配体结合的Notch1受体通过网格蛋白介导的内吞作用被内吞并运输到溶酶体

　　本研究中使用的iPSCs来自健康捐赠者。捐赠者给予书面知情同意。所有人类材料的实验都符合赫尔辛基宣言。

　　所有细胞在5%和37°C下培养，加入1:100青霉素链霉素（Invitrogen，15140122），并通过聚合酶链反应（PCR）定期检测支原体。除非另有说明，细胞培养板在使用前涂上1:100盖特瑞克斯（Invitrogen，A1413302）。在实验室中制备氮气补充剂如下：杜尔贝科改良鹰氏培养基（DMEM）/F12（Invitrogen，11320074）、胰岛素（500μg/ml）（Sigma-Aldrich，91077C）、转铁蛋白（10 mg/ml）（Sigma-Aldrich T3705）、亚硒酸钠（520 ng/ml）（Sigma-Aldrich，A8960）、腐胺（1.611 mg/ml）（Sigma-Aldrich 51799），黄体酮（630ng/ml）（西格玛·奥尔德里奇，P8783）。有关不同单元类型及其维护的更多详细信息，请参见以下部分。

　　用仙台病毒对两名健康成人供者（ctrl#1：男性，活检年龄：33；ctrl#2：女性，活检年龄：44）的皮肤成纤维细胞重编程。在E8培养基中，在无饲养条件下，在Geltrex涂层板上维持IPSC：DMEM/F12，Hepes（Invitrogen，11330057），亚硒酸钠（14ng/ml）（Sigma-Aldrich，A8960），我-抗坏血酸磷酸酯（64μg/ml）（Sigma-Aldrich，A8960）、胰岛素（20μg/ml）（Sigma-Aldrich，91077C）、转铁蛋白（11μg/ml）（Sigma-Aldrich，T3705）、FGF2（100 ng/ml）（细胞引导系统，GFH146）和转化生长因子β（2 ng/ml）（细胞引导系统，GFH39）。媒介是每天变化。使用EDTA（Invitrogen，15575020）进行分离，并将5μM Y-27632（细胞引导系统，SM02）添加到培养基中24小时。

　　用Smad和Wnt双重抑制诱导iPSCs的神经命运。因此，将融合的iPSC培养基改为含有200 nM LDN193189、500 nM A83和2μM XAV 939的神经诱导培养基，在DMEM/F12（Invitrogen，11320074）、0.5%N2（自制，见上文）、1%B27（Invitrogen，17504044）、1%谷氨酰胺（Invitrogen，35050038）、1%非必需氨基酸（NEAA）（Invitrogen，11140035），4.44 mM葡萄糖（Roth HN06.2）。每天更换培养基，10天后用胰蛋白酶进行低密度分裂。为了进一步维护，细胞保存在含有3μM CHR99021和500 nM嘌呤胺的DMEM/F12培养基中（Invitrogen，11320074），补充0.5%N2（自制，见上文）、0.5%B27（Invitrogen，17504044）、1:100谷氨酰胺（Invitrogen，25030024）和4.44 mM葡萄糖（Roth HN06.2）的DMEM/F12培养基中。介质每天更换，周末每隔一天更换一次。使用胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen，15400054）和胰蛋白酶抑制剂（Invitrogen，17075029）传代细胞。

　　实验前，将培养基切换到DMEM/F12（Invitrogen，11320074），0.5%N2（自制，见上文），1%B27（Invitrogen，17504044），8.88 mM葡萄糖（Roth HN06.2），EGF（10 ng/μl）（细胞引导系统，GFH26），FGF2（10ng/μl）（细胞引导系统，GFH28）诱导SM-NPCs向花环型NSCs的转化至少3天。对于不对称定量，神经干细胞保持在EGF/FGF2条件下，直到第一次自发分化发生，分裂成最终形式，并在有或没有FGF2的情况下培养3天。

