在治疗HvG病中使用的融合蛋白的制作方法
融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域(scfv)、经修饰的hcd8铰链、hcd8跨膜域、胞内hcd28信号传导域和胞内hcd3ζ(hcd3zeta)信号传导域，它们优选从n端到c端彼此连接，更优选从n端到c端彼此直接连接。
尤其在car-sla-01*0401中，融合蛋白可以含有hδfcigg域作为经修饰的hcd8铰链的备选，和/或融合hcd28跨膜域-hcd28/cd3zeta域作为hcd8跨膜域的备选，胞内hcd28信号传导域和胞内hcd3ζ(hcd3zeta)信号传导域。
此外，本发明涉及编码car融合蛋白的核酸序列，优选包含在病毒载体中，例如，在5'ltr和3'ltr之间，核酸序列更优选包含在适于转导treg细胞的病毒颗粒中。其中，优选包含在病毒颗粒中的核酸序列和病毒载体用于治疗宿主抗移植物(hvg)病。根据本发明，hvg病的治疗通常是抑制针对移植的移植物的细胞毒性t细胞活性。
此外，本发明涉及用于引入分别对hla-a*02或sla-01*0401特异性的抑制物活性的体外方法，其通过在treg细胞中表达根据本发明的融合蛋白，例如，通过将编码融合蛋白car-a*02或car-sla-01*0401的核酸序列导入treg细胞中进行，所述treg细胞通常不含或不表达hla-a*02或sla-01*0401，优选地，treg细胞对患者是同基因的(homogeneic)，例如从患者的活组织检查中获得并分离。本发明提供了治疗hvg病的方法，其包括对患者施用表达本发明的融合蛋白car-a*02或融合蛋白car-sla-01*0401的treg细胞。
现有技术
macdonaldetal.,thejournalofclinicalinvestigation1-12(2016年3月22日)描述了具有对hla-a2特异性的scfv域的通用car，以及转导用于表达car以进行hla-a2特异性抑制的调节性t细胞。scfv域含有单克隆抗体bb7.2的重链和轻链可变区。除scfv外，car还含有cd28跨膜域、cd28信号传导域和cd3ζ信号传导域。
inagumaetal.,genetherapy575-584(2014)描述了可用于使t淋巴细胞针对表达特定蛋白质的肿瘤细胞的t细胞受体的构建，包括分离当在hla-a2复合物中结合时对肿瘤特异性蛋白具有特异性的抗体scfv，以及使用scfv作为合成t细胞受体中的域。
noyanetal.,cancergenetherapy19,352-357(2012)描述了通过慢病毒转导在造血干细胞和祖细胞中诱导的转基因表达，用于治疗实体瘤。
gallaetal.,nuc.ac.res.39,1721-1731(2009)描述了用于通过逆转录病毒颗粒转导细胞的转座酶的细胞毒性效应。
distasietal.,nengljmed1673-1683(2011)描述了通过引入编码胱天蛋白酶-9二聚体的序列以产生细胞中可诱导凋亡的系统来进行遗传操作。
longetal.,diabetes,407-415(2010)描述了用于测量il-2r的信号传导途径中的stat5磷酸化的测定法。
hombachetal.,genetherapy1206-1213(2010)描述了用于使t细胞针对特定抗原的car，所述car在scfv和跨膜域之间含有经修饰的igg1fc间隔物，所述跨膜域与信号传导域附着(cd28-cd3ζ)。
发明目的
本发明的目的是提供用于治疗hvg病的嵌合抗原受体car，其适于为treg细胞提供对mhci类，特别是对hla-a*02或对car-sla-01*0401的抑制物活性，其足够强以抑制表达mhci类，例如hla-a*02或sla-01*0401的移植物的细胞毒性排斥，尤其是在hla-a*02阴性的接受体患者中。
发明详述
本发明通过权利要求的特征实现了该目的，尤其是通过提供融合蛋白进行，所述融合蛋白是嵌合抗原受体(car)，尤其是含有对人hla-a*02特异性的scfv域的car-a*02或含有对猪sla-01*0401特异性的scfv域的car-sla-01*0401，所述car-a*02或car-sla-01*0401用于治疗hvg病，例如用于治疗移植物接受体患者中的细胞毒性排斥反应。当car-a*02在人treg细胞中在人hla-a*02存在下表达时car-a*02提供细胞毒性t细胞的抑制。当在人treg细胞中表达时car-a*02和表达car-a*02的人treg细胞是用于治疗hvg病的药物化合物。相应地，当在人treg细胞中表达时car-sla-01*0401和表达car-sla-01*0401的人treg细胞是用于治疗hvg病的药物化合物，此时移植的组织是猪来源的并表达sla-01*0401。在移植接受体的treg细胞中表达后，car-sla-01*0401具有抑制针对猪来源的移植物的hvg的优点。猪来源的移植物可以是例如胰腺组织，优选是胰岛。
任选地，表达car-a*02或car-sla-01*0401的treg细胞经遗传操作以也表达foxp3，优选组成性表达foxp3，例如通过与导入编码car-a*02的核酸序列同时将编码人foxp3的表达盒导入treg细胞中。进一步任选地，除了为了表达foxp3的treg细胞的遗传操作之外或作为为了表达foxp3的treg细胞的遗传操作备选，在表达car-a*02或car-sla-01*0401之外还可以遗传操作treg细胞以表达胱天蛋白酶-9个二聚体系统(例如，如distasietal.,nengljmed1673-1683(2011)所述)，用于在转移到患者中后耗尽treg细胞。
foxp3分别与融合蛋白car-a*02或car-sla-01*0401的表达可以通过在一个统一的融合蛋白中表达p2a与c端融合的foxp3的融合物，例如直接与car-a*02或car-sla-01*0401的c端融合。此类融合物(例如由适于产生编码car-p2a-foxp3融合蛋白的一个统一mrna的一个表达盒编码)通过其从p2a域水解产生游离foxp3。p2a-foxp3的示例性融合物是seqidno:22，其可以直接与融合蛋白的hcd3ζ域的c端融合。
car-a*02或car-sla-01*0401分别是融合蛋白，所述融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域(scfv)、铰链、跨膜域、胞内hcd28信号传导域和胞内cd3信号传导域，也称为hcd3ζ(hcd3zeta)域，所述域优选地从n端到c端彼此直接连接。在scfv域中，抗体的可变轻链通过铰链区连接至抗体的可变重链。car-a*02的特征在于选自seqidno:1至seqidno:12中之一的氨基酸序列的其scfv域，cd8铰链和cd8跨膜域，优选具有seqidno:13的氨基酸序列，cd28信号传导域，优选具有seqidno:14的氨基酸序列，和cd3信号传导域，具有seqidno:15的氨基酸序列。car-sla-01*0401的特征在于选自seqidno:16至seqidno:19中之一的氨基酸序列的其scfv域。由于根据本发明的信号传导域具有人或人源化氨基酸序列，因此这在本文中也用“h”指示。铰链可以由hδfcigg域形成，优选地由seqidno:20形成。可以用cd8跨膜域、hcd28信号传导域和hcd3ζ信号传导域交换hcd28跨膜域、hcd28信号传导域和hcd3ζ信号传导域，优选seqidno:21的融合物。
car-a*02融合蛋白具有的优点在于它对hla-a*02是高度特异的。car-sla-01*0401融合蛋白具有的优点在于它对sla-01*0401是高度特异性的。其在tregs中的表达分别导致在hla-a*02或sla-01*0401存在下treg增殖的增强，并导致增加的teff(效应t细胞)抑制物活性。
融合蛋白car-a*02或car-sla-01*0401可以在treg中从表达盒中编码融合蛋白的核酸序列表达。任选地，编码融合蛋白car-a*02或car-sla-01*0401的表达盒包含在病毒载体中以导入核酸序列，例如，通过使用含有病毒载体的病毒颗粒进行转导。
