优先发表1 263例肺部结节术中冰冻病理诊断分析
肺癌是世界范围内高发恶性肿瘤之一[]，随着胸部计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查在日常医疗诊疗过程中的应用，以及我国居民健康体检意识的增强，越来越多的无症状肺部磨玻璃结节（ground-glass nodules，GGN）和有症状的肺部肿瘤被发现。肺部肿瘤的术前诊断方法包括有：经纤维支气管镜肺活检、CT引导下经皮肺穿刺等，但术前穿刺具有一定的局限性，活检组织可能无法很好地显示出肿瘤的主要特点，病理诊断困难。因此，肺部肿瘤的冰冻送检率很高，术中快速冰冻病理诊断成为一项很重要的工作。
由于术中冰冻检查对病变良恶性的判断影响外科医师对手术方式的选择，但术中冰冻检查具有其局限性，如何避免对患者造成过度治疗或治疗不足是对临床医生及病理医生共同的考验，Toshiyuki等[]在其研究中探讨了避免对术中诊断为原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）的病例造成过度治疗的可行性，陈金平等[]分析了肺原发性良性黏液上皮性病变冰冻误诊为黏液腺癌的主要原因。提高术中冰冻病理诊断的准确率极为重要，本文通过对我院1 263例肺部结节术中冰冻诊断情况进行分析，探讨冰冻误诊的主要原因，提高日后冰冻诊断的准确性。
收集首都医科大学附属北京朝阳医院病理科2021年1月—2022年1月期间肺部结节病例的术中诊断结果及术后石蜡诊断结果，按照纳入标准共1 178例患者的1 263例冰冻病理结果纳入研究，其中男475例、女703例，平均年龄58.7（23～86）岁。纳入标准：（1）手术过程中送检术中冰冻病理检查；（2）冰冻制片成功；（3）手术切除标本经过充分固定、取材；（4）术后石蜡病理诊断明确。排除了术后病理诊断不明确、有争议的病例。
冰冻对照及冰冻剩余标本经10%中性福尔马林充分固定，常规脱水，石蜡包埋，制片，HE染色。免疫组织化学染色采用EnVision两步法，按照试剂盒说明书进行操作。免疫组织化学抗体包括p40、p63、CK5/6、EMA、CKpan，其中p40抗体购自罗氏公司，CKpan购自中杉公司，p63、CK5/6及EMA抗体购自迈新生物技术有限公司。特殊染色弹力纤维染色试剂购自贝索公司，网织纤维染色试剂购自罗氏公司。由两名高年资病理医师重新阅片，将1 263例冰冻切片与术后石蜡切片进行比对，并结合术后石蜡组织的免疫组织化学染色及特殊染色结果，以冰冻对照、冰冻剩余及术后切除标本的石蜡切片染色结果为金标准，分析术中冰冻切片误诊病例的主要原因，总结容易误诊病例的类型与在冰冻中鉴别诊断的要点及难点。
本研究已通过首都医科大学附属北京朝阳医院医学伦理审查委员会审批，审查编号：2021-科-614。
1 263例冰冻送检的肺部病变中，主要为肿瘤性病变，其中恶性肿瘤以浸润性腺癌最多见（524例，41.49%），其次分别为AIS（292例，23.12%）、微浸润性腺癌（minimally invasive adenocarcinoma，MIA，191例，15.12%）、鳞状细胞癌（38例，3.01%）、粘液腺癌（20例，1.58%）、高级别神经内分泌癌（14例，1.11%）、粘液型AIS（3例，0.24%）等。良性肿瘤性病变最常见的为错构瘤（23例，1.82%），其次分别为硬化性肺细胞瘤（7例，0.55%）、细支气管腺瘤（3例，0.24%）、乳头状腺瘤（1例，0.08%）。在非肿瘤性病变当中，常见病变分别为局灶纤维组织增生伴玻璃样变性（21例，1.66）、结核（13例，1.03%）、其它肉芽肿性炎（12例，0.95%）、IgG4相关性疾病（3例，0.24%）等。
