NAD+充盈拯救女性生育 生殖老化
d、NAD（P）H下降与生殖老化过程中的卵母细胞功能障碍有关
d经NMN处理可恢复卵母细胞质量和受精能力
在老年小鼠中
d在胚胎培养基中添加NMN可改善胚胎发育
发展里程碑
d SIRT2过表达模拟NMN的益处，但不太可能
调解其影响
摘要雌性哺乳动物的生殖老化是一个不可逆的过程，与卵母细胞质量下降有关，卵母细胞质量下降是生殖能力的限制因素。在这里，我们表明随着年龄的增长，卵母细胞质量的下降伴随着显著的代谢辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平的下降。用NAD+代谢前体烟酰胺单核苷酸（NMN）治疗可使老龄动物的卵母细胞质量恢复，导致生殖能力的恢复，这可以通过NAD+依赖性脱酰酶SIRT2的转基因过度表达来重现，尽管这种酶的缺失不会损害卵母细胞质量。NMN的这些益处延伸到发育中的胚胎，补充NMN可以逆转母亲年龄对发育里程碑的不利影响。这些发现表明，晚期NAD+水平的恢复代表了拯救哺乳动物雌性生殖功能的机会。导言因此，孕产妇年龄的增长和随后的不孕迅速成为计划生育的一个重大挑战哺乳动物雌性生殖能力不可逆转的下降。成功怀孕的限制因素是卵母细胞质量，从人类生命的第三个十年后期开始显著下降（De Vos等人，2014年；Sauer，2015年）。尽管需求量巨大，但在老化过程中，没有临床上可行的策略来保持或恢复卵母细胞的质量，这取决于卵母细胞支持减数分裂成熟、受精和随后的胚胎发育的能力。在老化过程中，维持或恢复卵母细胞质量的非侵入性药物治疗将缓解随着年龄增长而导致的怀孕率限制障碍，这一障碍推动了对辅助生殖技术（ARTs）的需求，如具有侵入性的体外受精（IVF），具有健康风险（Kumar et al.，2011），价格昂贵，成功率有限。尽管体细胞组织通过自我更新的前体干细胞群体的更替进行持续再生，但卵巢中的卵母细胞是在人类子宫发育过程中形成的，在子宫发育过程中，卵母细胞形成了一个不进行自我更新的有限池。因此，卵母细胞极易发生与年龄有关的功能障碍。随着年龄的增长，卵母细胞质量下降的分子基础包括基因组不稳定、线粒体生物能减少、活性氧（ROS）增加以及纺锤体装配检查点（SAC）监测系统功能受损导致的减数分裂染色体分离障碍（Franasiak et al等人，2014年；Greaney等人，2018年）。随着年龄的增长，导致卵母细胞染色体错误分离的分子原因尚不清楚，因此，目前还没有研究结果
药理学策略来纠正这个问题。了解这种缺陷的分子或代谢基础可能导致治疗，可以维持甚至挽救女性生育能力随着年龄的增长。
代谢物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）是一种重要的氧化还原辅因子和酶底物，对能量代谢、DNA修复和表观遗传稳态至关重要。随着年龄的增长，这种必需的辅助因子在体细胞组织中的水平会下降（Massudi等人，2012年），而通过NAD+代谢前体的治疗来逆转这种下降，作为一种维持晚年健康的治疗方法，已经引起了人们的关注（Mills等人，2016年；Rajman等人，2018年）。在这里，我们证明了卵母细胞中NADH及其磷酸化形式NADPH的自体荧光随着年龄的增长而下降，并且我们描述了NAD+的作用以及NAD+消耗酶SIRT2作为生育介质的潜在作用，这些都是开放的药物干预。
结果
我们试图确定卵母细胞中的NAD+是否随着年龄的增长而下降，导致不孕和卵母细胞质量下降，以及是否可以通过NAD+前体烟酰胺单核苷酸（NMN）治疗逆转这种情况（Yoshino等人，2011年）。为了解决这些问题，我们使用了8个月大左右由于卵母细胞缺陷（与人类相似）导致生育能力开始下降的小鼠（Greaney et al.，2018）。由于测量单个卵母细胞中NAD+水平的生物分析挑战，我们使用了利用NADH和NADPH自身荧光的高光谱显微成像技术（Dong等人，2019；Kolenc和Quinn，2019）。12个月大的雌性用饮用水中的NMN（2 g/L）处理4周，然后回收成熟的中期II（MII）卵母细胞，并进行自体荧光的多光谱显微镜成像，以确定天然荧光团的相对丰度（图1A）。与我们的假设一致，我们发现老年动物卵母细胞中的NAD（P）H水平与年轻（4-5周龄）动物相比下降，NMN处理增加了老年动物卵母细胞中的NAD（P）H水平（图1B）。接下来我们试图确定这种趋势是否发生在整个卵巢，而不是卵母细胞中。使用质谱法，我们没有观察到整个卵巢NAD（H）水平随年龄的下降（图1C），这表明卵母细胞代表了卵巢的一个特别脆弱的亚单位，该亚单位受到年龄相关的NAD+下降的影响，而周围的基质构成了卵巢组织的大部分。与单个卵母细胞的高光谱成像数据一致，NMN治疗增加了整个卵巢中的NAD+水平，正如系统分娩后所预期的那样（图1D）。