对于体外产生表达car-a*02的treg细胞，优选使用源自移植物接受体的treg细胞，所述移植物接受体可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。treg细胞是cd4+，cd25高和cd127低，并且必须从hla-a*02阴性患者中分离，例如，通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用facs或具有特异性抗体的磁珠。对于体外产生表达car-sla-01*0401的treg细胞，优选使用源自移植物接受体的treg细胞，其可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。treg细胞是cd4+，cd25高和cd127低，并且必须分离，例如通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用facs或具有特异性抗体的磁珠。
表达car-a*02或car-sla-01*0401的treg细胞的优点在于在引入患者之前和分别在引入编码car-a*02或car-sla-01*0401的核酸序列之后，在将这些treg细胞导入患者中之前不必需体外扩增。例如，在生产这些treg细胞的过程中，不进行包括在培养基中在刺激剂的存在下培养这些treg细胞的体外扩增。优选地，在引入编码car-a*02或car-sla-01*0401的核酸序列后，将treg细胞保持培养约24小时以允许表达car-a*02或car-sla-01*0401，然后进行细胞分选以分离表达car-a*02或car-sla-01*0401的treg细胞。在该培养物中，培养基中不存在用于扩增的刺激剂，例如没有抗cd3或抗cd28抗体。在该培养物中，培养基含有低剂量的il-2，例如以50u/ml培养基，以防止treg细胞死亡。已经发现表达car-a*02或car-sla-01*0401的treg细胞有效迁移至移植物并且有效抑制针对移植物的细胞毒性应答并且表达car-a*02或car-sla-01*0401的treg细胞具有稳定的抑制活性。
car-a*02的scfv域对hla-a*02是非常特异的，并且迄今未发现交叉反应性或脱毒性。此外，没有发现car-a*02的内在活性或自身活化，排除了不依赖于hla-a*02存在的抑制活性。发现表达car-a*02的treg细胞的抑制活性明显高于幼稚treg(ntreg)细胞的抑制活性。
可以通过将car-a*02或car-sla-01*0401的编码序列在接触具有hla-a*02或sla-01*0401的供体前导入源自供体的treg细胞，或者在接触hla-a*02或sla-01*0401的供体后导入源自供体，例如源自移植后的移植物接受体的treg细胞中在用于产生在hla-a*02或sla-01*0401的存在下具有抑制活性的treg细胞的方法中使用car-a*02或car-sla-01*0401。
通常优选地，融合蛋白在其n端包含用于分泌融合蛋白的前导肽，以促进scfv域的跨膜转运和跨膜(tm)域在细胞膜间的排列。示例性前导序列是seqidno:24，优选用于car-a*02，或seqidno:25，优选用于car-sla-01*0401。
现在参考附图通过实施例更详细地描述本发明，其中
-图1a示意性显示了适用于treg细胞的逆转录病毒转导的编码根据本发明的car-a*02的核酸构建体，
-图1b显示了在细胞膜中排列的car-a*02的示意性模型，
-图1c显示facs结果，指示细胞表面上car-a*02和比较对照car的表达，
-图1d显示facs结果，指示经转导的treg表达car-a*02并特异性结合hla-a*02，
-图1e显示facs结果，指示用car-a*02转导的tregs不与hla-a*01结合，
-图1f显示了表面表达的facs结果和对照car对pe的特异性，
-图2a显示了未转导的treg细胞和表达car-a*02的treg细胞的ccr7,cd39,cd45ro,cd45ra,ctla-4的facs结果，
-图2b显示表达car-a*02的treg细胞和未转导的treg细胞的stat5磷酸化的facs结果，
-图2c显示了代表响应il-2浓度的stat5磷酸化的图，
-图3a显示响应刺激细胞的表达car-a*02的treg细胞活化的facs结果，
-图3b显示了响应特定刺激的表达car-a*02或对照car的treg细胞的增殖和cd39表达的facs结果，
-图3c显示了在不同细胞比率下表达car-a*02的treg细胞抑制t-效应细胞的图，*＝p<0.05，**＝p<0.01，
-图4a显示体内mlr中抑制物活性的结果，
-图4b显示了在treg细胞中使用car-a*02表达的动物移植实验的分析图，以及
-图4c显示了在treg细胞中使用car-a*02表达的动物移植实验的facs结果，
-图5a示意性显示了适合于treg细胞的逆转录病毒转导的编码根据本发明的car-sla-01*0401的核酸构建体，其含有与p2a-foxp3和另外的编码δlngfr作为报告肽的另外的ires的任选融合，
-图5b显示了在细胞膜中排列的car-sla-01*0401的示意性模型，
-图5c显示了用于car-sla-01*0401表面表达的sc-1细胞的facs结果，
-图5d显示用于用编码图5a的融合物的核酸构建体转导后表达foxp3的sc-1细胞的facs结果，
-图6显示用标记的可溶性scfv染色的人和猪pbmc的facs结果，
-图7显示了经转导以表达car-sla-01*0401的杂交瘤细胞的facs结果，分析了nfat信号传导。
通常，显示的facs结果代表三个独立实验。
实施例1：编码car-a*02的逆转录病毒载体和表达car-a*02的细胞
通过使用表达抗hla-a*02抗体的噬菌体展示文库的对hla-a*02的亲和选择产生car-a*02的scfv域。从输血后已经形成a*02反应性抗体的患者克隆抗hla-a*02(在ebi可获得的重链核苷酸序列：af163303；轻链：af163304)。
因此，与初始克隆的抗hla-a*02抗体相比，可以分离出对hla-a*02具有显著增加的亲和力的抗体。
克隆scfv域的编码序列以产生一个融合蛋白的编码序列，其从n端至c端含有可变轻链、接头、可变重链、hcd8铰链域、hcd6跨膜域、hcd28胞内信号传导域和hcd3ζ胞内信号传导域。将编码序列克隆到逆转录病毒载体的5'-ltr和3'-ltr之间，其在car-a*02的此编码序列和3'-ltr之间另外含有在充当启动子的ires(内部核糖体进入位点)元件的控制下作为报告物蛋白的非信号转导表面分子δlngfr(截短的低亲和力神经生长因子)的编码序列。除了其作为表达car-a*02的报告物的功能外，此类报告物还可用于分离经转导的细胞，例如通过使用对报告物特异性并与载体，例如与磁珠偶联的抗体的亲和分离。
为了转导，将编码car-a*02的核酸序列克隆到γ-逆转录病毒ltr驱动的表达载体中。
使用抗cd271抗体(c40-1457，bectondickinson)通过流式细胞术检测报告物δlngfr。
为了引入编码car-a*02的核酸序列，在逆转录病毒载体中含有报告物，例如δlngfr，产生含有载体的病毒颗粒，如gallaetal.,nuc.ac.res.39,1721-1731(2009)所描述。在分离认为是ntreg细胞的treg细胞后，用平板结合的抗cd3抗体(okt-3,5μg/ml)和完全培养基中的可溶性抗cd28抗体(cd28.2，从biolegend获得，5μg/ml)刺激这些达48小时。在转导之前，将硫酸鱼精蛋白(4μg/ml，从sigma获得)加入treg培养物中。用编码car-a*02或对pe特异性的对照car的逆转录病毒颗粒在31℃以700xg旋转感染treg细胞1.5小时。
