一种CK-MB重组蛋白的表达载体及其制备方法和应用与流程

　　一种ck-mb重组蛋白的表达载体及其制备方法和应用技术领域1.本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种ck-mb重组蛋白的表达载体及其制备方法和应用。背景技术：2.心肌酶谱系列是心血管疾病常用的检测指标，包括肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)、氨酸转氨酶(ast)等。如果心肌细胞发生坏死或者破裂，这些酶就会被释放进入血液当中，使其在血液中的浓度升高。因此，心肌酶谱的升高程度可以作为间接衡量心肌细胞损害程度的重要指标，其中ck是灵敏度较高的指标。ck为二聚体酶，分子大小为81000～82 000da，由两个相同或者相似的亚基组成，包括脑型(bb)、肌肉型(mm)、杂化型(mb)、线粒体型(mimi)4种同工酶，其中，ck－mb的特异性高。3.目前，ck-mb检测通常采用免疫分析法，需使用大量高质量的标准品和抗体。由于人ck-mb天然来源有限，通过基因工程方法来制备高质量的重组ck-mb免疫原和标准品成为获得ck-mb的重要手段。ck－mb二聚体的每个亚基的n末端均有一个小结构域通过连接序列连接到c－末端的一个大结构域上。整个二聚体中，98％的酪氨酸残基被包裹在空间结构内部，仅有2％暴露在结构表面；另外，每个亚基表面均包含2个可以反应的组氨酸残基和2个可以反应的巯基。其复杂的空间结构给体外重组技术的应用带来了很大困难，因此重组难度高。4.中国发明专利申请公开文本cn107698683a公开了一种ck mb融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白由ck-m蛋白和ck-b蛋白通过loop连接形成，与天然ck-mb蛋白功能相同。其制备方法是将人源性ck-m和ck-b的编码基因序列用loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体得到表达质粒，进而利用大肠杆菌表达，产物经纯化，得到活性蛋白含量为85％的融合蛋白。利用该方法制备的融合蛋白需要复杂的loop连接过程，并且得到的活性蛋白纯度较低。5.中国发明专利申请公开文本cn110904068a公开了ck-mb型肌酸激酶同工酶的制备方法，首先分别克隆m亚基基因片段和b亚基基因片段，分别插入至表达载体；然后分别转化、诱导表达、分离纯化，得到m亚基蛋白和b亚基蛋白；再将m亚基蛋白和b亚基蛋白稀释后等比例混合，形成ck-mb型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。然而，利用该方法在体外进行组装，效率较低，且形成的ck-mm/bb杂蛋白无法去除。6.然而现有技术的制备方法中，获得ck-mb的纯化方法复杂，样品纯度低，样品表达量低，活性低，难以满足市场上对ck-mb重组蛋白的需求。技术实现要素：7.为了解决现有技术中ck-mb重组蛋白纯化方法复杂、样品纯度低等技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种ck-mb重组蛋白的表达载体及其制备方法，简化纯化步骤，获得纯度高的重组蛋白。为了达到该目的，本发明采取的技术方案如下：8.本发明的第一方面提供一种ck-mb重组蛋白的表达载体，所述表达载体上包括ck-m序列和ck-b序列，还包括第一标签序列和第二标签序列，所述第一标签序列位于所述ck-m序列之前或者之后，所述第二标签序列位于所述ck-b序列之前或者之后。9.利用本发明的表达载体得到的ck-mb重组蛋白，ck-m携带第一标签，ck-b携带第二标签，如此可以使用针对两种标签的纯化方法分别进行纯化，经过两步纯化，能够去除未成功组装的ck-m/b蛋白，获得只含有ck-mb二聚体形式的活性重组蛋白，从而得到高纯度的ck-mb蛋白。10.在本发明的一些实施方案中，所述第一标签序列和所述第二标签序列为包括his标签序列、gst标签序列、mbp标签序列、flag标签序列、avi标签序列、sumo标签序列、snap标签序列的组中的任意两种。11.在本发明中，his标签是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的c末端或n末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(imac)，对重组蛋白进行分离纯化。12.gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签应用在原核表达中，一方面可以增加外源蛋白的可溶性；另一方面可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。gst标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。