如果人为地去除或添加特定的间隔区序列，会影响细菌的抗性表型。因此，他们认为CRISPR及cas基因一起为嗜热链球菌提供了对病毒的抗性作用，同时抗性的特异性取决于CRISPR中的间隔区序列。
2008年，Oost实验室揭示了宿主细胞中CRISPR的间隔序列如何在cas蛋白的协助下介导发挥抗病毒作用。他们发现在CRISPR转录后，cas蛋白与其他组分形成一个被称为Cascade的复合物，裂解每个重复单元中的CRISPR RNA前体（pre-crRNA），但裂解产物都保留了间隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA（crRNA）发挥小向导RNA（small guide RNA）的作用，促使Cascade干预病毒的增殖。2009年，Mojica团队指出间隔序列临近的PAM区为原核生物中CRISPR/Cas发挥免疫识别提供了靶标。
2011年，Charpentier研究组通过对人类病原体化脓性链球菌的差异化RNA测序，揭示了反式编码crRNA（tracrRNA）参与pre-crRNA的加工成熟过程。他们指出，tracrRNA通过24个核苷酸与pre-crRNA中的重复序列互补配对，在保守的内源性RNA酶III和CRISPR相关的Csn1蛋白的参与下指导pre-cr RNA的成熟过程，这些组分对保护化脓性链球菌免受噬菌体DNA的入侵必不可少。
CRISPR/Cas作为基因编辑系统的应用最早开始于2012年两位诺奖女神的强强联合，她们分别是来自加州大学伯克利分校的结构生物学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）和瑞典于默奥大学的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。她们通过体外实验证明：成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。在与crRNA指导序列互补的位点，cas9蛋白的HNH核酸酶结构域切割crRNA的互补链，而cas9蛋白RuvC样结构域切割非互补链。当tracrRNA：crRNA被嵌合到一条RNA时，同样可以指导cas9切割双链DNA。她们的研究揭示了CRISPR/Cas系统在RNA指导下进行基因编辑的巨大潜力。
2013年，CRISPR/Cas9系统被成功应用于人类和小鼠基因组编辑，在哺乳动物细胞中实现基因定点突变，第三代人工核酸内切酶技术迅速成为各国学者研究的重点基因编辑技术。
2016年，华西医院卢铀教授研究组首次完成了由CRISPR/Cas9编辑进行的临床治疗实验，研究者分离患有转移性非小细胞肺癌病人血液中的免疫细胞，利用CRISPR/Cas9系统特异性的敲除其中的PD-1基因，再对细胞扩增培养后输回患者体内以期抵抗癌症。
从实际应用的角度来说，CRISPR-Cas9技术比TALEN技术更易操作，构建也比TALEN和ZFN更简单，而且随着研究的不断深入和进展，各种优化的和提升的CRISPR系统组分被设计和筛选出来。CRISPR技术发展到现在，其具体优势主要体现在：
（1）操作简便，靶向精确性更高。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFN更简单，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。
（2）CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。
（3）基因修饰率高，尤其在基因敲入方面，CRISPR基因敲入的效率为51-79%，TALEN的效率为0-34%。
（4）基因调控方式多样化，包括敲除、插入、抑制等，而且理论上可以实现对靶基因多个位点同时编辑。
（5）实验周期短，最快仅需2个月。
▲图3 CRISPR–Cas9和CRISPR–Cas12a系统的调控（来自：参考文献24）
目前，CRISPR-Cas9系统的应用主要集中在基础研究领域、农业领域和医药领域。在基础研究中，可通过基因突变、敲入、敲除等，来进行基因功能研究；在农业领域，可应用CRISPR-Cas9技术进行遗传育种及作物改良；在医药领域范围内，CRISPR-Cas9技术应用的更为广泛，可用于构建新的动物模型、筛选新的药物靶点、进行宿主系统的优化、基因治疗、再生医学、抗病毒治疗和抗菌治疗等等。
02
CRISPR的专利大战
CRISPR-Cas9是一个非常有前景的基因编辑工具，作为最具有突破性发现的基因工程技术，CRISPR-Cas9也引得无数英雄竞折腰，最受瞩目的要属CRISPR三巨头Jennifer Doudna、Emmanulle Charpentier、张锋三人之间的试比高。