在用对照car的表达载体转导后，sc-1细胞可以通过抗cd271抗体对δlngfr进行免疫染色，并使用抗-igg-fab(从jacksonlab获得)对scfv染色，证明对照car的表面表达和对照car对pe的识别。尽管sc-1细胞不表达foxp3或b220，但它们用缀合有pe的抗体染色呈阳性。
用以下抗体组合使用facs从人pbmc分离人treg细胞：抗cd8(hit8a，从biolegend获得)、抗cd4(rpa-t4，从bectondickinson获得)、抗cd25(m-a251，从bectondickinson获得)、抗-cd127(hil-7r-m21，从bectondickinson获得)，导致以至少90％的纯度分离cd8-cd4+c25高、cd8-cd4+c25高cd127低treg。在伦理批准和个人书面知情同意后，自不同hla分型健康供体通过ficoll-paqueplus(从gehealthcare获得)上的密度梯度离心产生pbmc制备物。
如gallaetal.,nuc.ac.res.39,1721-1731(2009)所述转导treg细胞。
通常，所有t细胞培养物和所有t细胞相关测定法都在37℃和5％co2的潮湿培养箱中在完全培养基(rpmi1640glutamax-i(从gibco获得)，补充有10％胎牛血清(fbs)(从gibco获得)、1％青霉素和链霉素(从biochrom获得)、0.05mmβ-巯基乙醇(从gibco获得)、20mmhepes(从gibco获得)、1％丙酮酸钠(从gibco获得)和500iu/mlil-2(proleukin，从novartis获得)中进行。对于支原体，对所有细胞系测试呈阴性。
图1a显示了car-a*02的核酸构建体的排列，包含在ires元件控制下的报告物δlngfr的编码序列，侧翼有γ-逆转录病毒载体的5'-ltr和3'-ltr。通常，treg细胞中膜结合蛋白的表达(例如在与car-a*02的编码序列连接的ires的控制下，优选在病毒载体中)可以通过针对膜结合蛋白的亲和分离用于分离经遗传操作的treg细胞。此类膜结合蛋白的一个例子是δlngfr。
图1b显示了car-a*02的模型，所述car-a*02具有其跨越细胞膜的跨膜域和外细胞表面上排列的scfv和胞质溶胶内排列的胞内信号传导域。
使用杂交瘤细胞的转导测试细胞表面上融合蛋白的膜锚定表达。简言之，用编码car-a*02或阴性对照融合蛋白的逆转录病毒载体转导杂交瘤细胞。通过与各种hla-a*02阳性或hla-a*02阴性人pbmc(外周血单个核细胞)接触来刺激经转导的杂交瘤细胞。与经转导的杂交瘤细胞共培养20小时并照射(30gy)。对于δlngfr的特异性染色，使用抗cd271抗体c40-1457(从bectondickinson获得)，对于car-a*02的特异性染色，使用单克隆抗体(mab)抗-igg-f(ab)(从jacksonlabs获得)。通常使用流式细胞仪facscalibur(bectondickinson)或lsrii(bectondickinson)使用facsdiva软件和flowjo软件(treestarinc.)通过流式细胞术进行分析。对于统计分析，使用graphpadprism5.0版。
图1c显示了初始杂交瘤细胞(未转导的)中经转导的杂交瘤细胞表面上的报告物δlngfr的表达和定位，仅对δlngfr(对照car)染色，以及对car-a*02(a2-car)染色。结果显示报告物δlngfr和car-a*02两者均在经转导的杂交瘤细胞的表面上表达。
通过逆转录病毒载体转导从hla-a2*阴性的人(hla-a*02阴性供体)分离的treg细胞(cd4+cd25高cd127低)以表达car-a*02和报告物δlngfr。为了染色，使用展示丙型肝炎病毒肽的hlai四聚体(hla-a1-cmv五聚体，从proimmune以pp65获得)。
图1d的facs结果显示经转导的细胞用hlaa*0201(a*0201，从beckmancoulterimmunomics，sandiego，usa获得)四聚体染色。
图1e的facs结果显示经转导以表达car-a*02和报告物δlngfr的来自hla-a2*阳性的人(hla-a*02阳性供体)的treg细胞不用a*01四聚体染色。
图1的结果显示car-a*02在经转导的treg细胞的表面上表达，并且它特异性识别hla-a*02四聚体，例如，不识别hla-a*01四聚体。此外，发现a*02四聚体的特异性染色不依赖于与a*02四聚体结合的肽。
作为阴性对照car，在相同表达载体中编码含有对藻红蛋白(pe)特异性的scfv替换对hla-a*02特异性的scfv，但在其他方面相同的融合蛋白。为了确定对照car的表面表达和特异性，根据noyanetal.,cancergenetherapy19,352-357(2012)转导sc-1细胞，对鼠白血病病毒缺乏宿主范围限制的胎儿小鼠胚胎细胞(atcccrl-1404)。使用用于胞内foxp3染色的ebiosciencefix/perm试剂盒，根据制造商的用法说明，通过使用几种缀合有pe的蛋白质和缀合有pe的抗体评估对照car对藻红蛋白(pe)的特异性：鼠b220-pe(ra3-6b2，从caltag获得)，鼠foxp3-pe和鼠foxp3-pacblue(fjk-16s，从ebioscience获得)。
图1f的facs结果显示阴性对照car在细胞表面上表达并且识别pe。
使用从hla-a*02阴性供体获得的treg细胞分析表达car-a*02的treg细胞的表型，以防止转导后treg细胞自身激活car-a*02。此种情况接近hla-a*02阴性接受体中的情况。发现转导确实基本上不影响ntreg表型，在经car-a*02转导的treg细胞和未转导的ntreg细胞中显示相似水平的效应分子ctla-4和cd39，并且需要相似百分比的cd45ra+幼稚treg细胞和相似的ccr7表达以将细胞归巢至次级淋巴样器官。对于染色，使用抗体抗cd39(a1，从biolegend获得)、抗cd45ra(hi100，从bectondickinson获得)、抗cd45ro(uchl1，从biolegend获得)、抗ccr7(3d12，从bectondickinson获得)、抗-ctla-4(bni3，从bectondickinson获得)、抗foxp3(pch101，从ebioscience获得)。图2a显示了这些facs结果。对于用pe特异性对照car转导的treg细胞，发现相同的表型。
对于来自相同实验的用car-a*02转导的treg细胞和非转导的ntreg，以il-2的不同剂量，使用facs(如longetal.,diabetes,407-415(2010)中描述的方法，使用从bectondickinson获得的抗pstat5抗体(py694,47/sat5))测量stat5磷酸化。图2b中描绘了facs结果，显示了这两种treg细胞都已经在培养物中ntreg存活所必需的低剂量il-2下显示高水平的stat5磷酸化。与未转导的细胞相比，用car-a*02转导的treg细胞显示更高的基线和略高的最大stat5磷酸化水平。图2c的图比较了与il-2剂量相关的stat5磷酸化水平。没有观察到il-2信号传导的缺陷。这些结果显示转导treg细胞以表达car-a*02不显著影响stat5磷酸化，指示这些转导细胞的归巢能力没有受损。
为了分析经car-a*02转导的细胞的功能，用car-a*02转导稳定表达含有nfat敏感性il-2启动子以控制gfp表达的报告物构建体的t细胞杂交瘤。为了在facs分析中检测car表达，检测报告物δlngfr，以gfp(绿色荧光蛋白)的表达检测nfat刺激。
如图3a所示，发现经car-a*02转导的细胞(a2-car)在转导后未显示任何nfat活化，也未显示gfp的相关表达，但nfat活化和gfp表达通过与充当刺激细胞的hla-a*02+pbmc共培养但不响应hla-a*02-pbmc而强烈上调。非转导的(未转导的)t细胞杂交瘤和用δlngfr(对照car)转导的细胞未显示对hla-a*02阳性和hla-a*02阴性pbmc刺激细胞的反应。此结果指示根据本发明的car-a*02具有激活nfat所必需的信号转导的能力。由于杂交瘤不表达任何内源性t细胞受体(tcr)，观察到的信号转导完全由car-a*02的信号传导引起。