13.mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kda，由大肠杆菌k12的male基因编码，mbp可以融合在蛋白的n端或c端。mbp可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。14.flag标签蛋白为8个氨基酸(dykddddk)的融合多肽，flag作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质；融合flag的目的蛋白，可以直接通过flag进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。15.avi标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的n端和c端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物。16.sumo标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-likemodifier)，是泛素类多肽链超家族的重要成员之一。研究发现sumo可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。17.halo标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的halo配基有效地共价结合。这个分子量为33kda的单体蛋白能融合在重组蛋白的n端或c端，并在原核和真核系统中表达。18.snap标签是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如sds-page gels)等。将纯化的或未纯化的snap标签融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地纯化蛋白的目的。19.在本发明中，所述第一标签序列和/或所述第二标签序列选用相对较小的标签，以避免标签过长引起非特异性。在本发明的一些优选实施方案中，所述第一标签序列为flag标签序列，所述第二标签序列为his标签序列。由此，在蛋白纯化过程中，可依次进行ni柱纯化及flag抗体柱纯化，经过两步亲和层析去除未成功组装的ck-m/b蛋白，获得只含有ck-mb二聚体形式的活性重组蛋白。20.在本发明的一些实施方案中，所述载体为原该表达载体。在本发明的一些优选实施方案中，所述载体基于pet-28a载体进行构建。21.本发明的第二方面提供一种宿主细胞，其特征在于，其包含本发明第一方面所述的表达载体。当所述表达载体为原核表达载体的时候，相应地宿主细胞为原核细胞，优选地为大肠杆菌。22.本发明的第三方面提供一种ck-mb重组蛋白，其是通过诱导本发明第一方面任一述的表达载体在宿主细胞中进行表达得到的。23.进一步地，所述重组蛋白经过针对所述第一标签的纯化方法和针对所述第二标签的纯化方法进行纯化。24.本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的表达载体的构建方法，包括以下步骤：25.s1，获得第一载体，所述第一载体具有至少一个多克隆位点，26.s2，分别获得ck-m序列、ck-b序列、第一标签序列、第二标签序列；27.s3，将所述分别获得ck-m序列、ck-b序列、第一标签序列、第二标签序列连接到所述第一载体上，即得到ck-mb重组蛋白的表达载体。28.多克隆位点(multiple cloning site，mcs)，是包含多个(最多20个)限制性酶切位点(restriction site)的一段很短的dna序列，也称为多位点接头(polylinker)，是外源基因插入的位置。mcs是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。mcs中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。29.在本发明的一些实施方案中，所述第一标签序列是利用限制性内切酶从具有所述第一标签序列的线性的或非线性的基因序列上进行酶切得到的，或者是利用pcr方法以具有所述第一标签序列的线性的或非线性的基因序列为模板扩增得到的。同样地，所述第二标签序列是利用限制性内切酶从具有所述第二标签序列的线性的或非线性的基因序列上进行酶切得到的，或者是利用pcr方法以具有所述第二标签序列的线性的或非线性的基因序列为模板扩增得到的。30.在本发明的一些实施方案中，将ck-m序列、ck-b序列、第一标签序列、第二标签序列逐一连接到所述第一载体上，或者先将相邻的两个序列连接在一起后再连接到所述第一载体上。31.在本发明中，待连接至所述第一载体上的序列两端分别具有与所述第一载体上相同的酶切位点且前后位置一致。32.在本发明的一些实施方案中，所述待连接至所述第一载体上的序列上的酶切位点是利用带有相应酶切位点的引物进行pcr扩增得到的。33.