为了测试卵母细胞NAD+水平的年龄相关性下降是否会改变卵母细胞质量，我们用饮用水（2 g/L）中的NMN处理14个月大的雌性动物4周，而对照动物在没有NMN的情况下保持在相同的饮用水中。从妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）刺激的动物卵巢中收集的生发泡期卵母细胞（GV）经体外成熟至MII期，并进行免疫染色以评估纺锤体结构和染色体排列，评估这种干预对卵母细胞质量的影响。NMN处理主轴组件（图2A）。在用PMSG和人绒毛膜促性腺激素（hCG）过度刺激C57BL/6JAusb小鼠的卵巢以从输卵管获得MII卵母细胞，以及单独用PMSG过度刺激瑞士白化小鼠以直接从刺穿的卵巢获得GV期卵丘卵母细胞复合体（COC）后，老年动物的卵母细胞产量也增加（图2B和2B）2C）。为了进一步测试NAD+生物合成的重要性，我们获得了组成性过度表达NAD+生物合成酶NMNAT1或NMNAT3（图2D和2E；图S1；Yahata等人，2009）的转基因小鼠菌株，它们分别定位于细胞核或线粒体（Berger等人，2005）。这些动物卵巢组织中的NMNAT1和NMNAT3水平升高，尽管这些蛋白不能通过westernblot在卵母细胞中检测到，很可能是因为从与其他组织相关的卵母细胞中获得的低蛋白浓度。与NMN处理一样，12至14个月大的Nmnat1Tg/+动物（而非Nmnat3Tg/+动物）产生的卵母细胞比野生型同窝动物多（图2D和2E），表明NAD+生物合成的亚细胞定位对卵泡和卵母细胞功能很重要。为了测试减数分裂成熟过程中NAD+生物合成的需求，我们用FK866（NAD+生物合成酶NAMPT的抑制剂）处理GV期卵母细胞（Hasmann和Schemainda，2003），并评估减数分裂进程（图S2）。FK866处理可减缓生发泡破裂（GVBD）和极体挤出（PBE），这与NAD+合成对卵母细胞功能至关重要的观点一致。
接下来，我们试图确定晚期NMN治疗是否能提高卵母细胞的发育潜能。12个月大的动物用NMN处理4周（2 g/L，饮用水），在PMSG和hCG刺激下从输卵管收集MII卵母细胞。NMN处理的老龄（12个月大）动物的卵母细胞直径较大（图2F），这可能与直径较小的卵母细胞与IVF后较差的结局有关（Atzmon等人，2017年；Marquard等人，2011年）。一个单独的卵母细胞队列接受IVF，在第6天，评估达到囊胚形成的胚胎比例（图2G），有提高囊胚形成率的趋势。接下来，我们试图确定体内NMN治疗是否会改变随后的囊胚内细胞团发育，这是妊娠成功的高度预测因素（Lane和Gardner，1997）。12个月大的小鼠在饮用水中用NMN处理2、7、14或28天，卵母细胞接受IVF。第6天，对胚胎进行内细胞团的差异染色。动物接受NMN治疗的时间长短与内细胞质量大小的改善相关（图2H），为了证实这转化为生育能力的改善，我们在引入已证实生育能力的雄性动物之前，用两种不同剂量的NMN（饮用水，0.5和2 g/L）治疗了一组13个月大的动物4周。根据怀孕、活产和产仔数确定的繁殖性能，然后在接下来的9周内，从14-16个月的年龄进行评估（图2I-2M）。NMN治疗改善了首次活产的时间（图2J）
图1。卵母细胞NAD+水平随年龄增长而下降，NMN处理后升高
（A和B）多光谱成像（A）测定年轻（4-5周龄）或老年（12月龄）小鼠接受NMN（饮用水，2 g/L，4周龄）治疗后卵母细胞中NAD（P）H含量（比例尺为20 mm），在（B）中定量（单因素方差分析1.454（2，71），*P=0.0165，0.0287通过Dunnett多重比较试验，n=21-27个卵母细胞/组）。
（C和D）整个卵巢的质谱分析（C）显示，在1个月龄和14个月龄之间NAD（H）水平没有变化（每组6只小鼠）；但是，（D）NMN增加了14个月龄小鼠的卵巢NAD（H）（400 mg/kg口服灌胃后1小时，*p=0.0123，**p=0.0072，双尾t检验，每组20只小鼠）。