当用car-a*02转导hla-a*02阴性供体treg细胞时，区分通过car或通过tcr的信号传导将更加困难，这是因为这些ntreg细胞中的8-12％将具有也识别hla-a*02的tcr。因此，使用在含有报告物构建体的t细胞杂交瘤中的表达，针对呈现各种mhci和mhcii等位基因的广泛的人pbmc组测试car-a*02。通过流式细胞术分析gfp表达。结果显示，在杂交瘤中表达后，car-a*02(hla-a2car)识别所有hla-a*02阳性供体样品，而没有与hla-a*02阴性血液样品的任何交叉反应性。为了比较，使用对pe特异性的对照car(无关car)。结果总结在下表中，其中对于编号的样品(人pbmc)在每行中指示单独的hla-a和hla-b，并且x表示gfp表达：
在与血液样品共培养后表达对照car的杂交瘤细胞对于任何hla不表达gfp(-)。这证明了根据本发明的car-a*02对hla-a*02的高特异性，显示出低的或缺乏的非特异性或脱靶活性。
使用hla-a*02阳性pbmc作为刺激细胞测试当根据本发明的car-a*02在人hla-a*02阴性treg细胞中表达时激活它的效果。基于cfse稀释测定法分析表达car-a*02的treg细胞的增殖，对于cfse稀释测定法，treg细胞用cfse(5mm，从invitrogen获得)标记。对于表达car-a*02的hla-a*02阴性treg细胞，通过与经辐照的(30gy)hla-a*02阳性pbmc(刺激细胞)共培养使用多克隆刺激，所述hla-a*02阳性pbmc也与5mmapc细胞增殖染料(efluor670，从ebioscience获得)以1:4比率接触。对于经转导以表达对照car(对pe特异性)的人hla-a*02阴性treg细胞，通过针对tcr的抗cd3/抗cd28进行刺激。对于treg活化测量使用抗cd39抗体(a1，biolegend)的cd39检测，并且对于增殖检测cfse。为了比较，进行增殖细胞的cfse稀释的facs分析。图3b中描绘了facs结果，显示了car-a*02被hla-a*02阳性pbmc强烈激活，导致强烈增殖和cd39效应分子的上调。此效果比在表达对照car的活化treg细胞中强得多。表达对照car的treg细胞可能经由其异种特异性tcr激活，因为这在所有ntreg细胞的高达12％上找到。在使用作用于tcr的抗cd3和抗cd28抗体的组合激活后也发现cd39的上调。这些数据指示，表达根据本发明的car-a*02的treg细胞可以经由car-a*02或经由tcr同样良好地激活。
假定在转移到患者中后表达根据本发明的car-a*02的treg细胞的高增殖能力支持它们的效应，例如，它们的小生境填充(nichefilling)能力。
实施例2：体外car-a*02的抑制物活性
通过测定针对hla-a*02阳性cd1c刺激物细胞的同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)的抑制来测试表达实施例1的car-a*02的treg细胞的抑制物活性。应答细胞是cfse标记的(5mm)分离的cd4+cd25-效应t细胞，其在各种比率的同基因hla-a1cd4+cd25+cd127低treg(ntreg)细胞或表达car-a*02的同基因treg细胞存在下与分离的hla-a*02cd1c+细胞共培养5天。经由cfse稀释测定法，基于treg/teff比率计算同基因效应t细胞增殖的抑制。为了比较，使用来自相同转导实验的未转导的ntreg细胞。
图3c中描绘了结果，显示了与未转导的treg细胞(ntregs)相比，表达car-a*02的treg细胞(a2-cartregs)有力得多地抑制异种特异性效应t细胞的增殖。表达car-a*02的treg细胞在测试的表达car-a*02的treg/效应t细胞的几乎所有比率都是更有力的抑制物。即使表达car-a*02的treg/效应t细胞的比率(比率treg/teff)为1:64，也观察到超过60％的抑制，证明由car-a*02融合蛋白赋予的强烈的抑制活性。
为了分析通过car-a*02在treg细胞中的信号传导的后果，通过在非活化的且表达car-a*02的treg细胞中的深度测序制备包含1149个基因的转录物组分析，并且与对非转导的treg细胞获得的结果比较。表达car-a*02的treg细胞(cd4+cd25高cd127低)用经照射的(30gy)hla-a*02+pbmc作为刺激细胞通过共培养36小时活化。作为对照，未转导的treg细胞未经处理或经由它们的tcr通过组合的抗cd3/抗cd28抗体刺激48小时。刺激后，使用microrneasy试剂盒(从qiagen获得)分离rna，在agilenttechnologies2100生物分析仪上测量总rna的质量和完整性。使用truseqrna样品制备试剂盒v2(从illumina获得)进行mrna纯化，然后使用scriptseqv2rnaseq文库制备试剂盒(从epicenter获得)根据制造商的方案从100ng总rna产生rna测序文库。使用truseqsbs试剂盒v3-hs(50个循环，单端运行)在illuminahiseq2500装置上以每个rna样品的3x107个读出的平均值对文库进行测序。使用具有默认设置的开源短读段比对器star将读出与参考基因组hg19比对。比对后每个基因的读出通过称为rsubread的r包的feature.count函数完成。对于原始计数数据的log2转换，随后是差异表达基因的数据标准化和统计确定，使用称为edger的r包。
发现经car-a*02转导的treg细胞和未转导的treg细胞具有非常相似的活化和下调转录物模式，支持经由car-a*02的信号传导与经由tcr的信号传导导致treg细胞中的相当的转录概况。与未激活状态相比，car-a*02或tcr的激活分别导致转录概况的急剧变化，但这两种激活状态的转录概况彼此相似。对涉及treg细胞功能及其归巢的特定基因的分析揭示了细微的差异。car-a*02活化的treg细胞表达更高量的il-4，il-5和il-10，但是略低的ctla4和il-2r转录物数目。这些降低的转录物水平对ctla4蛋白表达没有明显的后果(图2a)，也没有il-2信号传导的明显后果(图2b，2c)。
实施例3：体内car-a*02的抑制物活性
作为体内抑制物活性的实例，非重构(non-reconstituted)的人源化非肥胖糖尿病(nod)-rag1无效il2γ无效(nrg)小鼠接受5x104个来自hla-a*02阴性供体的cd4+cd25+cd127低人treg细胞(所述treg细胞用编码根据实施例1的car-a*02的逆转录病毒载体转导)或用实施例1的对照car(对pe特异性)转导的相同treg细胞或未转导的treg细胞。作为移植组织的实例，用混合的5x105个经照射的同基因hla-a*01pbmc和同种异体经照射的hla-a*02pbmc作为体外mlr对小鼠注射到每个耳廓中。
这些实验以盲法方式进行。为了确定抑制物活性，使用弹簧加载的数字测厚仪(thicknessgauge)测量耳肿胀。图5a显示了耳肿胀的结果，以注射前和注射后24小时的耳厚度之间的差异计算，每个值与作为内部对照的尚未用treg细胞注射的动物的另一只耳中观察到的耳肿胀相关。
图5a中描绘了结果，显示与表达对照car的treg细胞(对照cartregs)相比和与未转导的tregs(cd4+cd25高tregs)相比，对表达car-a*02的treg细胞(a2-cartregs)的同种异体混合淋巴细胞反应的显著更强的抑制。
在另一个实验中，在免疫重构的nrg小鼠中分析抑制物活性。目前，在此类小鼠中测试移植物排斥是困难的，因为在免疫活性小鼠中，同种异体皮肤移植物在10天内被排斥，而人源化nrg小鼠中的类似排斥在移植后第30天未发生。在此晚期时间点，异种移植物抗宿主应答在免疫重建后已经变得明显。为了避免除gvhd反应之外的其他作用，使用严格的排斥模型，其中同种异体移植的细胞到通过注射的移植后的第5天被完全排斥。使用注射的同种异体移植细胞具有额外的优点，即由于免疫应答在脾中开始，将treg细胞归巢至移植组织不应起主要作用，因此避免了人源化小鼠中受扰乱的归巢的可能效应。