CRISPR技术的专利之争要追溯到2012年，Jennifer Doudna与Emmanuelle Charpentier合作，在Science杂志上首次发表了基因编辑史上的里程碑论文，成功解析了CRISPR-Cas9基因编辑的工作原理，并且证明了CRISPR技术能在试管中精确切割细菌（原核细胞）的DNA。紧接着在2013年，张锋博士在Science杂志上报道称，CRISPR也在真核生物中起作用，首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞。
虽然Doudna和Charpentier发表论文的时间比张锋早，申请专利的时间也比张锋早，然而USPTO（美国专利商标局）于2014年将CRISPR-CAS9技术在真核细胞中进行基因编辑的专利授予了张锋所在的Broad研究所，而认为加州大学基于体外和原核细胞中的CRISPR-Cas9基因编辑数据不足以支持其要求的该技术用于编辑细菌、植物、动物和人类等所有类型细胞的广泛的保护范围。随后，加州大学向PTAB（美国专利审查与上诉委员会）提出申诉，认为该校杜德纳与其合作者卡彭蒂耶是CRISPR技术的最早发现者，在CRISPR上的专利申请与Broad研究所已有专利冲突，并且认为Broad研究所2014年的专利不应被授权。该案历经PTAB、联邦巡回上诉法院及联邦最高法院的审理，最终还是维持了PTAB最初裁定的加州大学和Broad研究所的专利申请涉及不同的发明，各自可以在自己专利的保护范围内继续享有自己的专利权。
而在欧洲和中国战场，完全是另外一番景象。加州大学及其合作伙伴一改在美国本土的不利局面，首先是其在欧洲和中国的专利申请先后获得授权，范围涵盖CRISPR/CAS9系统在真核细胞如人类细胞和其他哺乳动物细胞中的应用。然后是Broad研究所在欧洲的核心专利（美国诉讼系争专利）被EPO撤销。因为在不同的地域，双方都有专利被授权，我们推测双方的专利纷争还没有最终尘埃落定，再加上进入这一领域的玩家越来越多，最后可能会通过交叉许可或者建立专利池等方式解决这一领域的复杂的专利问题。
2020年，张锋与诺奖失之交臂，而Doudna和Charpentier斩获诺奖，但三人在CRISPR技术上所作的巨大贡献都是非常值得肯定的，受到CRISPR技术荣获诺奖的重大利好影响，三人的公司股价随即大涨。
此外，张锋团队宣布将CRISPR/Cas9基因编辑的专利对学术界免费开放，前提是不用于商业目的，商业化用途须付费使用，这一举动也赢得了学术界的支持，将CRISPR技术的科研资源带到全球各地的实验室。总之，CRISPR技术的专利之争之所以能让各位神仙打架，还是因为该技术能创造的无限潜力，背后巨大的市场前景也是这场专利战引人关注的原因所在。
03
基于CRISPR技术的公司
（1）CRISPR Therapeutics
CRISPR Therapeutics于2013年10月成立于瑞士，研究中心在马萨诸塞州剑桥，由获得2020年诺贝尔化学奖的Emmanuelle Charpentier及其同事创立。2016年9月纳斯达克上市，2020年10月市值66.94亿美元。CRISPR Therapeutics与Vertex、Casebia Therapeutics等建立了战略合作伙伴关系，开发基于CRISPR技术的基因治疗方案。
CRISPR Therapeutics研发管线中包含多个基因治疗在研产品，其中CTX001、CTX110、CTX120和CTX130已进入临床研究阶段。该公司基因治疗产品重点开发适应症包括β-地中海贫血、镰状细胞病和肿瘤等。研发管线还包含三个CAR-T细胞产品，分别靶向CD19、BCMA以及CD70。
▲图4 CRISPR的产品管线
（来自：CRISPR官网）
（2）Editas Medicine
Editas Medicine成立于2013年9月，同年11月改为现用名，是最早上市的CRISPR-Cas9技术公司，由张锋和Jennifer Doudna共同创立，2016年2月在纳斯达克上市，2020年10月市值19.12亿美元。
Editas Medicine体内基因治疗重点开发适应症是与Allergan合作开发的眼科疾病，包括伯氏先天性黑蒙症（进入临床阶段的EDIT-101）、Usher’s syndrome（尤塞氏综合症）和Retinitis Pigmentosa（色素性视网膜炎）。此外，公司研发管线中还有针对β-地中海贫血、镰状细胞病和抗肿瘤的细胞治疗产品。
▲图5-1 Editas的产品管线
▲图5-2 Editas的产品管线（来自：Editas官网）
（3）Intellia Therapeutics