以及在繁殖试验期间获得活产的动物的总比例（图2K），尽管这令人惊讶地发生在低剂量NMN（0.5 g/L）下，这表明以前的实验是在有益于卵母细胞质量的剂量下进行的，但可能会对生育的其他方面产生不利影响。这可能与NMN耐受性的上限或NMN降解产物烟酰胺的形成增加有关，烟酰胺是一种sirtuin抑制剂（Bitterman等人，2002）。这些来自正交药理学和遗传学方法的数据表明，增加NAD+可提高排卵率，卵母细胞
图2。NMN治疗可恢复卵母细胞质量、卵泡动力学、胚胎发育和活产率
（A） NMN治疗（饮用水，2 g/L，4周）14个月后用NMN恢复免疫染色卵母细胞中的纺锤体组装（b-微管蛋白呈绿色，Hoechst表示DNA呈蓝色，着丝粒呈红色，Fisher精确检验p=0.0503，每组n=23–25）。带有滞后染色体的无序纺锤体用箭头表示，带有沿中期板排列的DNA的正常桶形双极纺锤体用箭头表示。
（B和C）年龄（12月龄）C57BL/6JAusb小鼠（p=0.0211，双尾t检验，每组n=29-30只）和（C）14-16月龄瑞士白化小鼠（Kruskal Wallis 16.31，***p=0.0004，*p=0.0295，Dunnett多重比较试验，每组n=4-11只）卵巢刺激后的卵母细胞产量。
（图例续下页）
尽管他们指出了一个最佳的剂量范围，但老年雌性小鼠的质量和总活产率。
考虑到这项工作的临床转化潜力，评估这种治疗是否会对母体NMN暴露后后代的健康或发育产生不利影响是很重要的。在交配前、怀孕期间和整个哺乳期，来自另一组动物的后代维持较高剂量的NMN（2 g/L），以正常饮食或高脂肪喂养来确定其健康和发育。评估动物的生理和行为变化（图S3）。母亲接触NMN后没有变化，只是母亲接受NMN治疗后瘦体重略有增加（图S3D）。这些数据与最近的研究（Ear等人，2019年）一致，表明在哺乳期服用NAD+前体烟酰胺核糖（NR）并无危害，并可能改善后代健康。
接下来，我们试图确定这些好处的调节机制。我们假设这个角色的一个候选者是NAD+依赖的脱酰基酶SIRT2。我们之前的研究表明，SIRT2稳定了SAC蛋白BubR1（North等人，2014），该蛋白对卵母细胞减数分裂进程（Homer等人，2009）、着丝粒附着和染色体分离至关重要（邱等人，2018；Touati等人，2015；Zhang等人，2014）。随着年龄的增长，小鼠生殖组织（North等人，2014）和人类卵母细胞中BubR1的水平下降（Riris等人，2014）。SIRT2通过Cdc20和Cdh1的脱乙酰化来维持基因组的稳定性，Cdc20和Cdh1是维持后期促进复合物活性所必需的（Kim等人，2011），后者是一种重要的卵母细胞调节器（Homer，2013；Jin等人，2010）。
为了测试SIRT2是否能够重现NMN治疗的益处，我们获得了一株Sirt2Tg/+小鼠（North等人，2014），该小鼠在所有组织（包括卵母细胞）中过度表达SIRT2（图S4A），并评估了14个月大时的卵母细胞质量。与我们之前的实验一样，对卵母细胞进行免疫染色以评估纺锤体结构和染色体排列。正如预期的那样，70%以上的野生型（Sirt2+/+）动物的卵母细胞具有明显的纺锤体紊乱和染色体排列不良（图3A和3B），而80%的Sirt2转基因动物的卵母细胞具有明显的纺锤体紊乱和染色体排列不良（图3A和3B）
（Sirt2Tg/+）窝仔鼠表现出正常的桶形双极纺锤体和排列良好的染色体。PMSG刺激后，从老化的Sirt2Tg/+卵巢获得的COC数量是Sirt2+/+同窝仔鼠的两倍（图3C）。考虑到纺锤体完整性和染色体排列对染色体分离的重要性，我们接下来测试了来自老年Sirt2Tg/+动物的卵母细胞是否不易发生非整倍体，这是来自老年女性的劣质卵母细胞的一种致病组学特征。可以预见的是，非整倍体率随着年龄的增长而增加，在Sirt2+/+野生型卵母细胞中，非整倍体率从3个月大时的15%增加到16个月大时的43%，而在年龄较大的Sirt2Tg/+同窝卵母细胞中，非整倍体发生率为20%，与年轻女性相当（图3D）。氧化应激是卵母细胞老化和女性不育的关键驱动因素（Agarwal等人，2012年）。SIRT2脱乙酰化并维持戊糖磷酸途径酶G6PD的活性（Wang等人，2014），该酶通过产生NADPH再生抗氧化剂谷胱甘肽。与野生型卵母细胞相比，来自老龄动物的Sirt2Tg/+卵母细胞显示出显著降低的ROS水平，这是通过在年轻（5-6个月大）未受挑战（图3E和3F）和H2O2挑战的条件下（图S4D和S4E）用ROS敏感荧光染料H2DCFDA染色确定的。与这些数据和我们的假设一致，我们观察到Sirt2Tg/+卵母细胞中G6PD酶活性增加（图3G）。