　　如前所述，经过小幅度调整后生成类有机物(24)简单地说，低附着性U型底部96孔板涂有5%的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。用胰蛋白酶表达分离iPSCs（Invitrogen，12605028），并将6000个细胞接种在添加50μM Y-27632（细胞引导系统，SM02）的E8培养基中。每隔一天更换一次介质。在第5天，将培养基改为类器官诱导培养基：DMEM/F12（Invitrogen，11320074）、0.5%N2（自制，见上文）、1%B27（Invitrogen，17504044）、1%谷氨酰胺（Invitrogen，35050038）、1%NEAA（Invitrogen，11140035）、4.44 mM葡萄糖（Roth HN06.2）、肝素（10μg/ml）（Sigma-Aldrich，H3149）、胰岛素（100 ng/ml）（Sigma-Aldrich，91077C），50μMβ-巯基乙醇（Invitrogen，31350010）、200 nM LDN193189、500 nM A83和2μM XAV 939。每隔一天更换一次介质。第10天，将类器官包埋在凝胶剂：培养基的3:2混合物中，根据(25)此后，将LDN193189、A83和XAV 939从培养基中取出，将类有机物培养在6厘米厚的Pluronic培养皿中，培养基每3至4天更换一次。在胚状体形成后第20天分析类器官。

　　对于HES1报告系的产生，同源臂与DNA序列相对应赫斯1从基因组DNA中扩增出终止密码子周围的基因，并用经典的分子克隆方法克隆到pBluescript主干（Addgene，#72835）。这个T2A型在帧中添加序列（gaggggaggaaggagtcttctaacatgcgtgacgtgaggagaatcccgcccct），然后番茄还有一个NLS-害虫顺序。各自的序列是从Cytbow vector（来自Livet实验室的礼物）中扩增出来的，发表于(26)]来自HES5报告者vector（恩里克实验室的礼物，发表于(27)]分别是。用于扩增的引物是从综合DNA技术公司订购的：赫斯15′同源臂，（5′-cgtgattcctgggggtcatggtttag-3′和5′-gttggcgcgcgcgctgtcgtgacgtccgcgcgcgcgcgctc-3′），赫斯13′同源臂，番茄（5′-tgcaccggtatggtgagcaagcaaggg-3′和5′-acggagtcgtaacgcgtgtacgctcgtccatg-3′），以及NLS-害虫（5′-tgcacgcgtcctccaaaaagagagagaaag-3′和5′-tcggagctcctaccatattgatcctagcag-3′）。对于指导RNA，以前发表的序列是针对最后一个外显子赫斯1(28)寡核苷酸从集成DNA技术公司购买并克隆到pSpCas9（BB）-2A Puro（PX459）v2中。0（Addgene，#62988）遵循分销商协议。

　　根据制造商的协议，使用核受体2b和细胞系核受体试剂盒V（Lonza，VCA-1003）对iPSCs进行核感染。简单地说，Ctrl#2-IPSC用胰蛋白酶表达（Invitrogen，12605028）处理并计数，106个细胞在300℃离心g5分钟。将颗粒重新悬浮在82μl核子受体溶液V、18μl补充1和1μg每个质粒中。用于核感染的程序是B-027。细胞在不含青霉素链霉素的E8培养基和5μM Y-27632（细胞引导系统，SM02）中培养。核感染后1天，向培养基中加入嘌呤霉素（0.33μg/ml）（EMD微孔，#540222）。24小时后，将培养基换成含青霉素链霉素、嘌呤霉素和Y-27632的E8培养基。分别于感染后274天和634天从培养基中取出核仁。当菌落达到合适的大小后，人工将克隆体放入48孔平板中。克隆经基因分型和测序证实。