作为treg细胞，使用用根据实施例1的car-a*02转导的cd4+cd25+cd127低人treg细胞，或用实施例1的对照car(对pe特异性)转导的相同treg细胞，或未转导的treg细胞。在通过在来自下颌骨静脉的外周血样品中表达人cd8和人cd4重建后14小时，通过facs监测免疫重建。从实验中排除没有可察觉的人cd8和cd4t细胞重建的动物。免疫重建后第14天，给小鼠静脉内注射5x105个用cfse标记的同基因pbmc和5x105个用apc增殖染料标记的hla-a*02pbmc作为同种异体阳性靶细胞。同时，不同的动物接受5x104的不同treg细胞，其是表达car-a*02(加a2-cartregs)或对照car(加对照cartregs)或未转导(加ntregs)的treg。注射后5天，处死小鼠并分析血液和脾细胞的同种异体靶物和同基因供体细胞，并与未接受treg细胞的动物(无添加的tregs)中获得的那些进行比较。同基因和同种异体细胞的标记允许评估动物中同种异体靶细胞的相对杀伤，因为这两种细胞群均以1:1的细胞比率注射。
图5c中描绘了代表性的facs结果，显示在免疫活性小鼠中，移植后120小时不再检测到同种异体靶细胞，这对应于非人源化小鼠中同种异体组织的快速排斥。注射表达对照car的treg或未转导的treg在预防同种异体靶细胞的杀伤方面具有小的效应，表达car-a*02的treg细胞的转移完全阻止了同种异体靶细胞的排斥。
实施例4：car-sla-01*0401的表达
含有对猪sla-01*0401具有特异性的scfv的融合蛋白car-sla-01*0401从根据图5a的核酸构建体表达，所述核酸构建体从5'至3'编码彼此相邻的用于分泌的前导肽(seqidno:25)、对mhci类特异性的scfv、作为优选铰链的hδfcigg域、作为跨膜域的hcd28tm域、hcd28、hcd3ζ、p2a、foxp3、ires和作为报告物的δlngfr。其中，将p2a排列成使得表达后，foxp3被切除并且可以移位到核中。scfv和铰链形成胞外(ec)部分，tm域形成跨膜部分，并且hcd28和hcd3ζ以及任选的p2a和foxp3形成胞内(ic)部分。此外，报告物δlngfr是胞内的。从相同的核酸构建体表达报告物，指示其存在，但作为单独的蛋白质存在。
图5b在模型中显示了car-sla-01*0401的排列，所述car-sla-01*0401具有其跨越细胞膜的跨膜域和在外细胞表面上排列的scfv和在细胞质内排列的胞内信号传导域。
用核酸构建体分开转导sc1细胞，所述核酸构建体编码根据图5a的融合蛋白：前导物、scfv、seqidno:20的hδfcigg域、hcd28tm域、与其融合的hcd28信号传导域和与其融合的hcd3ζ，序列为seqidno:21(thehcd28tmdomainfusedtothehcd28signallingdomainandfusedtohcd3ζofseqidno:21)、任选的seqidno:22的p2a-hfoxp3。seqidno:23的报告物δlngfr由ires(内部核糖体进入位点)转录。scfv是选自seqidno:16至seqidno:19中的一种，对猪sla-01*0401具有特异性。
用于染色供比较用的非转导细胞(未转导)和表达含有seqidno:17的scfve4(sla-01*0401e4)、seqidno:19的scfvh7(sla-01*0401h7)或seqidno:16的scfvc5(sla-01*0401c5)的car-sla-01*0401的经转导的细胞的facs结果在具有对报告物δlngfr的染色和用抗igg-fab的染色的图5c中显示以及在具有对foxp3染色和用抗igg-fab染色的图5d中。结果显示由hδfcigg域形成的铰链的表面表达和报告物的同时表达以及foxp3的同时表达，证明融合蛋白位于细胞膜上，其中胞外域在外部而信号传导域在内部。
使用e4(seqidno:17)、h7(seqidno:19)、c5(seqidno:16)和f11(seqidno:18)的可溶性scfv抗体测试car-sla-01*0401与人细胞的交叉反应性。可溶性scfv含有序列中未给出的另外的c端his6-标签。
图6显示了与标记的scfv温育后，人pbmc和猪pbmc的facs结果。结果显示没有scfv与人pbmc的交叉反应性和用每种scfv对猪pbmc的标记。
为了分析car-sla-01*0401转导细胞的功能，用car-sla-01*0401转导稳定表达含有nfat敏感性il-2启动子以控制gfp表达的报告物构建体的t细胞杂交瘤。为了在facs分析中检测car表达，检测报告物δlngfr，以gfp(绿色荧光蛋白)的表达检测nfat刺激。
如图7所示，发现含有scfv域e4、h7、f11或c5的经car-sla-01*0401转导的细胞在转导后未显示任何nfat活化或相关的gfp表达，但是通过与充当刺激细胞的猪pbmc共培养强烈上调nfat活化和gfp表达(但不响应人pbmc)。该结果显示了根据本发明的car-sla-01*0401具有在猪细胞存在下激活nfat所必需的信号转导的能力。由于杂交瘤不表达任何内源t细胞受体(tcr)，观察到的信号转导完全由car-sla-01*0401的信号传导引起。
实施例5：体内car-sla-01*0401的抑制物活性
作为固体同种异体移植物组织的实例，将猪胰岛细胞移植到作为接受体的小鼠中。在临床前模型中研究同种异体或异种胰岛功能的最常用方法是在胰岛移植入高血糖人源化小鼠后监测血糖水平。目前，用链佐星(streptozozocin，stz)处理动物，通过破坏产生胰岛素的胰岛细胞使小鼠变为高血糖。对那些高血糖小鼠在肾被膜下移植分离的成年猪胰岛，以替换破坏的鼠胰岛细胞。移植后14天，在具有另外的和没有另外的(对照组)经转导以表达car-sla-01*0401的猪treg细胞的情况下，用人pbmc(对于猪胰岛异种)重建动物。通过实验动物的血糖水平监测胰岛功能和细胞存活力。将那些数据与来自实验最后阶段的外植肾的免疫荧光数据进行比较，以探索cartregs在胰岛细胞簇中的积累。
序列表
<110>汉诺威医学院
布伦瑞克工业大学
<120>在治疗hvg病中使用的融合蛋白
<130>m1067pct
<150>ep16177208.2
<151>2016-06-30
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thrlysleuthrvalleu
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<213>人工序列
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<221>链
<222>1..123
<223>可变重链
<220>
<223>scfv(sh1319-d8)
<220>
<221>链
<222>124..141
<223>接头
<220>
<221>链
<222>142..248
<223>可变轻链
<400>8
glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser
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tyrglnglnlysproglylysvalprolysleuleuiletyralaala
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glythraspphethrleuthrileserserleuglnprogluaspval
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alathrtyrtyrcysglnlystyrasnseralaproargthrphegly