鉴于老年Sirt2Tg/+动物卵母细胞特征的改善，我们试图确定这是否转化为生育能力的提高。从15个月大开始，对动物进行繁殖试验，以确定怀孕率。与这个年龄的低生育率一致，只有25%的野生型Sirt2+/+雌性在5轮交配中怀孕，而Sirt2Tg/+雌性的怀孕率增加了三倍，达到75%（图3H）。这些数据表明，NAD+依赖性脱酰酶SIRT2足以维持卵巢功能和女性在衰老过程中的生育能力。
尽管这些数据表明SIRT2足以概括NMN对生育的益处，但我们接下来试图确定SIRT2是否也是通过使用SIRT2/敲除动物维持正常卵母细胞功能所必需的。全身Sirt2/基因敲除小鼠在5-6个月龄时的卵母细胞显示出正常的纺锤体组装和成熟（图3I），表明在NAD+充满的较年轻年龄，Sirt2对于精确的纺锤体组装不是必需的，或者Sirt2的作用与其他尚未确定的因素存在冗余。这些来自Sirt2基因敲除动物的体内结果与体外研究形成对比（邱等人，2018年；Riepsamen等人，2015年；Zhang等人，2014年）。总之，
（D和E）与过度表达NMNAT3的转基因小鼠（n=7-11）相比，年龄（12-14个月大）过表达NMNAT1的转基因小鼠的卵母细胞产量增加（*p=0.0416，双尾t检验，每组n=8-10）（D）。
（F） 老年（12个月大）或年轻（4-6周大）C57BL/6雌性（F（2,71）=8.504，***p=0.0002，*p=0.0332，通过Dunnett多重比较试验，n=21-27个卵母细胞）接受NMN处理（2 g/L，饮用水，4周）后的卵母细胞直径。
（G） 在一个平行队列中，卵母细胞用于IVF，在胚胎发育的第6天形成囊胚（每个数据点是一个独立实验的累积数据）。
（H） 12月龄C57BL/6雌性大鼠在饮用水中用NMN（2g/L）处理指定时间，MII卵母细胞接受IVF。在第6天，评估内细胞质量（Kruskal Wallis 11.93，*p=0.0337，通过Dunn多重比较试验，n=8–26个卵母细胞/组）。先前未经治疗的13个月龄C57BL/6雌性（每组15–17只）在饮用水中用两种剂量（0.5和2 g/L）的NMN治疗4周，随后引入一只雄性，并在接下来的9周内评估繁殖性能。
（I–M）繁殖性能通过（I）累计怀孕时间，（J）累计活产时间（对数秩检验，**p=0.0059），（K）实现活产的总比例（Fisher精确检验，*p=0.0253 ctrl vs 0.5 g/L NMN），（L）随时间累积出生的幼崽数（重复测量ANOVA，NMN F（2，43）=4.925，p=0.0119，Dunnett多重比较ctrl与NMN 0.5，****p<0.0001，误差线显示SEM），以及（M）每只雌性幼崽的总数量（Kruskal Wallis 9.220，p=0.0100，Dunn多重比较，*p=0.0491 ctrl与0.5 g/L NMN）。
图3。SIRT2转基因小鼠提高了卵母细胞质量
（A和B）来自14个月大的Sirt2Tg/+C57BL/6小鼠的卵母细胞进行（A）纺锤体组装的免疫染色（B-微管蛋白为绿色，Hoechst DNA为蓝色，着丝粒为红色）。带有滞后染色体的无序纺锤体用箭头表示，DNA沿着中期板排列的正常桶形双极纺锤体用箭头表示；这在（B）中定量（p=0.0131，n=10–13个卵母细胞/组，Fisher精确检验）。
（C） 老龄（14个月大）Sirt2Tg/+和野生型Sirt2+/+同窝仔鼠的卵母细胞产量（**p=0.0030，双尾t检验，n=9只/组）。
（D） 年轻（2个月大）和老年（16个月大）Sirt2Tg/+和Sirt2+/+同窝仔（n=26年轻，n=5-7岁）卵母细胞的非整倍体率。
（E–G）Sirt2Tg/+小鼠的卵母细胞通过（E）H2DCFDA染色测定ROS水平降低，在（F）中定量（****p<0.0001，双尾t检验，n=29个卵母细胞/组），并且（G）G6PD酶活性增加（**p=0.0019，双尾t检验，n=11–13，使用来自每组4只动物的每个样品的5个集合卵母细胞）。
（H） 从15个月大开始进行交配试验，以确定累积怀孕率（5轮交配后p=0.1319，n=8只动物/组，Fisher精确检验）。
（一） Sirt2/敲除动物卵母细胞中的纺锤体组装（n=6，每组14个卵母细胞）。