　　免疫荧光染色时，将神经干细胞分裂到玻璃盖玻片上，玻片经盐酸预处理后涂以聚乳酸-我-赖氨酸（PLL）（100μg/ml；Sigma-Aldrich，P2636）溶于25 mM硼酸（pH 8.4）和层粘连蛋白（2.5μg/ml）（Invitrogen，23017015）。为了标记脂质筏，在固定前用CTB（10μg/ml）在4℃下处理1小时。细胞在4%多聚甲醛（PFA）中固定10min，PBS洗涤，PFA反应在PBS中25mm甘氨酸中猝灭10min。在PBS中再次洗涤后，用0.1%皂甙或0.3%Triton X-100的10%胎牛血清（Invitrogen，10270106）阻断和渗透1小时。主要抗体在4°C的封闭溶液中培养过夜。以下主要抗体用于Triton X-100渗透性：HuC/D（1:500；Thermo Fisher Scientific，A-21271）、Sox2（1:500；细胞信号技术，3579）、Tubb3（1:1000；突触系统，302 304）、Nestin（1:600；研发系统，MAB-1259），2014年10月3日（1:600；圣克鲁斯生物技术公司，sc5279），和SSEA4[1:600；发育研究杂交瘤库（DSHB），MC-813-70）。皂甙渗透用于以下主要抗体：LAMP1（1:400；DSHB，H4A3）、CD63（1:400；ExBio-Praha，11-343-C100）、EEA1（1:100；细胞信号技术，48453）、LC3（1:100；细胞信号技术，12741）、Rab5（1:100；细胞信号技术，46449）、Rab7（1:100；细胞信号技术，9367）、Rab11（1:100；细胞信号技术，5589）、Sara/ZFYVE9（1:100；Sigma-Aldrich，HPA065852）、Notch1（1:200；细胞信号技术，4380）、Notch1（1:100，DSHB bTAN 20-c）、Notch1ECD（1:50；BioLegend，819101）；Notch2（1:400；细胞信号技术，4530），他的标签（1:500；Biotrend，CHIS-45A-Z）。Notch1ECD的细胞外染色没有渗透性（1:50；BioLegend，819101）。盖玻片用PBS或皂甙封闭液洗涤三次，每次10min。在相应的封闭溶液中稀释二级抗体，并在室温（RT）（1:1000；全部为Invitrogen）下施加1小时。在适当的情况下，向混合物中添加ATTO 565 phalloidin（1:2000；ATTO-Tec AD，565-81）。在PBS中洗涤两步10min后，在室温下用300nmdapi复染10min。在PBS和水中两次短暂洗涤后，将盖玻片装入Mowiol。

　　在EB生成后的第20天，在4%PFA中于RT条件下固定10分钟，在PBS中洗涤三次，然后转移到PBS中的30%蔗糖中，在4℃下脱水过夜。在将10%（w/v）蔗糖和7.5%（w/v）明胶包埋在PBS中后，在冷冻恒温器中切取20μm厚的切片，保存在?20°C。解冻有机物切片后，按照上述方案使用0.3%Triton X-100渗透性对其进行处理。

　　对细胞分裂过程中的不对称蛋白分离进行定量分析z-叠加单个有丝分裂事件的图像。因此，使用配备有DFC9000 GT相机和HC PL APO 40×/0.95干法物镜（全徕卡）的徕卡DM6 B显微镜对NSC的二维培养进行成像。用HCX-PL-apo63×/1.40-0.60油镜（均为徕卡）在TCS-SP5-II共焦激光扫描显微镜上成像。Z-堆叠z2D和3D培养分别获得0.29和0.5μm的增量。根据DAPI和phalloidin信号设置子细胞的感兴趣区域（roi），并通过和强度投影测量每个子细胞的平均信号强度z-堆叠。根据二次抗体对照染色法减去背景值，然后用平均信号强度乘以细胞面积计算单个子细胞的强度和。不对称指数A计算如下

　　A=强度?∑?细胞?1?强度?∑?细胞?2强度?∑?细胞?1+强度?∑?细胞?2

　　2D时，LAMP1/CD63信号强度之和较高的子细胞设为1细胞。因此，不对称指数的范围从0（表示完全对称）到1（表示完全不对称的蛋白质分布）。Notch1的不对称指数范围为?1到1，其中正值表示与LAMP1在同一细胞中的分离，负值表示与相反子细胞的分离。在3D中，细胞1被定义为根尖较多的子细胞。在平面细胞分裂中，细胞1和2的分配是随机的。为了分析囊泡数的不对称分离，ComDet v0。4.1 ImageJ插件(29)并用类似于上述公式计算不对称指数。