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glnglythrlysvalgluilelys
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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<223>可变重链
<220>
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<220>
<221>链
<222>123..140
<223>接头
<220>
<221>链
<222>141..250
<223>可变轻链
<400>9
glnvalglnleuglnglnserglyproglyleuleulysprosergln
151015
thrleuserleuthrcysalavalserglyaspservalserthrasn
202530
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<221>链
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<223>接头
<220>
<221>链
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<223>可变轻链
<400>10
gluvalglnleuvalgluserglyalagluvallyslysproglyser
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glyglyglythrlysleuthrvalleu
245
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<212>prt
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<220>
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<223>可变重链
<220>
<223>scfv(sh1319-f6)
<220>
<221>链
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<220>
<221>链
<222>142..252
<223>可变轻链
<400>11
glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
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202530
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100105110
glyglnglythrleuvalthrvalserserglyseralaseralapro
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lysleuglugluglyglupheserglualaargvalglnalaglyleu
130135140
thrglnproproservalserglyalaproglyglnargvalthrile
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sercysthrglyserserserasnileglyalaalatyraspvalhis
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trptyrglnglnleuproglyalaalaprolysleuleuilephegly
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aspserasnargproserglyvalproaspargpheserglyserlys
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argvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>链
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<223>可变重链
<220>
<223>scfv(sh1319-g3)
<220>
<221>链
<222>124..141
<223>接头
<220>
<221>链
<222>142..251
<223>可变轻链
<400>12
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasphis
202530
tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
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lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
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leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
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100105110
trpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyseralaserala
115120125
prolysleuglugluglyglupheserglualaargvalleuproval
130135140
leuthrglnproproseralaserglythrproglyglnargvalthr
145150155160
ilesercysserglyserserserasnileglyserasnprovalhis
165170175
trptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuvaltyrarg
180185190
asnasnglnargproserglyvalproaspargpheserglyserlys
195200205
serglythrseralaserleualaileserglyleuargsergluasp
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phevalprovalpheleuproalalysprothrthrthrproalapro
151015
argproprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleu
202530
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505560
cysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasnhis
65707580
arg
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<212>prt
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trpvalargserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasn
151015
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202530