冰冻诊断正确率为95.65%，误诊率为4.35%，冰冻误诊病例55例，依次为：浸润性腺癌18例（3.44%）、AIS 17例（5.82%）、粘液腺癌7例（35.00%）、MIA 4例（2.09%）、IgG4相关性疾病3例（100.00%）、粘液型AIS 2例（66.67%）、非典型腺瘤样增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）1例（16.67%）、硬化性肺细胞瘤1例（14.29%）、细支气管腺瘤1例（33.33%）、乳头状腺瘤1例（100.00%）。详细病种构成及误诊构成比见。误诊病例冰冻切片结果与术后石蜡结果见，各误诊原因所占比例见。
术中快速冰冻诊断已成为一项成熟的病理科技术，与普通病理诊断不同的是，术中病理诊断主要目的是回答指导手术方式所需的具体问题，如：（1）决定病变性质；（2）确定手术切缘是否切净，在肺部恶性肿瘤中主要是判定支气管断端是否切净；（3）确定淋巴结有无癌转移等。在肺脏肿瘤中，对于非小细胞肺癌，外科医生主要选择肺叶切除和（或）淋巴结清扫，对于AIS或MIA，可以选择更为局限的手术方式，如肺楔形切除、亚肺段切除或肺段切除，无需淋巴结清扫[-]，因此在冰冻切片中做出正确诊断非常重要。
在此次研究中，我们共收集了1 263例因CT报告胸部阴影或肺部结节送检术中冰冻病例，对比最终的术后常规石蜡病理报告结果，冰冻诊断正确率为95.65%，误诊率为4.35%，分析如下。
（1）冰冻切片过厚，不利于对送检组织的细胞形态进行仔细观察，所以对于不同的组织应调节冰冻切片机的温度，保证切出厚薄最佳的组织薄片。
（2）组织褶皱增加读片难度，当冰冻切片中判别关键区域的组织有皱褶时应及时与技师沟通，重新切片。
（3）产生冰晶，冰冻破坏细胞膜和其它结构致使组织发生永久性变化，冰晶的产生属于一种人工假象，细胞核看起来更大，多形性更加明显，容易造成过诊断；见。诊断医师因考虑冰冻制片过程中会导致细胞异型性更大，选择保守诊断为AIS，但术后石蜡诊断为浸润性腺癌，从而导致诊断不足；见。
在本组研究中，有6例病例在冰冻取材时未准确取到肿瘤成分，术后诊断1例为附壁生长为主的腺癌，5例为AIS。如所示，取材的组织制片后镜下仅表现为肺部的弹性纤维瘢痕伴碳末沉积，未见明确肿瘤细胞，为避免因取材造成的冰冻诊断假阴性，应注意一下几点：（1）当冰冻切片出现阴性结果时，应考虑进行额外取材，如未发现可触及的结节，则将标本连续切成薄片，仔细检查每一片是否有可见病灶，并轻轻触诊，病变可能是较周围肺实质稍硬的细微区域，颜色较周围肺实质浅[]；（2）标本中如果无法识别病变，则必须考虑病变未被切除的可能性，要及时与临床医生沟通；（3）对于小的病变，临床可在送检时使用缝线进行标记，帮助病理医师更好地寻找到肿物。另外，应避免冰冻结果假阳性，其中，在冰冻取材、制片过程中应避免污染。如中所见，肺泡腔内见核异型细胞团，冰冻诊断考虑为污染，外科予以楔形切除，该病例术后病理为坏死性肉芽肿性炎。
术中冰冻检查要求病理医师在十几分钟内做出正确的诊断，这需要病理医师有丰富的诊断经验和很高的诊断水平。肺部疾病有很多病种在石蜡切片中都很难做出正确的诊断，需要借助免疫组织化学染色和特殊染色，冰冻中目前尚未普遍应用术中快速免疫组织化学染色方法，所以更考验诊断医师的能力。当遇到诊断困难的病例，要与临床医生沟通，并求助病理高年资医师或科室讨论后给出最终诊断。
