小鼠肝多房棘球蚴感染模型中细胞焦亡NLRP3／Caspase-1通路的初步研究
多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）是由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis，Em）的幼虫感染所致的人畜共患病，每年约有17 400人新发感染[]。中国西部地区是世界上最严重的棘球蚴病流行地区，占有全球病例数的90%以上[]。 AE的特征是病灶向邻近器官和组织呈进行性浸润性增殖，类似于恶性肿瘤的转移，晚期可转移至身体的其他部位，严重者危及生命[]。
细胞焦亡是一种依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的细胞死亡方式，发生时伴有大量炎症介质的释放[]。细胞焦亡与许多人体寄生虫病的发生发展相关，有研究[-]认为，利什曼原虫病患者随着病情的缓解，其病变组织中的Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）、含有CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白（apoptosis-associated?speck-like?protein?containing?a?CARD，ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等的表达水平下降。国内卢亚奇[]研究认为，小鼠感染日本血吸虫可使肝星状细胞内的 NLRP3 炎症小体激活，抑制 NLRP3 炎症小体可以减轻血吸虫感染引起的纤维化。王涛[]对AE患者肝脏组织通过免疫组化法检测细胞焦亡的关键性蛋白，结果显示Caspase-1、Caspase-4、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、IL-18和IL-1β在AE边缘带组织中的表达高于正常肝组织。目前关于AE与细胞焦亡的相关性研究多停留在临床病理，那么细胞焦亡的炎症级联反应是否也会在小鼠AE过程中发挥同样的作用呢？ 2021年12月至2022年9月期间，笔者所在团队通过建立小鼠Em感染模型，旨在探索细胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路与小鼠AE病程发展的相关性，现报道如下。
6～8周龄SPF级健康 BALB/c 雄性小鼠25只购自江苏华创信诺医药科技有限公司 ［生产许可证编号：SCXK（苏）2020-0009；实验小鼠质量合格证编号：NO.202142287］，体质量16～18 g。实验小鼠符合动物伦理学标准，按随机数字表将实验小鼠分为对照组（n=5）和感染组（n=20），感染组再分为感染1、2、3和5个月4个亚组，各亚组n=5。用于Em保种的蒙古长爪沙鼠来自于青海省包虫病研究重点实验室。本研究方案通过了青海大学附属医院科研伦理委员会的审批（批文编号：P-SL-2019054），符合伦理原则。
试剂：Caspase-1、NLRP3、GSDMD一抗和IL-1β ELISA试剂盒均购自美国Thermo公司。抗兔β-actin、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidas，HRP）抗兔IgG和HRP抗鼠IgG二抗均购自美国ProteinTech公司。仪器：生物倒置显微镜系统（DP27）购自日本OLYMPUS公司，透射电子显微镜（JEM-1400FLASH）购自日本电子JEOL公司，超净台购自苏州净化设备有限公司，超低温冰箱购自美国Thermo公司。
将蒙古长爪沙鼠按实验要求处死，浸泡于75%的乙醇中。生物安全柜操作：将处死的小鼠腹部常规备皮消毒，取腹部正中切口逐层进腹，解剖出腹腔AE病灶。用剪刀将泡球蚴组织剪碎后加入适量PBS后进行研磨，制备出细小均匀的组织浆液。用80目的滤网进行过滤，PBS洗涤并自然沉淀3次，最后用PBS进行重悬原头节，计数后制备原头节混悬液（含原头节15 000个/mL）。
感染组：将BALB/c小鼠称重后用1%戊巴比妥钠按照每只50 mg/kg 的剂量进行腹腔内注射，待麻醉满意后将小鼠仰卧位固定于操作台上。常规备皮及消毒，采用切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法，取上腹部剑突下偏左0.3 cm处取长约0.8 cm纵行切口切开皮肤，经腹壁肌层透视确认肝左叶范围后，用1 mL 注射器以30° 角斜行刺入肝脏约3 mm深，回抽无气体、血液后，注入制备好的原头节悬液0.2 mL（含原头节3 000 个），退针后穿刺点用无菌纱布压迫止血，间断缝皮。麻醉苏醒后常规饲养。对照组小鼠未予特殊处理，常规饲养。