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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<400>15
argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly
151015
glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr
202530
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asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg
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argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala
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ser
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<212>prt
<213>人工序列
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ilelysgluglulysleuthrmetlystyrleuleuprothralaala
151015
alaglyleuleuleuleualaalaglnproalametalaglnvalgln
202530
leuglngluserglyglyglyvalileglnproglyargserleuarg
354045
leusercysalaalaserglyphethrpheserglyhisglyphehis
505560
trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalalavalile
65707580
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859095
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100105110
asnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalaargasp
115120125
leusertyrtyralametaspvalargglyglnglythrthrvalthr
130135140
valserserglyseralaseralaprolysleuglugluglygluphe
145150155160
serglualaargvalglnthrvalvalthrglngluproserleuthr
165170175
valserproglyglythrvalthrleuthrcysalaserserthrgly
180185190
alavalthrserglytyrtyrproasntrppheglnglnlysprogly
195200205
glnalaproargalaleuiletyrserthrserasnlyshissertrp
210215220
thrproalaargpheserglyserleuleuglyglylysalaalaleu
225230235240
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leutyrtyrglyglyalaargvalpheglyglyglythrlysleuthr
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290295300
leuser
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<211>315
<212>prt
<213>人工序列
<220>
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ilelysgluglulysleuthrmetlystyrleuleuprothralaala
151015
alaglyleuleuleuleualaalaglnproalametalaglnmetgln
202530
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354045
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505560
trpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyglyile
65707580
ileproilepheglythralaasptyralaglnlyspheglnglyarg
859095
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glnglythrthrvalthrvalserserglyseralaseralaprolys
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leuglugluglyglupheserglualaargvalglnalavalleuthr
165170175
glnproproservalserglyalaproglyglnargvalthrileser
180185190
cysthrglyserserserasnileglyalaglytyraspvalhistrp
195200205
tyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuiletyrglyasn
210215220
serasnargproserglyvalproaspargpheserglyserlysphe
225230235240
glythrseralaserleualailethrglyleuglnalagluaspglu
245250255
alaasptyrtyrcysglnserpheaspthrserleuserglyserlys
260265270
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275280285
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290295300
gluglnlysleuileserglugluaspleuser
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<212>prt
<213>人工序列
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151015
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202530
valvalglnproglyargserleuargleusercysalaalasergly
354045
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505560
lysglyleuglutrpvalalavalilesertyraspglyargasnval
65707580
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859095
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seralaleutyrtyrcysvallysaspleualaargvalvalilethr