作为替代的方案，所述第一载体本身可携带所述第一标签序列和/或所述第二标签序列，由此，只需连接入所述ck-m序列和所述ck-b序列即可，连入顺序没有任何限定。本领域人员知悉，为了使得表达出的蛋白携带所述第一标签序列编码的第一标签蛋白或第二标签序列编码的第二标签序列，可能使用酶切反应切除多余的不影响载体表达功能的序列。当然，也可以利用酶切反应对所述第一标签序列和/或第二标签序列进行移位和/或换位。34.在本发明的一个具体实施方案中，具体制备方法如下：35.第一步：获得所述第一载体，所述多克隆位点具有第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点、第四酶切位点、第五酶切位点、第六酶切位点、第七酶切位点和第八酶切位点。36.第二步：分别获得以下序列：37.第一序列，依次包括所述第一酶切位点、所述第一标签序列和所述第二酶切位点；38.第二序列，依次包括所述第三酶切位点、所述ck-m序列和所述第四酶切位点；39.第三序列，依次包括所述第五酶切位点、所述第二标签序列和所述第六酶切位点；40.第四序列，依次包括所述第七酶切位点、所述ck-b序列和所述第八酶切位点；41.其中，所述第一序列的制备方法为：获得具有第一标签序列的第一标签序列模板，利用具有所述第一酶切位点的第一上游引物和具有所述第二酶切位点的第一下游引物进行pcr扩增得到，或者直接获得依次包括所述第一酶切位点、所述第一标签序列和所述第二酶切位点的线性的或非线性的dna模板作为第一序列。42.所述第二序列的制备方法为，获得具有ck-m序列的ck-m序列模板，利用具有所述第三酶切位点的第二上游引物和具有所述第四酶切位点的第二下游引物进行pcr扩增得到。43.所述第三序列的制备方法为：获得具有第二标签序列的第二标签序列模板，利用具有所述第五酶切位点的第三上游引物和具有所述第六酶切位点的第三下游引物进行pcr扩增得到，或者直接获得依次包括所述第五酶切位点、所述第二标签序列和所述第六酶切位点的线性的或非线性的dna模板作为第三序列。44.所述第四序列的制备方法为，获得具有ck-b序列的ck-b序列模板，利用具有所述第七酶切位点的第四上游引物和具有所述第八酶切位点的第四下游引物进行pcr扩增得到，45.第三步：46.(1)利用所述第一酶切位点的内切酶和所述第二酶切位点的内切酶分别对所述第一序列和所述第一载体进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第二载体，所述第二载体包括所述第一标签序列。47.(2)利用所述第三酶切位点的内切酶和所述第四酶切位点的内切酶分别对所述第二序列和所述第二载体进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第三载体，所述第三载体包括所述第一标签序列和所述ck-m序列。48.(3)利用所述第五酶切位点的内切酶和所述第六酶切位点的内切酶分别对所述第三序列和所述第三载体进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第四载体，所述第四载体包括所述第一标签序列、所述ck-m序列和所述第二标签序列。49.(4)利用所述第七酶切位点的内切酶和所述第八酶切位点的内切酶分别对所述第四序列和所述第四载体进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第五载体，即所述ck-mb重组蛋白的表达载体，依次包括所述第一标签序列、所述ck-m序列、所述第二标签序列和所述ck-b序列。50.任选地，所述第三序列为依次包括第二标签序列、第七酶切位点和第八酶切位点的载体，所述第一载体上还包括第九酶切位点，则上述第(3)和(4)步替换为：51.(3’)利用所述第七酶切位点的内切酶和所述第八酶切位点的内切酶分别对所述第三序列和所述第四序列进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第五载体，以第五载体为模板，利用具有所述第五酶切位点的第五上游引物和具有第九酶切位点的第五下游引物进行pcr扩增得到第五序列；52.(4’)利用所述第五酶切位点的内切酶和所述第九酶切位点的内切酶分别对所述第五序列和所述第三载体进行酶切，并将酶切产物进行连接得到第六载体，即所述ck-mb重组蛋白的表达载体，依次包括所述第一标签序列、所述ck-m序列、所述第二标签序列和所述ck-b序列。53.在本发明中，在不影响酶切效果的前提下，不同的酶切位点可以是相同的位点，例如第二酶切位点可以与第三酶切位点相同、第六酶切位点可以与第七酶切位点相同。54.利用在本发明中，所述ck-m序列和ck-b序列是分别利用pcr方法以ck-mb的编码基因为模板进行扩增得到的。55.在本发明的一些实施方案中，所述ck-mb重组蛋白的编码基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列。56.在本发明的一个优选的实施方案中，所述ck-mb重组蛋白的制备方法如下：57.