根据实验要求分别处死对照组及各时相感染亚组小鼠，完整摘取肝脏，进行以下检测。
观察肝脏的大体形态，然后对照组取肝组织，各时相感染亚组取肝脏棘球蚴病灶周围肝组织，将所取组织样品置于10%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋，5 mm厚度连续切片。苏木精-伊红染色后脱水封片，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。另外，将所取组织样品经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，脱水剂和Epon812包埋剂，最后Ep812包埋，制备60～90 nm超薄切片，先用醋酸铀染色10～15 min，再用柠檬酸铅染色1～2 min，室温下染色。于透射电镜下观察并采集图片，观察超微结构病理改变。
① 采用免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织内Caspase-1和NLRP3 的表达情况：所取组织标本经固定、包埋、切片、脱水处理，先后加一抗、二抗孵育，DAB 显色、复染细胞核、脱水封片； Image J作图，GraphPad Prism 8.0.2分析结果。免疫组化结果判定标准如下：细胞浆内呈现出由淡黄色至棕褐色颗粒为表达阳性，每张切片随机选取3处作为观察点，计算每高倍镜视野下阳性细胞比率，据此做统计学分析。② 采用免疫印迹法检测细胞焦亡关键蛋白的相对表达水平：取对照组小鼠肝脏及各时相感染亚组小鼠病灶周围肝脏组织，充分研磨。加入蛋白裂解液，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。制备 5% 分离胶、10% 浓缩胶进行电泳，电泳开始时设置电压 80 V，进入分离胶后调整为 120 V。用湿转法将凝胶上蛋白样品转印到PVDF膜上并分别加入GSDMD、NLRP3和Caspase-1一抗封闭过夜，次日二抗孵育，TBST洗脱，继以曝光液反应后显影并拍照。结果以待测蛋白与内参照蛋白β-actin灰度值的比值表示。
将各组小鼠肝脏组织制备成匀浆液，3 000 r/min（离心半径13.5 cm）离心10 min，收集上清液于–80 ℃冰箱冻存备用。采用ELISA 法检测，按试剂盒说明书操作，用酶标扫描仪测450 nm处吸光度值（A值），根据标准品的浓度和 A值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度，分析数据。
使用 GraphPad Prism 8.0.2统计软件分析数据，所有实验至少重复3次。正态性检验采用K-S检验，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（±s ）表示；组间较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验。检验水准α=0.05。
对照组小鼠一般情况良好，无死亡小鼠；感染组小鼠随着造模时间延长，腹部逐渐膨隆，质量明显增加，活动度降低，偶见小鼠精神萎靡现象，饮食减少，感染组各时相感染率 为100%，无死亡小鼠。
各时相感染亚组小鼠肝脏组织均可见大小不等的白色病灶，形态不规则，病灶与周围正常肝组织无明显界限，且内部呈浸润性生长。光镜下见，各时相感染亚组小鼠随着感染时间的延长，肝脏内病灶体积逐渐增大，肝脏纤维组织增生加重，且伴较多淋巴细胞和粒细胞浸润，感染5个月组的小鼠肝脏组织已无正常肝脏结构。对照组肝组织结构正常，肝小叶结构完整，未见明显的炎性细胞浸润。具体见。
对照组肝细胞呈多角形，细胞核呈圆形，染色质分布均匀，以常染色质为主，核仁明显，核膜连续完整；胞浆内线粒体、粗面内质网、核糖体等细胞器丰富且结构完整清晰。各时相感染亚组肝细胞病变主要表现为核染色质丢失、线粒体肿胀（部分嵴变短消失，线粒体基质电子密度不均匀）、核糖体丢失，而粗面内质网普遍正常。尤其是感染2个月组的肝细胞，可见部分肝细胞的细胞膜断裂、不连续。 具体见。