Intellia Therapeutics公司成立于2014年5月，由获得2020年诺贝尔化学奖的Jennifer Doudna及其同事共同创立。公司于2016年5月在纳斯达克上市，2020年10月市值13.48亿美元。
Intellia Therapeutics公司研发管线中，体内基因治疗重点开发适应症是甲状腺素运载蛋白淀粉样变性（Transthyretin amyloidosis，ATTR）和遗传性血管性水肿（Hereditaryangioedema，HAE）。体外基因治疗产品主要关注镰状细胞病和急性髓系白血病以及实体瘤。体外治疗产品均为基于CRISPR/Cas9技术的细胞治疗产品，包括造血干细胞治疗产品、TCR治疗产品和CAR-T治疗产品及其他。
▲图6 Intellia的产品管线
（来自：Intellia官网）
（4）Horizon Discovery
Horizon Discovery成立于2007年，总部位于英国剑桥，具有十余年的基因编辑历史，于2014年在伦敦股票交易市场上市。2020年10月公司市值为145.65亿便士。公司拥有rAAV、CRISPR、ZINC Finger等多项技术专利（或授权许可），可以高效、快速、精确地实现基因或染色体的定点编辑。目前公司的主营业务收入来源于基因编辑相关CRO技术服务。
2017年，Horizon收购了RNA干扰（RNAi）领域的Dharmacon Inc.，实现了转型并显著扩大Horizon业务范围，使其能够为客户提供RNAi干扰的各方面的解决方案，包括siRNA、慢病毒shRNA、microRNA研究工具、RNAi功能筛选的基因组规模文库、microRNAs和长链非编码RNA等。
▲图7 Horizon的主要业务（来自：Horizon官网）
（5）Poseida Therapeutics
Poseida Therapeutics创立于2014年，总部位于美国圣地亚哥，是一家临床阶段的生物制药公司，主要利用公司专有的基因工程平台技术开发下一代细胞和基因疗法，使用诸如CRISPR的基因组编辑技术，在高度未满足的医疗需求领域开发针对性的治疗药物。2020年7月在纳斯达克上市，10月公司市值为5.66亿。
目前公司正在开发自体和同种异体CAR-T候选产品，用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤，研发管线包括抗肿瘤的CAR-T细胞侯选物、以及用于治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症（OTC）和甲基丙二酸血症（MMA）的体内基因治疗侯选物以及体外造血干细胞（HSC）移植相关产品三个部分。
▲图8 Poseida的产品管线（来自：Poseida官网）
（6）Caribou Biosciences
Caribou Biosciences 成立于2011年，是一家专注基因工程的生物技术公司，总部位于美国加利福尼亚州。Caribou 由Rachel Haurwitz博士与她的同事共同创建，Haurwitz师从Jennifer Doudna，Doudna也是Caribou的联合创始人。
Intellia Therapeutics也是在Caribou的基础上创立的，利用Caribou的CRISPR-Cas9技术平台开发基因治疗药物。Caribou将其技术授权给了Intellia，使之成为人类治疗技术应用的独家授权者。
Caribou利用CRISPR-Cas9基因编辑技术正在转化生物研究，开发新的生物基产品，致力于将CRISPR-Cas9技术应用于基因治疗、农业生物技术、生物研究和工业生物技术等四大领域。
▲图9 Caribou的治疗领域
（来自：Caribou官网）
（7）eGenesis
eGenesis成立于2015年，由GeorgeChurch和他的中国学生杨璐菡联合创办，主攻基因编辑技术方向研究，位于美国马萨诸塞州。
eGenesis正在开发可供人类器官移植使用的转基因猪，用CRISPR/Cas9基因编辑技术将猪的特定基因剔除，使得猪的器官可以移植到人体。
▲图10 eGenesis的研发管线
（来自：eGenesis官网）
（8）Beam Therapeutics
Beam Therapeutics成立于2017年，位于美国特拉华州，是首家利用单碱基编辑技术开发精准基因药物的生物技术公司，由张锋教授、David Liu教授以及J. Keith Joung教授共同创立。2020年于纳斯达克上市。
Beam认为其单碱基编辑技术是CRISPR基因编辑工具的全新应用。这项技术由两个关键组成部分组成，一是能特异性靶向基因组中任意位点的CRISPR酶；二是一类能修改碱基的酶，主要对碱基进行化学修饰，不会切开DNA或RNA，理论上安全性更高。作为首家上市的碱基编辑技术公司，Beam主要关注基因矫正、基因修饰、基因活化、基因沉默和多基因编码等领域。目前，Beam公司在研产品还未进入临床研究阶段。