115120125
proglyglymethisvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalser
130135140
serglyseralaphealaprolysleuglugluglyglupheserglu
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alaargvalglnalavalvalthrglngluproserleuservalser
165170175
proglyglythrvalthrleuthrcysalaserserthrglythrval
180185190
thrglyalaserserproasntrppheglnglnlysproglyglnval
195200205
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210215220
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aspleuser
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<212>prt
<213>人工序列
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<223>scfv(h7)
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lysgluglulysleuthrmetlystyrleuleuprothralaalaala
151015
glyleuleuleuleualaalaglnproalametalaglnvalglnleu
202530
valglnserglyglyglyvalvalglnproglyargserleuargleu
354045
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65707580
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859095
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180185190
serargserasnileglyproasntyrvalhistrptyrglnglnleu
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210215220
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225230235240
serleualaileserglyleuargsergluaspglualavaltyrtyr
245250255
cysalasertrpaspaspthrleuglyalavalvalpheglyglygly
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thrlysleuthrvalleuglyglnprolysalaalaproservalthr
275280285
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305310
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>hδfcigg域
<400>20
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202530
prothrglyleutyrthrhisserglyglucyscyslysalacysasn
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505560
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65707580
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leuargglucysthrargtrpalaaspalaglucysglugluilepro
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glyargtrpilethrargserthrproprogluglyseraspserthr
195200205
alaproserthrglngluproglualaproprogluglnaspleuile
210215220
alaserthrvalalaglyvalvalthrthrvalmetglysersergln
225230235240
provalvalthrargglythrthraspasnleuileprovaltyrcys
245250255
serileleualaalavalvalvalglyleuvalalatyrilealaphe
260265270
lysargtrpasnargglyileleu
275280
<210>21
<211>184
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>hcd28跨膜域-hcd3zeta信号传导域
<400>21
aspprolysphetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacys
151015
tyrserleuleuvalthrvalalapheileilephetrpvalargser
202530
lysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproarg
354045
argproglyprothrarglyshistyrglnalatyralaalaalaarg
505560
aspphealaalatyrargserleuargvallyspheserargserala
65707580
aspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleu
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asnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargarggly
100105110
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130135140
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leutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleu
165170175
hismetglnalaleuproproarg
180
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<211>452
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>融合p2ahfoxp3
<400>22
glyalathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspvalgluglu
151015
asnproglyprosermetproasnproargproglylysproserala
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