这些数据表明，SIRT2是足够的，但不是必需的，以提高卵母细胞质量在老化过程中。
接下来，我们询问升高NAD+是否也有利于着床前胚胎发育。为了验证这一点，体外受精是使用体内成熟的卵母细胞从生殖年龄（12个月大）或年轻（4周大）的女性。体外受精后，胚胎在有无NMN的条件下进行培养。补充NMN可改善来自老年女性卵母细胞的胚胎中的囊胚形成（图4A），但不改善来自年轻女性卵母细胞的胚胎中的囊胚形成（图4A）
A
图4。体外NMN处理促进胚胎形成
（A） 对老龄（12月龄）小鼠的卵母细胞进行体外受精，胚胎在1 mM NMN中保存至胚胎发育第6天（配对双尾t检验，第4天*p=0.0138，第5天**p=0.0086，第6天**p=0.0014，n=9个独立实验）。
（B） NAMPT抑制剂FK866治疗第6天导致胚胎死亡，可通过NAD+前体NMN、烟酸单核苷酸（NaMN）、烟酸核糖苷（NaR）和NR（Kruskal-Wallis 50.65，p<0.0001，**p<0.0001，**p=0.0048，**p=0.0197，**p=0.0004，**p=0.0014，**p=0.0156，n=每组4–21个胚胎（如图所示）。
（C） 用sirtinol或splitomicin治疗可抑制囊胚形成（补充），囊胚细胞计数减少（单因素方差分析F（6162）=22.44，***p=0.0002，***p<0.0001，通过Dunnett多重比较试验，n=5–67，如原始数据点所示）。
（D） sirtinol处理的胚胎与NMN联合治疗可挽救这种减少（Sidak多重比较试验的双向方差分析F（1,88）sirtinol=17.66，NMN=12.59，*p=0.0360，0.0374，****p<0.0001，每组n=22–23）。
（E） 用p53抑制剂pifithrin治疗可挽救用sirtinol治疗的胚胎中的细胞计数和囊胚形成（补充）（pifithrin F（2392）=22.37，sirtinol F（1392）=49.81，****通过Sidak的多重比较试验，p<0.0001，n=72–78/组）。
S5A和S5B）。为了进一步评估NMN是否能在挑战性条件下拯救胚胎发育，将幼年动物的胚胎保存在一种简单的培养基中，这种培养基会加重培养压力并限制胚胎发育（Li等人，2012年）。与老龄动物的结果一致，向简单培养基中添加NMN可提高囊胚细胞数，这是植入成功的一个指标（图S5C）。
哺乳动物细胞有能力通过几种生物合成途径和中间前体产生NAD+（图S6；Bieganowski和Brenner，2004；Nishizuka和Hayaishi，1963；Okuno和Schwarcz，1985；Preiss和Handler，1958a和1958b）。为了评估通过循环途径中内源性NMN产生的NAD+合成是否在胚胎发育中起作用，我们在NAMPT抑制剂FK866（Hasmann和Schemainda，2003）存在下培养胚胎，后者在培养第6天诱导胚泡变性（图S5D）。这可以通过NMN协同处理（图4B）以及其他NAD+前体（图4B）来挽救。相反，Priess处理酶烟酸磷酸核糖转移酶（NaPRT）抑制剂2-羟基烟酸（Piacente et al.，2017）的治疗并未影响胚胎发育（图S5E、S5F和S6）。
我们接下来试图确定NMN治疗是否通过sirtuins介导获益。小分子sirtuin抑制剂sirtinol（Grozinger et al.，2001）和splitomicin（Bedalov et al.，2001）在简单定义的培养基条件下损害了胚胎生长（Li et al.，2012；图4C；图S5G），NMN协同处理部分逆转了胚胎细胞数量的下降（图4D），这表明sirtuin不是唯一的抑制剂NMN促进着床前胚胎发育的主要靶点。由于缺乏数据证实西替诺对其靶点具有完全抑制作用，这一解释受到了影响，因为只有部分抑制才能导致部分靶点利用增加的NAD+来挽救胚胎发育。