　　对于活细胞配体内化，重组DLL1-6xHis（研发系统，1818-DL-050）根据制造商的协议用pHrodo iFL Green（Thermo Fisher Scientific，P36015）标记。简单地说，将50μg重组蛋白重新悬浮在100μl ddH中2O、 并添加10μl 1 M碳酸氢钠。添加6.1μl 2 mM pHrodo溶液后，将混合物在RT下孵育15分钟，并使用所提供的柱纯化标记蛋白。神经干细胞生长在PLL层粘连蛋白包被的ibidi板上（涂层见“免疫荧光染色”一节）。成像前，将细胞在成像缓冲液中平衡30分钟【140 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM Hepes和10 mM葡萄糖（pH 7.4）】。平衡期间，向缓冲液中添加0.1 nM LysoTracker深红色、50μM dynasore或0.1%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）。然后，将佛罗多标记的DLL1-6xHis以1:5的比例直接加入到显像缓冲液中，在加入配体后5min开始成像。细胞内部化用配备Axiocam 506（均为卡尔蔡司）的CellDiscoveryer 7显微镜成像，细胞保持在37°C和5%CO2在整个图像采集过程中。采用平面无色差50×/1.2水自动校正物镜（卡尔蔡司），一台7μmz-添加DLL1后，每隔2.5分钟至1小时，以0.5μm的增量进行堆垛。对于kymographs，使用TCS SP5 II显微镜和63×/1.40油物镜（徕卡）进行额外的共焦活体细胞成像，成像过程中物镜表保持在37°C，在加入标记配体后，每10秒对细胞成像1小时。

　　对于免疫染色，将人重组DLL1-6xHis（Sino Biological，11635-H08H）稀释至10μg/ml的培养基中，并添加到盖玻片上生长的神经干细胞中（关于涂层，请参见“免疫荧光染色”一节）。细胞在37°C和5%CO下进一步培养30分钟2使配体内部化。为了去除残留在细胞表面的配体，然后用冰醋酸缓冲液【200mm醋酸和500mm NaCl（pH 2.0）】在冰上冲洗5 min。细胞固定在4%PFA中，进行免疫荧光处理。用HCX-PL-apo63×/1.40-0.60油物镜（均为徕卡）在TCS-SP5-II共焦激光扫描显微镜上获得具有代表性的图像。

　　为了分析受体内吞作用，神经干细胞在固定前用50μM dynasore或0.1%（v/v）二甲基亚砜处理1小时，并进行免疫荧光染色（见上文）。Z-用leicadm6b显微镜和DFC9000-GT相机和HC-PL-apo40×/0.95干法物镜（全徕卡）获得0.29μm的堆积体。在Leica applicationsuitex软件（leicaapplicationsuitex）中实现的小体积计算清除算法降低了背景荧光。这项分析是针对每种情况和使用ImageJ插件EzColocalization在10张图像上对总共60个细胞的最大强度投影进行分析(30)。LAMP1和Notch1的阈值分别基于前10%和20%的像素设置。roi被手动设置在细胞的细胞质周围，不包括分析的细胞核。三个独立实验的结果被汇集在一起。

　　为了测定TD番茄的半衰期，用100μM环己酰亚胺处理HES1报告神经干细胞。在加入环己酰亚胺后直接开始成像，每隔10分钟观察10小时。为了分析溶酶体酸化对Notch信号的影响，将来自HES1报告系的NSCs与野生型Ctrl#2-NSCs以1:10的比例混合。在开始成像之前，直接加入0.1%DMSO、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM Leu。每12小时追踪一次细胞。

　　对于这两个实验，使用了带有Axiocam 506的CellDiscoveryer 7显微镜和一个平面无染色质20×/0.7自动校正物镜（全卡尔蔡司），并将细胞保持在37°C和5%CO2对每个核的背景进行人工和强度分析。在棱镜6（GraphPad）上计算指数拟合曲线。