ELISA检测结果显示，感染1、2、3和5个月组小鼠肝脏组织匀浆中IL-1β浓度分别为（557.4±113.9）、（1 950.0±95.3）、（1 249.0±105.1）和（714.2±108.8） pg/mL，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；且各时相感染亚组的IL-1β浓度均高于对照组的浓度（276.0±82.1） pg/mL，差异有统计学意义（F=127.2，P<0.05）。具体见。
感染1、2、3及5个月组小鼠肝脏组织标本中Caspase-1表达阳性细胞比率分别为（12.83±0.62）%、（15.11±0.37）%、（14.02±0.72）%和（12.12±0.59）%，均高于对照组小鼠肝脏组织标本中阳性细胞比率 ［（7.48±0.93）%］，差异有统计学意义（F=114.6，P＜0.05）。免疫组化染色结果见。
感染1、2、3及5个月组小鼠肝脏组织标本中NLRP3表达阳性细胞比率分别为 （13.17±0.32）%、（16.24±0.99）%、（13.40±0.98）%和（10.14±0.69）%，均高于对照组小鼠肝脏组织标本中阳性细胞比率 ［（8.04±0.99）%］，差异有统计学意义（F=85.89，P＜0.05）。免疫组化染色结果见。
蛋白免疫印迹检测结果显示：Caspase-1、GSDMD 和NLRP3蛋白在各时相感染亚组小鼠肝脏中的表达呈现先升高（Caspase-1和GSDMD的表达于感染1月时升至最高，NLRP3的表达于感染2月时升至最高）后降低的趋势，各时相感染亚组与对照组比较以及各时相感染亚组之间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。具体见。
AE是一种广泛分布于北半球的寄生虫病，主要因人误食被棘球蚴污染的食物、水而引发[]。该疾病早期无明显临床症状，故大多数患者确诊时已处于晚期阶段，容易错过最佳的治疗时机[]。国内最新回顾性研究[]指出，全国2004–2020年，棘球蚴病的确诊病例数从 2004 年的 991 例上升至 2020 年的 3 650例，累积报告6万余例。AE的治疗方式仍以手术和长期口服阿苯达唑治疗为主，效果不理想，转移率高[]。探索新的治疗方式就显得尤为重要。免疫治疗在改善AE疾病转归方面的作用越来越明显[]，因此AE发生发展过程中的免疫通路与机制的研究可为新的治疗方式提供理论基础。
细胞焦亡作为一种近年被十分关注的程序性细胞死亡形式，对细胞的正常生理及各类病理损伤的发生、发展及转归都起到了一定的作用。Chen等[] 于1996年首次报道了Caspase-1依赖的细胞死亡方式，认为痢疾志贺菌通过诱导巨噬细胞的特殊凋亡来杀灭巨噬细胞。后来发现，Caspase家族的其他成员（如Caspase-/3/4/5/8/11等）也可诱发细胞焦亡[-]。细胞焦亡的形态学特征包括核固缩、染色质断裂和最为典型的胞膜上孔隙形成，在细胞破裂的同时释放大量炎性介质和细胞内容物，激活强烈的炎症反应[]。细胞焦亡可分为经典途径、非经典途径和其他途径，其经典途径是由炎性小体介导的、Caspase-1活化的死亡方式。炎性小体作为细胞焦亡的关键环节，是一组蛋白质复合物，NLRP3、NLRP1和NLRC4是最常见的炎症小体[]。其中，NLRP3炎症小体作为细胞焦亡的基石，可被多种损伤相关分子模式和病原相关分子模式所识别[]，当受到焦亡诱导因子的刺激后，无活性的 Caspase-1前体裂解成有活性的 Caspase-1，后者作用于 GSDMD，将其裂解成 N端结构和 C端结构，其中N端结构将细胞膜上的脂质体裂解，使细胞膜出现孔洞，细胞外的水通过渗透压梯度进入细胞，最终导致细胞膨胀、破裂和死亡。与此同时，无活性的IL-1β前体和IL-18前体也被活化为IL-1β和IL-18，通过孔洞释放至细胞外，造成炎性细胞的黏附和聚集，这就是细胞焦亡经典途径发生的主要机制[-]。国内潘徐彪等[]用免疫组化的方法观察，与健康肝组织相比，在近病灶肝组织内NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-33阳性细胞数量增多且染色较强，表明人体肝AE病灶边缘带内NLRP3炎性小体被激活，且炎性小体相关蛋白及因子表达水平同步增高。因此，本研究拟从动物水平着手，进一步论证细胞焦亡作为一种新的细胞死亡方式是否参与了AE的发生与发展过程。