鉴于sirtuin抑制剂降低囊胚质量的能力，我们接下来试图确定这些抑制剂限制胚胎生长的途径。sirtuins中最受关注的成员SIRT1使p53去乙酰化以抑制其活性并防止凋亡（Cheng等人，2003；Vaziri等人，2001）。与体内胚胎相比，体外受精产生的胚胎中p53活性增加，可能是由于培养应激所致，其基因缺失克服了培养对囊胚发育的影响（Li等人，2007年，2012年）。p53的激活是有害的，因为它抑制增殖并诱导内部细胞团的凋亡，进而形成发育中的胎儿（Ganeshan et al.，2010，2017；Kawamura et al.，2010）。我们观察到用p53抑制剂pifithrin治疗（Komarov等人，1999）克服了sirtinol介导的细胞数量减少（图4E）和囊胚发育（图S5H），表明p53依赖性营养不良是sirtuin介导的（Peck等人，2010）。
讨论
整个发达国家都有一种趋势，将怀孕推迟到晚年，导致对艺术的需求稳步增加。尽管母亲年龄是生殖医学面临的最大临床挑战，但目前还没有治疗方法来提高卵母细胞质量。在目前的研究中，我们发现NAD（P）H的卵母细胞水平随着年龄的增长而下降，并且证明NMN补充NAD+可以恢复卵母细胞质量，提高排卵率和生育能力。此外，在胚胎培养基中添加NMN可逆转年龄对发育的不利影响。
目前的研究支持这样一个前提：与年龄相关的NAD+可用性降低是卵母细胞质量下降和女性不孕的决定因素，而NAD+的药理学恢复为老年不孕的治疗打开了一个治疗窗口。一些问题仍然存在，包括NMN治疗如何恢复老年动物的卵母细胞质量。随着年龄的增长，卵母细胞质量下降的一个众所周知的后果是染色体分离缺陷，它主要影响第一次减数分裂（MI）。事实上，80%-90%的年龄相关胚胎非整倍体是女性MI错误的结果（Greaney et al.，2018）。准确分离染色体的能力取决于多种因素，其中包括适当的纺锤体组装和SAC对染色体分离的监测，我们和其他人已经证明，这对于防止卵母细胞中的非整倍体是至关重要的（Homer等人，2005）。关键调控因子（包括囊蛋白）的充分表达是在卵母细胞与卵巢内卵泡发育同时进行的长期生长阶段决定的；正是在这一生长阶段，卵母细胞具有转录和翻译活性，并储存卵母细胞成熟和早期胚胎分裂所需的储备，以备转录和翻译都停止时使用（Greaney et al.，2018）。这是一个对生物能量要求很高的过程，在MI的纺锤体组装阶段，小鼠卵母细胞的ATP消耗量最大（Dalton等人，2014）。在小鼠卵母细胞中，这个生长阶段在排卵前持续2-3周，而我们给予NMN 4周。尽管提高卵母细胞质量的一个解释可能与由于质量控制机制的改进而导致排卵前次优卵母细胞闭锁增加有关，但我们假设NMN治疗期的长短可以提高成熟关键阶段的卵母细胞整体质量，在整体分选或质量控制机制上没有改变，反而由于卵母细胞质量的提高而减少了闭锁。随着年龄的增长，NAD+缺乏可能通过其作为必需的氧化还原辅因子的需求阻碍能量代谢；因此，在敏感的关键阶段使用NMN治疗可以降低纺锤体装配缺陷和非整倍体的发生率。
NADH和NADPH自体荧光的高光谱成像显示卵母细胞NAD（P）H水平随着年龄的增长而下降，而同质化全卵巢的质谱分析没有显示NAD（H）水平与年龄相关的下降。这可能与卵母细胞年龄增加有关，在大多数哺乳动物中，卵母细胞是在子宫发育过程中形成的，在成年期不会发生更替，这些细胞比周围的体细胞更老。作为一种补充技术，用质谱法测定单个卵母细胞中的NAD（H）水平是理想的，因为我们无法在单细胞水平上用质谱法准确测定NAD代谢物是本研究的一个限制。
这项研究的一个意想不到的方面是，用较低剂量的NMN治疗可以提高功能性生育能力，这是通过老年动物的妊娠和活产来评估的。这可能表明，NAD+前体的剂量存在一个最佳范围，超过这个范围，生育能力的其他方面可能会受到不利影响，降低功能生育能力。这将是这项工作的临床翻译的一个重要问题，特别是考虑到像NR这样的NAD+前体可以作为补充剂免费提供。出于谨慎，我们建议希望怀孕的妇女在完成进一步研究之前不要服用这些补充剂。
本研究提示NAD+代谢组对排卵率有调节作用。我们假设排卵的这种变化是由于成熟过程中卵泡闭锁的减少，在此过程中卵母细胞表现出敏感性，如前所述，而不是卵巢储备的变化。我们并不排除NMN通过与卵巢以外的组织直接相互作用而对卵泡发育有利的可能性，因为我们通过全身给药来传递NMN。此外，其他组织也可能易受NAD+年龄相关下降的影响。