(1)分别以具有seq id no.1所示的核苷酸序列的所述ck-mb重组蛋白的编码基因为模板，以seq id no.2和seq id no.3所示的引物对进行pcr扩增得到ck-m序列，以seq id no.4和seq id no.5所示的引物对进行pcr扩增得到ck-b序列。58.(2)以pet-28a载体为模板，利用seq id no.6和seq id no.7所示的引物对进行pcr扩增得到flag标签序列，利用bgl ii&ecor i分别对所述flag标签序列和所述pet-28a载体进行酶切，酶切产物连接后获得pet-flag载体；59.(3)利用bamh i&hind iii分别对所述ck-m序列和所述pet-flag载体进行酶切，酶切产物连接后获得pet-flag-ck-m载体；60.(4)利用bamh i&hind iii分别对所述ck-b序列和所述pet-28a载体进行酶切，酶切产物连接后获得pet-28a-ck-b载体，以pet-28a-ck-b载体为模板，利用seq id no.8和seq id no.9所示的引物对进行pcr扩增得到ck-b表达框。61.(5)利用hind iii&xho i分别对所述pet-flag-ck-m载体和所述ck-b表达框进行酶切，酶切产物连接后获得pet-ck-mb载体，即为所述ck-mb重组蛋白的表达载体。62.本发明第五方面提供本发明第三方面所述的ck-mb重组蛋白在制备用于体外诊断的质量控制物中的应用。63.在本发明中，所述质量控制物包括标准品、校准品和质控品，在体外诊断产品的研发、生产、量值溯源和使用过程中都起着非常重要的作用。64.标准品又称标准物质、参考物质或标准样品，一般是具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特征被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期用途。这里的预期用途主要包括校准、给其它物质赋值或提供质量保证。在体外诊断领域，用途标准品的蛋白主要为蛋白纯品物质。65.校准品又称校准物、定标品或定标液，用于校准体外诊断试剂或系统，是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果准确一致的主要工具，也是保证量值传递的实物计量标准。一般用蛋白与基质的混合物来制备校准品。66.质控品又称质控物、对照品，是被其制造商预期用于验证体外诊断医疗器械性能特征的物质、材料或物品，其目的是评价或验证测量精度和测量准确度，或由于试剂各分析仪器的变化产生的分析偏差等性能特征。质控品也是用蛋白与基质的混合物来制备的。67.本发第六方面提供一种蛋白保存液在保存本发明第三方面所述的ck-mb重组蛋白中的应用，所述保存液包括10～100mm tris、0.05～0.2m nacl、10～100mm甘氨酸、0..05～0.3m海藻糖或蔗糖、0.1～1％吐温80、0.005～0.05％p300，其中所述tris的ph为7.5～8.5。68.在本发明的一些优选实施方案中，所述保存液包括20mm tris、0.15m nacl、20mm甘氨酸、0.2m海藻糖或蔗糖、0.5％吐温80、0.03％p300，其中所述tris的ph为8.0。69.本发明的第七方面提供一种蛋白溶液，其特征在于，所述蛋白溶液是蛋白保存液稀释本发明第三方面所述的ck-mb重组蛋白得到的，所述保存液包括10～100mm tris、0.05～0.2m nacl、10～100mm甘氨酸、0..05～0.3m海藻糖或蔗糖、0.1～1％吐温80、0.005～0.05％p300，其中所述tris的ph为7.5～8.5。。70.在本发明的一些实施方案中，所述蛋白溶液中，ck-mb重组蛋白的浓度不超过0.5mg/ml。71.本发明的有益效果72.相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：73.本发明的ck-mb的表达载体结构简单，易于制备，表达量高。74.本发明的ck-mb的表达载体表达出来的重组蛋白包含两种标签，可以使用两种不同的纯化方法，大大简化了纯化步骤，并且纯化后的重组蛋白没有多余的蛋白片段，从而获得高纯度的重组蛋白。75.本发明的ck-mb的表达载体使得两种蛋白同时于原核细胞中低温诱导表达，并于原核细胞胞内组装，以天然二聚体形式大量表达于胞内上清表达出来，重组蛋白活性高。76.本发明的ck-mb重组蛋白能够在特定优化过的蛋白保存液中稳定保存，在37℃下可稳定保存长达18d。附图说明77.图1示出了本发明实施例1构建pet-ck-mb载体的流程示意图。78.图2示出了本发明实施例1构建的pet-ck-mb载体示意图。79.图3示出了本发明实施例3中利用pet-ck-mb载体表达蛋白的sds-page检测结果。80.图4示出了本发明实施例3中利用ck-m-lingker-b载体表达蛋白的sds-page检测结果。81.图5示出了本发明实施例4中分别利用ck-m-lingker-b载体和pet-ck-mb载体表达纯化后的蛋白及市售蛋白进行elisa检测的曲线。