　　为了显示溶酶体不对称性并跟踪子细胞中HES1的表达，HES1报告型NSCs与野生型Ctrl 2-NSCs以1:10混合，并接种在PLL层粘连蛋白涂层的3.5 cm ibidi培养皿上。细胞培养3天，在实验当天用75nm诺可达唑使细胞同步化。4小时后，广泛冲洗细胞，并加入含有0.1nm LysoTracker深红色的新鲜培养基。清洗30分钟后，使用配备Axiocam 506的CellDiscoveryer 7显微镜开始活体细胞成像。在最初的1.5小时内，用平面无染色质50×/1.2水自动校正物镜（Carl Zeiss）对有丝分裂事件进行成像，每200秒成像7μmz-以0.5μm的增量堆叠。随后，用20×0.95自动校正仪（Carl-Zeiss）对子代细胞进行了为期14小时、帧间10min的跟踪。

　　活细胞成像期间的LysoTracker信号被视为免疫染色的总强度值，据此计算不对称指数，并将cell1定义为具有较高LysoTracker信号的子细胞（另见不对称量化部分）。HES1的表达被追踪为TD番茄信号的强度，其量化如HES1报告者稳定性一章所述。此外，TD番茄的强度为z-在每个实验中，通过将cell2的第一个时间点设置为0对单个时间序列进行归一化，并根据它们的百分比秩重新调整归一化数据。根据每个时间点的标准化和排序数据以及原始数据，使用以下公式计算子细胞对内荧光强度的差异

　　强度?∑?细胞?1(t)?强度?∑?细胞?2(t)强度?∑?细胞?2(t)

　　所有这些分析都是在Excel（Microsoft）中进行的。在聚类方面，使用RStudio中的time-courseinspector包将两个子单元的时间序列连接起来并进行分析(15)聚类是基于完整时间序列的欧几里德距离。通过目测每个聚类的平均值，将聚类数设为6。簇被分组来表示对称、反对不对称、轻微不对称和高度不对称的HES1表达模式。

　　如前所述，从2×10-cm培养皿中获取神经干细胞并用低张休克裂解(14)简单地说，用0.5×蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，A32955）在PBS中清洗细胞，从培养皿中刮出，在200℃下离心g5分钟。用低渗缓冲液[3 mM咪唑（pH 7.4）、1 mM EDTA和1×蛋白酶抑制剂]短暂洗涤小球，并在200℃下离心g并在4℃下保持10分钟。然后，将颗粒重新悬浮并在低张条件下在冰上保持15分钟。添加蔗糖缓冲液[500 mM蔗糖、3 mM咪唑（pH 7.4）、1 mM EDTA、0.06 mM环己酰亚胺和1×蛋白酶抑制剂]，通过穿过22号针10次来裂解细胞。在2000年用离心法将细胞核颗粒化g4℃处理10min，将核后上清液转移到10～50%的蔗糖梯度上。细胞内囊泡在200000℃超速离心16hg收集20个组分，每个组分500μl，用Western blot分析每个组分的40μl。

　　对于缺口切割分析，在0.1%（v/v）二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，D5879）、20μM DAPT（细胞引导系统，SM15）、100 nM BafA（VWR International，J61835.MX）或200μM Leu（SERVA电泳股份有限公司，51867.02）的存在下培养2小时；用PBS清洗；在放免沉淀试验缓冲液中[50 mM tris HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.2%Triton X-100、25 mM EDTA、0.2%十二烷基硫酸钠和1×蛋白酶抑制剂]在冰上裂解1小时。使用20%占空比、50%输出和七个脉冲对样品进行超声处理，并在16000下离心g并在4℃下保持15分钟。上清液中的蛋白质浓度通过皮尔斯BCA蛋白质分析法测定（Thermo Fisher Scientific，23227）。