尽管NAD+是一种重要的分子，在一系列反应中用作辅助因子或底物，我们试图确定NMN对卵母细胞完整性的益处是否部分由NAD+依赖性脱酰酶SIRT2介导。体内NMN治疗的益处在很大程度上可以通过老年动物中Sirt2的转基因过度表达来概括，尽管其组成性缺失对卵母细胞质量没有不利影响，至少在这里研究的年轻动物中是如此。SIRT2通过其去乙酰化和稳定BubR1在维持微管动粒附着中发挥作用（North等人，2014；Qiu等人，2018），这一过程通过确保染色体对纺锤体的双极性取向来保障染色体分离的保真度。因此，在Sirt2Tg/+-过表达动物的卵母细胞中，动粒微管稳定性的增加可能有助于增强染色体排列和提高生育能力。这些观察结果与单独的体外研究一致，在体外研究中，卵母细胞中化学或吗啉介导的Sirt2敲除导致严重的纺锤体缺陷和染色体紊乱（邱等人，2018；Riepsamen等人，2015）。与这些研究相反，我们观察到组成性Sirt2基因敲除小鼠的卵母细胞维持正常的纺锤体组装和染色体组织，这表明Sirt2可能对卵母细胞是不必要的。这一解释受到该实验中敲除动物年龄较小的限制；确定SIRT2是否介导NMN对生育的益处的唯一方法是在年龄（12-14个月大）的SIRT2敲除小鼠中测试NMN治疗。这项研究的另一个限制是我们没有测量这些敲除动物卵母细胞中的ROS或G6PD活性。这些数据表明，在发育过程中可能存在补偿的重叠机制。sirtuins家族的其他成员与卵母细胞发育有关（Tatone et al.，2018；Zhang et al.，2016），进一步的研究旨在调查这些成员是否参与介导此处观察到的NMN治疗的益处。总的来说，我们的数据还没有表明SIRT2在介导NAD增加的益处方面的作用。增加NAD+水平反而可能通过简单地增强能量代谢而影响卵母细胞。
在证明老龄动物体内NMN处理可改善卵母细胞质量，提高排卵率和出生率后，我们进一步证明，添加NMN的胚胎培养基可改善来自老龄动物卵母细胞的胚胎发育，但不改善年轻动物的胚胎发育，支持这一干预解决了卵母细胞NAD+水平的年龄相关缺陷的观点。这一发现与体外受精的临床实践密切相关。除了卵母细胞数量和卵母细胞质量下降的年龄相关问题外，有丝分裂非整倍体（Munne′et al.，2002）和植入前胚胎发育不良（Janny和Menezo，1996）也限制了随母亲年龄增长可供移植的真倍体囊胚的数量。临床IVF中越来越倾向于囊胚期移植，这强调了达到更高级发育里程碑的重要性（国家围产期流行病学和统计单位，2016年）以及对能够改善胚胎发育的干预措施的临床需求。
尽管本研究将NMN用作NAD+前体，但其他途径的替代前体也会提高NAD+，尤其是NR（Trammell等人，2016）。我们预计，这种化合物和类似的化合物也将在卵母细胞质量和生育能力方面表现出功效，而且这些作用不太可能是NMN独有的。这项工作代表了一个临床上易于处理的药物干预非侵入性治疗女性不孕症所造成的损失卵母细胞的生存能力在生殖年龄的女性，具有重要的临床意义。我们设想这项工作可能会导致发展口服疗法，提高卵母细胞质量的自然受孕或体外受精。此外，这项工作可以通过改善胚胎培养条件和发育结果来提高现有体外受精方案的成功率。任何能提高生育能力的干预措施都能节省成本，降低体外受精失败或不孕带来的情绪压力，这些压力会导致长期的心理和社会问题，包括抑郁和关系破裂。这可能是一种干预措施，使卵母细胞质量差的妇女能够以自己的基因组成生育孩子，因为目前，这些妇女除了使用捐献的卵母细胞外别无选择。未来的研究应致力于在临床环境中测试NAD+升高化合物，作为口服治疗和胚胎培养基的添加剂，以评估这些发现与人类不育的相关性。虽然有希望，但在这些临床研究完成之前，我们警告不要使用NAD+升高补充剂。
星+方法
本文的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：
d关键资源表d主要联系人和材料可用性d实验模型和主题详细信息d方法详细信息
B卵巢刺激、收集卵母细胞用于体外成熟和纺锤体评估（图1和图2）
B单雌醇处理和倍性鉴定
B卵母细胞采集和共聚焦成像-DCFDA染色
体外受精与胚胎培养
B G6PD活性
B NAD+测量
B高光谱成像d量化和统计分析d数据和代码可用性d额外资源
有关补充信息，请访问https://doi.org/10.1016/j。celrep.2020.01.058号文件。
由澳大利亚国家健康和医学研究委员会（NHMRC）（APP1103689、APP112484、APP1139763、APP1044295、APP1066172和APP1127821）和澳大利亚研究委员会（ARC）（DP170101863和CE140100003）资助。在R.B.G.和L.E.W.实验室工作的M.J.B.和D.M.G.的工资和实验费用部分得到了从Jumpstart Fertility到新南威尔士州的赞助研究合同的支持。K.S.是Jumpstart生育公司的员工。我们非常感谢新南威尔士州生物资源中心的援助。本文的图形摘要是使用BioRender创建的。我们要感谢匿名捐赠者的慈善支持。