▲图11 Beam的产品管线
（来自：Beam官网）
（9）Casebia Therapeutics
Casebia Therapeutics成立于2016年，是CRISPR Therapeutics与Bayer成立的合资企业，双方对半持股，致力于通过基因编辑技术开发治疗血液疾病和自身免疫、代谢和先天性心脏病的方法。
CRISPR为Casebia提供基因编辑技术支持，产品涉及血液和眼科等特定疾病领域，Bayer为Casebia提供蛋白质工程技术支持，以显著提高CRISPR/Cas9基因编辑平台的能力。
自2019年10月，Bayer公司将Casebia生物技术的全部运营权移交给CRISPR Therapeutics。目前，Casebia官网已与CRISPR Therapeutics合并，无法获取专属于Casebia的研发管线。
▲图12 CRISPR的合作对象（来自：CRISPR官网）
（10）Inscripta
Inscripta成立于2015年，是一家基因编辑技术服务公司，总部位于美国科罗拉多州。Inscripta正在开发全球首个可扩展数字基因组工程的台式平台，致力于创造革命性的基因编辑技术和工具，帮助受当前技术和许可限制的基因编辑研究科学者。
基于前沿的CRISPR基因编辑原理，Inscripta开发了新一代CRISPR核酸内切酶类——MADzymes。MADzymes具有识别不同PAM序列、高效切割DNA等特征。目前，Inscripta已在其核酸酶发现和工程平台发布了核酸酶MAD7的DNA序列。核酸酶MAD7也是Inscripta的MADzymes家族中发现的第一种酶。2018年7月，Inscripta首个核酸酶MAD7基因编辑系统获得美国专利商标局的专利认可，并且被证明在微生物和哺乳动物系统中有效。
▲图13 MAD7结构模型
（来自：Inscripta官网）
（11）Synthego
Synthego是一家基因工程解决方案供应商，2012年，由前SpaceX工程师 Paul Dabrowski 和 Michael Dabrowski 兄弟二人创立，总部设在加州硅谷。
Synthego的主打产品CRISPRevolution是一个为CRISPR基因组编辑和研究设计的合成RNA组合，以提高研究的速度，同时减低成本。主要业务是开发基于机器学习的基因组工程方法，旨在通过机器学习、自动化和工程生物学的结合，加速研发成本较低的基因疗法。
▲图14 Synthego的主营业务（来自：Synthego官网）
（12）Inari Agriculture
Inari Agriculture成立于2016年，总部位于美国马萨诸塞州，致力于利用CRISPR基因组编辑技术开发革命性的植物育种技术，专注于农业领域，通过基因编辑技术更有效率地利用地球上有限的自然资源。
▲图15 Inari培育植物（来自：Inari官网）
（13）Pairwise Plants
Pairwise Plants成立于2017年，总部位于美国北卡罗来纳州，是一家农业创新型公司，致力于利用基因编辑技术，以新的方式利用农作物的自然多样性来应对全球粮食挑战。
Pairwise Plants获得了的资金投资通过使用基因编辑技术来推动农业研究和开发。并签署合作协议，Pairwise将在玉米、大豆、小麦、棉花和油菜作物研发领域和孟山都开展独家合作，孟山都也获取Pairwise Plants关于作物应用的技术知识产权，包括将两家公司合作研发的产品商业化。
▲图16 Pairwise产品流向市场过程（来自：Pairwise官网）
（14）博雅辑因
博雅辑因成立于2015年，是一家致力于通过国际前沿的基因组编辑技术，为多种遗传疾病和癌症加速药物研究以及开发创新疗法的企业。博雅辑因有造血干细胞平台、通用型CAR-T平台、体内疗法-RNA碱基编辑平台、高通量基因组编辑筛选-新药研发平台四大平台，平台项目正在稳步推进，目前进展最快的是体外疗法的针对重型β地中海贫血的ET-01和针对癌症的异体CAR-T ET-02。其中，ET-01的临床试验申请获中国国家药品监督管理局受理，是我国药品监督管理局受理的首个CRISPR基因编辑疗法临床试验申请。
▲图17 博雅辑因的产品管线
（来自：博雅辑因官网）
此外，还有已经被收购的基于CRISPR/Cas9技术的研发公司，如Agenovir、Exonics Therapeutics等。Agenovir原位于加州旧金山，它用基因编辑技术（比如CRISPR/Cas9）治疗重大疾病，尤其是针对宫颈癌、肛门癌、尖锐湿疣、巨细胞病毒、Ebstein-Barr病毒感染等。2018年，Agenovir被VirBiotechnology收购，收购后，VirBiotechnology使用其CRISPR/Cas9基因编辑手段针对HPV和HBV进行研发。Exonics Therapeutics成立于2017年2月，致力于开发SingleCut CRISPR基因技术，旨在修复杜氏肌营养不良（DMD）等其他神经肌肉疾病的致病基因突变。2019年，Exonics被Vertex收购，收购金额高达10亿美元（7.87亿英镑）。