82.图6示出了本发明实施例5中利用保存液1按1mg/ml保存时间梯度进行热加速稳定性的检测结果。83.图7示出了本发明实施例5中利用保存液1按0.5mg/ml保存时间梯度进行热加速稳定性的检测结果。84.图8示出了本发明实施例5中利用保存液1按0.1mg/ml保存时间梯度进行热加速稳定性的检测结果。85.图9示出了本发明实施例5中利用保存液2按0.5mg/ml保存时间梯度进行热加速稳定性的检测结果。具体实施方式86.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。87.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。88.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。89.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。90.实施例91.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。92.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。93.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。94.下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(j.萨姆布鲁克、m.r.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。95.实施例1 pet-ck-mb重组蛋白表达载体构建96.参考图1，构建pet-ck-mb重组蛋白表达载体。97.1.根据ck-m蛋白序列(ncbi登录号：p06732)和ck-b蛋白序列(ncbi登录号：p12277)，将其编码序列密码子优化为大肠杆菌序列，由苏州金唯智公司合成优化，为seq1，核苷酸序列如下所示(seq id no.1)：98.5'-ggatccccgtttggcaacacccataacaaatttaaactgaactataaaccggaagaggaatatccggatctgagcaaacataacaaccatatggcgaaggtgctgaccctggaactgtataaaaaactgcgcgataaagaaaccccgagcggctttacggttgatgatgttattcagacgggtgttgataacccgggccatccgtttatcatgaccgtgggctgcgtggcgggtgatgaggaaagctacgaagtgtttaaagaattatttgatccgattattagcgatcgccatggtggctataagccaacggataaacataaaaccgacttaaaccatgaaaacctgaaaggcggcgatgacttagatccgaactatgtgctgagcagccgcgtgcgcacgggccgcagcatcaagggctataccctgccgccgcattgtagccgcggcgagcgccgcgcggtggaaaaactgagcgttgaggcgctgaacagcctgaccggcgaatttaaaggcaaatattatccactgaaaagcatgaccgaaaaagaacagcaacagctgatcgatgatcattttttatttgacaaaccggttagtccactgttactggcgagcggcatggcgcgtgattggccggatgcgcgcggcatttggcataatgacaataagagctttctggtgtgggtgaatgaggaggatcacctgcgcgtgattagcatggaaaaaggtggcaacatgaaagaagtgtttcgccgtttttgcgtgggcctgcagaaaattgaagaaatttttaaaaaagcgggccatccattcatgtggaatcagcatctgggctatgtgctgacctgcccgagcaatctgggcaccggtctgcgcggcggcgtgcatgtgaaactggcgcacctgagcaaacacccgaaatttgaagaaattctgacccgcctgcgcctgcagaagcgtggtaccggcggcgtggacacggcggccgtgggcagcgtttttgatgtgagtaacgccgatcgcctgggcagcagcgaagttgaacaagtgcagttagtggtggatggcgtgaaactgatggtggaaatggaaaaaaaactggaaaaaggtcagagcattgatgatatgattccggcgcagaaaccgtttagcaacagccataacgcgctgaaactgcgctttccggcggaagatgaatttccggatttaagcgcgcataataaccatatggccaaagttctgaccccggaactgtatgcggaactgcgcgcgaaaagcaccccgagtggttttacgctggacgatgtgattcagaccggcgtggacaacccgggccatccgtatattatgaccgtgggctgtgttgccggcgacgaagaaagctatgaagtgttcaaagatctgtttgatccaattattgaagatcgccatggcggctataaaccaagtgatgaacataaaacggatctgaacccggataacctgcaaggcggtgatgatttagatccgaattacgtgctgagtagccgcgttcgcaccggccgcagcattcgcggcttttgcctgccgccacattgcagccgcggcgaacgtcgcgcgattgaaaaactggcggtggaagcgctgagcagcttagacggcgatctggcgggccgctattatgcgctgaaaagtatgaccgaggccgaacagcaacagttaattgacgatcactttctgtttgataaaccggtgagcccactgctgttagcgagcggtatggcccgcgattggccggacgcccgcggtatctggcataacgacaacaagacgtttctggtgtgggttaatgaggaagatcatctgcgcgttattagcatgcagaaaggcggcaacatgaaggaagtgtttacgcgcttttgcaccggcctgacgcagattgaaaccctgtttaaaagcaaagattatgaatttatgtggaatccgcatctgggttatattttaacctgcccgagtaacctgggtacgggcctgcgcgcgggcgtgcatattaaactgccgaacctgggcaaacatgaaaaatttagcgaagtgctgaagcgcctgcgcttacagaagcgtggcaccggcggtgtggacaccgcggcggtgggtggcgtgttcgatgtgagcaacgccgaccgcctgggctttagcgaagtggaactggtgcagatggtggtggatggtgttaagctgctgattgaaatggaacagcgcctggaacaaggccaagcgattgatgatctgatgccggcgcagaaataaaagctt-3'(seq id no.1)99.2.针对上述序列，设计引物分别扩增ck-m序列和ck-b序列，用于扩增ck-m序列的引物序列如下：100.seq2(seq id no.2)：5'-ggcggatccccgtttggcaacac-3'101.seq3(seq id no.3)：5'-ggcaagcttttatttctgcgccggaatcatatcatc-3'102.其中，下划线表示酶切位点，下同。103.用于扩增ck-b序列的引物序列如下：104.seq4(seq id no.4)：5'-gccggatccccgtttagcaacagccataacg-3'105.seq5(seq id no.5)：5'-gccaagcttttatttctgcgccggc-3'106.其中，107.以seq1为模板，分别以seq2&seq3、seq4&seq5扩增ck-m、ck-b。108.3.设计引物构建pet-flag载体，引物的核苷酸序列分别如下：109.seq6(seq id no.6)：5'-ccgagatctcgatcccgcgaaat-3'110.seq7(seq id no.7)：111.5'-gccgaattcggatcctttgtcgtcgtcatctttgtagtcgctgctgcccatggt-3'112.具体地，以pet-28a载体为模板，引物seq6、seq7扩增flag片段，经过bgl ii&ecor i酶切，t4连入经bgl ii&ecor i酶切的pet-28a载体，获得pet-flag载体。113.4.将步骤2获得的ck-m和ck-b分别经过bamhi&hind iii酶切，t4分别连入经bamhi&hind iii酶切的pet-flag、pet-28a，获得pet-flag-ck-m、pet-28a-ck-b(带有his标签)。114.5.设计引物seq8、seq9，核苷酸序列分别如下：115.seq8(seq id no.8)：5'-ggcaagctttcgagatctcgatcccgcga-3'116.seq9(seq id no.9)：5'-ggcctcgagttatttctgcgccggcatcag-3'117.以pet-28a-ck-b为模板，利用seq8、seq9扩增ck-b表达框(ck-b-2)，经过hind iii&xho i酶切，t4连入经hind iii&xho i酶切的pet-flag-ck-m，获得pet-ck-mb载体，如图1所示。118.为了验证本实施例构建的载体表达ck-mb重组蛋白更具优势，发明人按照中国发明专利申请公开文本cn110904068a公开的技术方案构建了ck-m-lingker-b载体。