在本组研究中，25例病例为浸润性腺癌、MIA和AIS 3种病变之间的判断失误，误诊构成比占45.5%，其中有15例冰冻诊断为AIS，术后石蜡为浸润性腺癌，归为冰冻诊断不足；有10例冰冻诊断为浸润性腺癌，术后石蜡有4例为MIA，6例为AIS，归为冰冻过诊断。首先，判断肿瘤浸润及浸润灶大小是这3种病变诊断与鉴别诊断的关键，可以观察间质是否有纤维反应及炎症反应，细胞异型性是否较周围附壁生长的肿瘤细胞更异型等。如所示，由于受到肺泡塌陷、间质纤维化和炎症的影响，局部AIS的肿瘤性肺泡内陷，但并非真正地浸润，内陷的肿瘤细胞形态与未内陷的AIS形态一致，所以应诊断为AIS。另外，有学者研究弹力纤维染色在判断肿瘤浸润中的作用，且证实以弹力纤维的完整性作为肺腺癌侵袭程度的判断标准是可行的，AIS肺泡间隔中的弹力纤维轻度增生，弹力纤维连续而完整，排列方向规则，分布均匀，肺泡结构保留，未见破坏，而MIA及浸润性腺癌中因肿瘤的间质反应，癌细胞周围的弹力纤维增生、减少甚至缺失，排列方向紊乱、分布不均，原有的肺泡结构被破坏[-]。
其次，肿瘤的气腔播散（spread through air spaces，STAS）、淋巴管、血管、气道或胸膜的浸润均属于浸润的表现，一旦出现则不能诊断为AIS和/或MIA，而需诊断为浸润性腺癌[-]。最后，由于冰冻取材只能反应所取部分组织的情况，具有一定的随机性，对于AIS和MIA的明确诊断需要评估石蜡切片上的整个病变[]，如果决定手术方式，则需要一系列临床特征的判断，例如影像学表现及影像学诊断[]。在Liu等[]的研究中，AIS/MIA术中冰冻在术后病理升级为浸润性腺癌的发生率为4.6%，其中贴壁型占56.5%，腺管型占39.1%，乳头型占4.3%。国内外指南[,-]指出，对于冰冻诊断AIS/MIA的病例，术中行楔形切除，术后病理最终诊断为浸润性腺癌，需根据浸润性腺癌的亚型决定下一步处理方案：若为微乳头型或实体型，建议再次手术切除肺段或肺叶；若为附壁型、乳头型或腺管型，则建议随访。
术中病理诊断是判断肿瘤是否浸润的直接途径，但也具有其局限性，临床医生需充分结合肺部结节的CT表现，包括结节大小和密度、边界是否有毛刺征、是否有胸膜牵拉等，做出自己的判断，选择最终的手术方式。
在本组研究中，有2例冰冻报告为微乳头状腺癌与AIS待鉴别，术后石蜡1例为浸润性腺癌，1例为AIS。有时由于切面或制片的关系，AIS可以形成少量的假乳头（），并不是真正具有二级和三级分支的乳头状结构，容易与乳头状腺癌和/或微乳头状腺癌相混淆。AIS的癌细胞沿着肺泡壁生长，细胞仅见轻度异型性，而乳头状腺癌和微乳头状腺癌的肿瘤细胞异型性较大，且细胞常拥挤、重叠。
在本组研究中，有3例冰冻诊断为AAH，术后石蜡为AIS，有2例冰冻考虑为肺泡上皮良性反应性增生，术后石蜡诊断分别为AAH（1例）和AIS（1例）。AAH与AIS均属于肺腺癌的浸润前病变，其鉴别要点主要是观察肺泡上皮的密度以及与周围正常肺泡的关系，AAH的肿瘤细胞在肺泡壁上常是不连续排列的，相对而言AIS中的肿瘤细胞排列密集，通常无明显间隙；AAH与周围正常的肺泡是渐续性转换的，而AIS的肿瘤性肺泡形态与周围正常肺泡转换更加突然[-]。相对于AAH与肺泡上皮反应性增生来说，AIS表现出更明显的细胞异型性，例如核大小不一、非典型增生的和不规则的细胞核、突出的大核仁（＜10%的病例）和非典型核分裂像（约25%的病例）[]。对于早期的病变，包括AAH、AIS、MIA及附壁生长为主的腺癌，不同病理医师的冰冻诊断一致率并不高[]。