04
CRISPR-CAS9疗法的临床进展
目前，CRISPR/Cas9 技术已应用于镰状细胞性贫血、地中海贫血、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤等疾病的研究，处于临床阶段的进展如表1所示。
▲表1 CRISPR/Cas9疗法的临床进展（国外）（来自：Clinical trails、各公司官网、参考文献24等）
05
CRISPR-CAS9疗法的伦理问题
随着对该项技术的科学价值和商业价值的呼声越来越高，其带来的社会伦理问题也引起了广泛关注，尤其是关于基因编辑在人类胚胎上的应用。
2015 年，来自中山大学的黄军就教授带领团队首次发表编辑人类胚胎的相关论文，宣布他们在实验室中使用CRISPR/Cas９系统，将胚胎中地中海贫血症相关基因敲除，完成世界上“首例胚胎编辑”实验。但事实上由于镶嵌现象和脱靶效应，整个胚胎井没有被完全编辑，同时以此种方式出生的孩子可能面临未知或是无法承受的风险，因而，严格意义上来讲，这次胚胎编辑并不能算是成功。
2016 年３月，世界上第二例人类胚胎编辑实验同样由中国团队完成。来自广州医科大学附属第三医院的范勇教授利用 CRISPR／Cas系统对人类受精卵进行基因编辑，以抵制艾滋病毒感染。
2017 年，广州医科大学附属第三医院刘见桥教授带领团队再一次完成了“世界首次”——将 CRISPR初次应用于人类二倍体胚胎，在胚胎层面对携带遗传突变基因的胚胎进行修复。
2017年８月，《 Nature》杂志发文介绍了美国首例基因编辑人类胚胎的研究，该项研究由来自于俄勒冈健康与科学大学的 Shoukhratb Mitallpov团队完成。他们通过 CRISPR／Cas９技术锁定并移除了42 个胚胎内肥厚型心肌病有关的变异基因。
而将这一争议推向高潮的是贺建奎的转基因婴儿事件。2018年11月26日，贺建奎在第二届国际人类基因组编辑峰会召开前一天宣布：一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿于11月在中国健康诞生，这对双胞胎的一个基因经过修改，使她们出生后即能天然抵抗艾滋病。这是世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿。
在贺建奎事件发生后，我们对国内监管胚胎基因编辑相关的规范进行了整理，目前的相关规范从位阶上来看主要属于部门规章。
例如，原卫生部在2003年7月颁布的《人类辅助生殖技术规范》明确规定“禁止以生殖为目的对人类配子、合子和胚胎进行基因操作”。而不以生殖为目的的人体胚胎基因编辑研究是可以进行操作的。
2003年12月，由中国科技部和原卫生部制定的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》明确规定可以以研究为目的对人体胚胎实施基因编辑和修饰，但必须遵守14天法则。“14天法则”是指该指导原则第六条，明确规定，进行人胚胎干细胞研究，必须遵守以下行为规范：
（一）利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14天。
（二）不得将前款中获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其它动物的生殖系统。
也就是说，利用体外受精、体细胞核移植等技术、在研究范围内获得的人类胚胎，“其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14天”。
《关于取消第三类医疗技术临床应用准入审批有关工作的通知》第二条规定：医疗机构禁止临床应用安全性、有效性存在重大问题的医疗技术（如脑下垂体酒精毁损术治疗顽固性疼痛） ，或者存在重大伦理问题（ 如克隆治疗技术、代孕技术） 。
另外，我们还检索到《基因工程安全管理办法》（1993）、《人类遗传资源管理暂行办法》（1998）、《人类辅助生殖技术管理办法》（2001）等关于基因科技的相关规定，但并未有专设于基因治疗的法律规范。
2016年10月，原国家卫生和计划生育委员会颁布了《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》，通过行政规章的形式规范了涉及人的生物医学研究涉及的领域和研究对象、需要遵循的程序和行为准则。而由于目前中国法律尚未对人体胚胎法律地位予以明确，所以该审查办法并未对涉及人体胚胎的基因编辑研究做出具体规定。