　　将20微克蛋白质裂解物或40μl蔗糖梯度分数稀释在6×蛋白质样品缓冲液中【375 mM tris（pH 6.8）、6%十二烷基硫酸钠、6%甘油、9%β-巯基乙醇和0.03%溴酚蓝】中，并在95°C下培养5分钟。在非还原条件下处理分析CD63的蔗糖梯度部分，即：。，采用不含β-巯基乙醇的6倍缓冲液。使用tris-tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在110V下分离2-3小时，并使用Trans-Blot TurboTM转移系统（Bio-Rad）在1a时转移到0.2-μm硝化纤维素膜上45分钟。用5%奶粉在tris缓冲盐水中用吐温（TBS-T）封闭1小时。在封闭溶液中稀释主要抗体，并在4℃下培养过夜。在TBS-T中清洗膜三次，在TBS-T中RT培养1小时。用TBS-T再次清洗膜三次，并在奥德赛成像仪（Li-COR）上成像。使用以下主要抗体：Notch1（1:1000；细胞信号技术，4380）、Notch1裂解（1:1000；细胞信号技术，4147）、早老素1（1:1000；BioLegend，823404）、EEA1（1:1000；细胞信号技术，3288）、Sara/ZFYVE9（1:1000；Sigma-Aldrich，HPA065852）、LAMP1（1:1000；细胞信号技术，9091），CD63（1:200；ExBio-Praha，11-343-C100）和肌动蛋白（1:10000；细胞信号技术，3700）。使用的次级抗体是抗兔染料800、抗鼠染料680和抗鼠染料800（均为1:15000；全细胞信号技术，5151、5470和5257）。

　　通过剥离和重制对一层膜进行缺口劈裂分析。用剥离缓冲液[25 mM甘氨酸（pH 2.0）]反复孵育5分钟和40分钟，去除Notch1裂解抗体。用TBS-T清洗剥离膜三次，从膜封闭开始用Notch1抗体重复染色程序。

　　使用ImageJ中的密度分析进行量化。因此，在每个车道周围设置roi，并分析背景信号强度。对于缺口劈裂的分析，劈开缺口1的信号被归一化为相应的总缺口1信号，总缺口1水平被归一化为肌动蛋白。为了分析蔗糖梯度，将每个蛋白质的组分标准化为蛋白质含量最高的相应组分。每个实验分析三到四个生物复制品。

　　在PEQGOLD-TriFast（VWR）中收获nsc，并根据制造商的方案分离RNA。简而言之，细胞裂解后加入氯仿，混合物在室温下培养15分钟，在12000下离心g5min使不同相分离，并向水相中添加异丙醇。RNA在?20°C，转速降到12000g在用75%乙醇洗涤两个步骤后15分钟，将RNA颗粒风干并在焦碳酸二乙酯处理过的水中再悬浮。用脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，AMPD1）处理去除基因组DNA污染。根据制造商的协议，使用iScript互补DNA（cDNA）合成试剂盒（Bio-Rad，1708891BUN）来生成cDNA。用定量PCR（qPCR）定量检测10μM DAPT、100nm BafA或0.1%（v/v）DMSO处理2小时后NSCs中Notch靶基因的表达。使用了以下引物（所有整合的DNA技术）：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′和5′-tgagggtcattggca-3′），赫斯1（5′-aaaaaa-ttcctcgtccggt-3′和5′-ggctttgactttctgtgct-3），赫斯5（5′-tgagcaagcagcaagctctc-3′和5′-gcagcacaggagtag-3′），以及嗨1（5′-TAATTGAGAAGCGCCGACGA-3′和5′-GCTTAGCATCCTGCTTCT-3′）。使用QuantStudio 7 Flex（Thermo Fisher Scientific）和GoTaq DNA聚合酶（Promega M780B）进行分析。ΔΔCt应用方法，将感兴趣基因的表达标准化为GAPDH公司表达式(31).

　　在Prism 6（GraphPad）中进行统计分析，显著性水平设置如下：*P<0.05**P<0.005，以及***P<0.001；不重要（不重要），P>0.05。每种生物复制结果至少如图所示。一个样品t检验、单/双向方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验与Bonferroni或Dunn的多重比较检验一起应用，如每个图图例所示。图形是用Prism 6（GraphPad）生成的，示意图表示在无花果。4和5图S1是借助于生物钟。通用域名格式.