肝纤维化是一个多因素共同作用的病理生理过程，其发病机制非常复杂，是肝脏受到各种损伤因素刺激后的一种可逆的组织过度修复反应，其病理学特征是细胞外基质过度增生和沉积，是多种病因慢性肝损伤转变成肝硬化、甚至癌变的共同阶段[-]。有研究[-]表明，炎症反应伴随肝纤维化发生发展，肝细胞焦亡可使炎症小体活化，造成炎症介质释放，引发肝脏炎症，进而发展为肝纤维化。Em感染作为一种特殊类型的慢性肝损伤，所致肝纤维化是棘球蚴在肝脏生长发育形成包囊对周围肝组织造成损伤后所发生的慢性修复反应，其病理基础是机体对棘球蚴分泌的抗原产生免疫应答，进而激活肝星状细胞转化为成纤维细胞，释放并积累大量细胞外基质，破坏正常肝组织结构，最终导致肝纤维化[]。所以，为发掘宿主抗寄生虫的固有免疫应答，细胞焦亡作为AE导致肝纤维化的中间环节之一，本研究将为AE的治疗提供理论依据。
如何寻找合适的种植方法，在减少实验动物造模并发症的同时提高肝脏种植感染率呢？腹腔注射法[]是最早使用且最常用的小鼠AE造模方法，具体方法是直接在小鼠右下腹腹腔内注射多房棘球蚴原头节的混悬液，此方法操作简单，术后感染少，动物一般状况良好，存活率高，弊端是感染后形成的棘球蚴病灶往往分布在腹腔内各个器官，肝脏阳性率低，且腹腔粘连明显。开腹肝穿刺法[]是小鼠开腹后，将定量的多房棘球蚴原头节混悬液直接注射于肝脏。该方法的优点是穿刺点定位明确，接种率高，不容易发生误入胸腔、误穿大血管等并发症，弊端是手术步骤繁琐，操作过程出血多，损伤大，且术后易并发感染、肠梗阻、甚至死亡。卞志远等[]发现经皮肝穿刺法操作简易，存活率较高，缺点是肝叶定位不确切，穿刺过程易误入胸腔，导致小鼠气胸、呼吸衰竭甚至死亡，若误穿进入大血管或胆道后可发生严重并发症。若能凭借影像学辅助定位，可明显降低误穿引起的严重并发症。切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法[-]是经腹壁肌层，向肝脏注射多房棘球蚴原头节混悬液的动物造模办法，因小鼠腹壁肌层较薄呈半透明状，可避开腹壁大血管且不易误入胸腔，因此该方法操作简单，造模成功率高，弊端是仅适用于小体型实验动物的接种。门静脉分支注射法同开腹肝穿刺法一样，首先需要动物开腹，然后将定量的多房棘球蚴原头节混悬液穿刺并注入暴露的门静脉分支内，并用丝线结扎注射静脉的远端。吴亮亮等[]认为该操作方法近似棘球蚴的自然感染途径，但在小型实验动物的接种过程中操作复杂，因门静脉分支静较细，故注射难度较大，且实验动物术后易发生出血、肠梗阻、肠坏死甚至死亡。权衡利弊后，本研究最终采用通过切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺注射原头蚴的方法构建BALB/c小鼠多房棘球蚴病模型，发现Em感染宿主后，均定植在肝组织，此造模方式操作简单，创伤小，可用于推广。在本次实验中，受感染的小鼠肝脏表面出现了大小不一的白色病灶，随着感染时间的延长，病变范围明显扩大，感染后期导致部分病灶发生实质性变化。
本研究通过免疫组化联合免疫印迹法检测，双重证实了小鼠Em感染后，细胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路关键蛋白的表达呈现先升高后逐渐降低的趋势。本研究仅从细胞焦亡的经典途径入手，证明了小鼠肝Em感染后存在细胞焦亡现象，可能通过细胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路发挥炎症放大作用。本研究只通过小鼠模型证明了存在细胞焦亡现象，若能通过AE患者手术标本去验证是否有相同的现象，将更能证明细胞焦亡与AE之间的关系。流式细胞技术可将细胞焦亡现象进一步定位到细胞水平，明确具体发生焦亡的细胞。未来可进一步探索该疾病与细胞焦亡的其他途径的相关性，论证有无其他更多的靶点引起病灶周围组织中的炎症反应。AE病程中伴随众多因子相互作用，且免疫逃逸机制尚不完全清楚，故探究细胞焦亡与其他免疫逃逸机制的相互作用这在AE的进一步研究方面意义深远，同时相关因子的进一步亚型研究以及针对性的抑制剂研究，可为防治AE寻求新靶点，提供新思路。
重要声明
利益冲突声明:本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：乜茹、刘川川和李文登共同完成动物实验；庞明泉、尹凤娇和冶赓博负责整理实验数据和查阅文献；乜茹负责完成论文撰写；王志鑫和樊海宁负责论文审校和修改。
伦理声明：本研究通过了青海大学附属医院科研伦理委员会的审批（批文编号：P-SL-2019054），符合伦理原则。