目前，我国进行CRISPR研究的机构主要在北京、上海、杭州、西安等地区，参与的公司有20家左右。但是我们必须要认识到，中国在基因编辑技术方面的立法还存在灰色空间（通常我们认为法阶不够高、可操作性不强或者罚则不明确的时候就容易存在灰色空间），为了促进基因编辑技术健康、可持续发展，有必要继续完善相关的监管政策。
06
CRISPR-CAS9疗法在中国
随着CRISPR/Cas9技术的日益发展与完善，我国也有很多研究团队在CRISPR/Cas9技术上取得一定的成果。近日，中国国家药品监督管理局受理了首个CRISPR基因编辑疗法临床试验申请。
▲图17 博雅辑因CRISPR/Cas9疗法ET-01获批（来自：国家药品监督管理局药品审评中心官网）
此外，通过研究者发起的临床研究方式，多项基于CRISPR/Cas9技术的临床研究在中国开展。表2整理了目前在中国进行的CRISPR/Cas9临床应用研究。
▲表2 CRISPR/Cas9疗法的临床进展 （中国）（来自：clinical trails、各公司官网、参考文献24等）
结语
CRISPR/CAS系统是细菌自身天然的获得性免疫系统，无数的实验证明它能够在真核生物中进行精准有效的基因组工程操作。CRISPR技术的最新发展见证了基因编辑领域的持续不断的进步。合理设计的CRISPR递送平台在体内实现了组织特异性基因组编辑。许多基于CRISPR的离体和体内治疗方法目前正在进行临床试验。此外，该领域的技术进展仍在持续进展，下一代Cas内切核酸酶具有更高的靶标特异性和更大的靶标范围。
尽管CRISPR的临床转化已取得了巨大进展，但仍有一些问题亟需解决。CRISPR的系统递送仍然是本领域的一个关键挑战，而且许多类型的细胞，例如神经元、心肌细胞和免疫细胞，需要体内给药载体才能进行有效的基因组编辑；另一个问题是仍需尽量降低该系统的脱靶效应，以避免大片段基因的删除和复杂的基因重排。为了分析基因组编辑数据，标准化的和定量的方法也应该建立。此外，CRISPR疗法在临床应用过程中可能会遇到更多问题，例如p53介导的DNA损伤修复，和预存Cas蛋白抗体引发的问题，这些都需要进行全面、深入的评估。通过从目前的临床前研究和临床研究中获得更多的数据，研究人员和临床医生有望对CRIPSR获得更深刻的了解，如果有了这些新的知识和经验，我们可以预期CRISPR疗法未来的应用前景更为广阔。
文献参考来源
1 CRISPR Therapeutics官网，2 Editas Medicine官网，
3 Intellia Therapeutics官网，
4 Horizon Discovery官网，
5 Sangamo Therapeutics官网，
6 Poseida Therapeutics官网，
7 Caribou Biosciences官网，
8 eGenesis官网，
9 Beam Therapeutics官网，
10 Inscripta官网，
11 Synthego官网，
12 Inari Agriculture官网，
13 Pairwise Plants官网，
14 博雅辑因官网，
15 Clinical trails官网，
16 国家药品监督管理局药品审评中心官网，
17 知识分子，《基因编辑技术CRISPR的发展简史：从发现到爆炸》
18 火石制造，《盘点：国外基因编辑公司汇总》
19 药渡，《CRISPR VS 诺贝尔：终成眷属》
20 医健趋势，《2018CRISPR技术发展简史及其市场分析》
21 蓝鲸财经，《诺奖背后的专利大战：CRISPR三巨头七年“爱恨情仇”，百亿美元市场将花落谁家？》
22 Bio生物世界，CRISPR专利战风云再起，最新裁决张锋成最大赢家，为获诺奖再添筹码
23 lifeomics，《基因组编辑三大利器：TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9》
24 Li et al. (2019) Strategies for the CRISPR-Based Therapeutics. Trends Pharmacol SCI. 41, 55-65
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28 Kosicki, M. et al. (2018) Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat. Biotechnol. 36, 765–771
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