119.实施例2 ck-mb重组蛋白表达120.将实施例1制备得到的pet-ck-mb载体转入bl21(de3)大肠杆菌，挑取单菌落接种于20ml kana培养基中，37℃200rpm培养16h，活化菌种1：50接种于kana培养基，37℃200rpm培养1.5～2.5h，至od600≈0.8(0.6～1.0)，加入0.5mm iptg(0.1～1mm)，22℃(20～30℃)200rpm诱导表达16h～20h，收集细胞沉淀，其中含有ck-mb重组蛋白。121.而实施例1中构建的ck-m-lingker-b载体，使用cn110904068a公开的诱导条件，即：加入iptg至终浓度0.5mm，37℃诱导培养4h，无法诱导成功。发明人针对该载体重新优化诱导条件为：加入iptg至终浓度为0.5mm(0.1～1mm)，22℃(20～30℃)200rpm诱导表达16h～20h，以上清形式表达。122.实施例3 ck-mb重组蛋白纯化123.实施例2中将pet-ck-mb载体转化至大肠杆菌并经诱导表达后，收集的细胞沉淀按以下方法进行重组纯化：124.每150ml细胞沉淀加入30ml 50mm tris(ph 8)、0.5m nacl缓冲液重悬，超声破碎细胞沉淀，经过离心过滤获得胞内上清；细胞上清经过ni层析，过滤ck-m/ck-mm，使用50mm tris(ph 8)、0.5m nacl、0.5m咪唑缓冲液洗脱获得ck-b/ck-bb/ck-mb混合物；无需替换缓冲液，加入等体积50mm tris(ph 8)稀释上样，经过flag抗体柱过滤ck-b/ck-bb，获得ck-mb重组蛋白。125.由上可知，利用本发明制备的表达载体进行重组蛋白表达后，蛋白纯化的过程大大得到了简化，并且能够去除未重组的蛋白片段，取得了显著的进步。126.得到的ck-mb重组蛋白经sds-page检测(如图3所示)，所得产物纯度可达95％，且产量大于30mg/l，且均为ck-mb上清活性形式表达。127.而实施例2中，转化有ck-m-lingker-b载体的大肠杆菌经诱导表达后，诱导前后及纯化各步骤中各组分利用sds-page检测，结果如图4所示。结果发现，经过一步ni柱亲和层析，获得的重组蛋白纯度较低，如需获得高纯度蛋白，还需要进一步考虑离子交换方法。另外，重组蛋白中含有其他蛋白片段，有可能影响检测效果。128.实施例4 ck-mb重组蛋白活性分析129.将实施例3中ck-m-lingker-b载体和pet-ck-mb载体表达纯化后的蛋白(分别标记为ck-mb-1和ck-mb-2)，利用elisa检测试剂盒(sigma-aldrich，货号rab0641)进行双抗体夹心elisa检测，并使用试剂盒自带ck-mb重组蛋白作为对照(标记为ck-mb control)。130.结果如图5所示，结果表示，pet-ck-mb载体表达纯化的ck-mb重组蛋白(ck-mb-1)与ck-mb control，以及ck-m-lingker-b载体表达纯化的ck-mb重组蛋白(ck-mb-1)相关性均非常高，可完全替代市面上ck-mb蛋白产品。131.实施例5 ck-mb重组蛋白保存缓冲液筛选132.为了保存实施例3中pet-ck-mb载体表达纯化后的ck-mb重组蛋白，发明人配制以下蛋白保存液：133.保存液1：20mm tris(ph 8.0)、0.15m nacl、20mm甘氨酸、0.2m海藻糖、0.5％吐温80、0.03％p300。134.保存液2：20mm tris(ph8.0)、0.15m nacl、10％胎牛血清(fbs)。135.使用保存液1稀释ck-mb重组蛋白为1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml进行37℃热加速稳定性实验，分别加速18d、12d、6d、0d(4℃保存)，结果如图6～图8所示。136.利用保存液2稀释ck-mb重组蛋白为0.5mg/ml进行37℃热加速稳定性实验，分别加速18d、12d、6d、0d(4℃保存)，结果如图9所示。137.结果表明：ck-mb重组蛋白保存最佳条件为保存液1，浓度≤0.5mg/ml。在这种下进行保存，检测结果线性拟合度良好，可在37℃保存18d；浓度》0.5mg/ml长时间保存会造成蛋白活性降低，导致检测平台期降低；而利用保存液2保存，4℃以上保存会造成蛋白失活，并且在0.1mg/ml和1mg/ml浓度下进行保存，均得到同样的结果。保存液1不需要动物血清成分，可以获得更好的保存效果，避免了生物安全性和伦理上的问题。138.发明人进一步研究表明：对保存液1进行调整：10～100mm tris(ph 7.5～8.5)、0.05～0.2m nacl、10～100mm甘氨酸、0..05～0.3m海藻糖、0.1～1％吐温80、0.005～0.05％p300，同样可以取得上述保存效果，并且，将海藻糖全部或部分替换为蔗糖后，也不影响保存效果。139.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。