在本组研究中，有10例病例在冰冻切片中仅提示临床细支气管腺瘤与粘液腺癌待鉴别，最终，7例石蜡结果为粘液腺癌，2例为粘液型AIS，1例为细支气管腺瘤，可见在冰冻中鉴别细支气管腺瘤与粘液腺癌十分困难。细支气管腺瘤（bronchiolar adenoma，BA）是由Chang等[]近年来新提出的诊断名词，属于一种良性病变，最先是由Ishikawa在2002年首先报道并命名为“纤毛黏液结节性乳头状肿瘤（ciliated muconodular papillary tumor of the peripheral lung，CMPT）”[]。其组织学特点是由基底细胞层和腔面细胞层构成的双层结构，组织学上可出现纤毛细胞性微乳头、沿肺泡壁跳跃式生长、肺泡间隔增宽以及肺泡壁断裂后充满黏液的黏液湖，形态学与浸润性粘液腺癌、腺泡型腺癌等恶性肿瘤非常相似。诊断BA的关键是要识别是否存在连续的基底细胞层纤毛细胞，冰冻切片中对于存在多层基底细胞比较容易辨认，但对仅存的单层的基底细胞时辨认有一定的困难，并且在冰冻切片中，纤毛可能表现为游离缘的皱褶或顶端胞质突，不容易辨认为纤毛细胞，给在冰冻切片上做出正确的诊断带来巨大的挑战[-]。应用免疫组织化学染色p63、p40、CK5/6可以很好地显示出BA中的基底细胞层（），而在所示的浸润性粘液腺癌中，分化较好的柱状粘液细胞形成腺管状结构，p40、p63免疫组织化学染色均提示无基底细胞层。对于此类在冰冻诊断难以区分的病例，临床医生与病理医生应建立闭环式交流、学习，追踪术后石蜡结果，总结影像学表现及冰冻诊断的疑难点。
在本组研究中，有2例冰冻报告为腺瘤与腺癌待鉴别，术后诊断1例为浸润性腺癌，1例为硬化性肺细胞瘤，另外有2例冰冻报告为硬化性肺细胞瘤，术后诊断1例为AIS，1例为乳头状腺瘤。硬化性肺细胞瘤镜下肿瘤细胞的结构可表现为实性区、乳头区、硬化区及血管瘤样区，但多数肿瘤同时含有两种或两种以上结构，比例不等，由于冰冻取材无法充分取材，可仅出现单一成分，无法显示特征性的4种结构以提示诊断，如所示，冰冻切片中仅可见乳头状结构，未见其它3种结构，且无法准确辨认存在两种细胞，冰冻未给出明确诊断，术后石蜡为硬化性肺细胞瘤。国内学者报道的427例肺部肿物冰冻病理分析中，硬化性肺细胞瘤的误诊率高达36.4%，Cheng所报道的59例病例中，10例（16.9%）硬化性肺泡细胞瘤误诊为恶性肿瘤，导致了不必要的肺叶切除及纵隔淋巴结清扫[-]。因此，有学者[]研究了术中冰冻切片快速免疫组织化学染色在硬化性肺细胞瘤冰冻诊断中的应用，发现TTF-1、ER和Ki-67将术中诊断硬化性肺细胞瘤的准确率从58.33%（7/12）提高到100.00%（12/12），可作为术中冰冻切片快速免疫组织化学的指标对硬化性肺细胞瘤及肺腺癌进行鉴别诊断，更多病例的研究有待进一步开展。
在本组研究中，有3例IgG4相关性疾病在冰冻诊断中均未给出明确诊断。如所示，肺组织中正常肺泡结构消失，代之以明显的纤维化及大量淋巴细胞、浆细胞浸润伴淋巴滤泡形成，在没有免疫组织化学染色辅助诊断时，需与炎性假瘤、淋巴瘤及炎症性肺疾病鉴别。其主要病理改变为组织纤维化，术后石蜡组织免疫组化染色IgG4阳性浆细胞数＞50个/高倍视野（），IgG4/IgG＞40%，而炎症性肺疾病中组织纤维化并不是主要改变，淋巴瘤则表现为肿瘤细胞较单一、弥漫分布，可见细胞异型性及和分裂像。在冰冻切片中诊断IgG4相关性肺疾病有一定的困难，血清IgG4升高具有提示作用[-]。
综上所述，肺部病变错综复杂，非肿瘤性病变、良性肿瘤及恶性肿瘤均可在胸部CT中表现为肺部阴影或结节，冰冻诊断对临床医生选择手术方式有重要的临床价值。为避免治疗过度和/或治疗不足，提高冰冻诊断正确率至关重要，临床医生需提供患者既往肿瘤史，必要时指导病理医生取材，取材医师需仔细准确地找到肿瘤病灶，技术人员要制出高质量的冰冻切片，更需要经验丰富的诊断医师给出正确判断。但术中冰冻诊断仍具有其局限性，临床医生需结合影像学检查及临床经验综合判断。
利益冲突：无。
作者贡献：周翔负责论文设计，筛选文献，整理及分析数据，撰写论文；李雪负责论文设计，进行论文质量评价，修改论文；梁小龙参与数据整理与分析；曹勍、刘洪淼、赵宏颖进行免疫组织化学染色及弹力纤维染色；游宾参与修改论文。