L.E.W.，H.A.H.，和D.A.S.构思了这项研究并获得了资助。L.E.W.，H.A.H.，D.A.S.，R.B.G.，K.A.W.，C.O.，M.J.M.，和E.G.设计和监督实验，分析和解释结果。W.-H.J.H。，
D.R.L.，M.J.B.，D.M.G.，A.H.R.，K.S.，W.-G.N.L.，A.S.A.W.，D.R.，C.L.，J.M.，N.A.Y.，L.L.，R.M.W.，L.-J.K.，S.B.，X.J.L.，S.M.，J.M.C.，A.H.，和M.B.M.进行实验并分析结果。T.A.产生的Nmnat3转基因小鼠。协助统计分析。N.T.和D.G.L.C.提供了关键反馈。L.E.W.撰写并准备了这份手稿。
L.E.W.、H.A.H.和D.A.S.是Jumpstart Fertility Inc.的共同创始人、股东、董事和顾问，该公司成立的目的是开发本文所述的工作，并且是一项专利（WO2019023748A1“提高生育能力的方法”）的发明人，该专利构成了本工作的基础，并获得了Jumpstart Fertility的许可。D.A.S.是一项专利（WO2013002880A1）的发明人，该专利先前获得了Jumpstart Fertility的许可。在新南威尔士州的L.E.W.和R.B.G.实验室工作的M.J.B.和D.M.G.的工资是由从Jumpstart Fertility到新南威尔士州的赞助研究支付的。K.S.是Jumpstart生育公司的员工。W.-H.J.H.和D.R.L.持有Jumpstart Fertility的股份。H.A.H.与昆士兰生育集团合作，在私营部门从事艺术。L.E.W.和D.A.S.也是EdenRoc Sciences（Metro Biotech NSW、Metro Biotech、Liberty Biosecurity）和in-Life Biosciences LLC及其子公司（Jumpstart Fertility、Continuum Biosciences、Senolytic Therapeutics、Selphagy、Animal Biosciences、Iduna）的顾问和股东。L.E.W.为Life Biosciences提供咨询工作，是Intravital Pty Ltd.的顾问和股东。D.A.S.也是Vium、Jupiter Orphan Therapeutics、Cohbar、Galilei Biosciences、Wellomics、EdenRoc Sciences（及其附属公司Arc Bio，燕尾基因组学、红葡萄酒、瑞尔生物科学、UpRNA、MetroBiotech、Liberty Biosecurity）、生命生物科学（以及附属公司Selphagy、Senolytic Therapeutics、Spotlight Therapeutics、Animal Biosciences、Iduna、Continuum、Jumpstart Fertility、Iduna）。D.A.S.是梅奥诊所和哈佛医学院提交的专利申请的发明人，该专利已获得Elysium Health的许可。有关详细信息，请参阅https://genetics.med。哈佛大学教育部/辛克莱.
接收日期：2019年9月12日
修订日期：2019年11月3日
受理日期：2020年1月17日
出版日期：2020年2月11日
Agarwal，A.、Aponte Mellado，A.、Premkumar，B.J.、Shaman，A.和Gupta，S.（2012年）。氧化应激对女性生殖的影响：综述。
雷普德。生物。内分泌素。10, 49.
Atzmon，Y.，Shoshan Karchovsky，E.，Michaeli，M.，Aslih，N.，Shrem，G.，Ellenbogen，A.，和Shalom Paz，E.（2017）。体外受精/胞浆内单精子注射周期中卵母细胞较小导致肥胖的前瞻性研究。J.协助。雷普德。吉奈。34, 1145–1151.
Bedalov，A.、Gatbonton，T.、Irvine，W.P.、Gottschling，D.E.和Simon，J.A.（2001年）。小分子Sir2p抑制剂的鉴定。纳特尔。阿卡德。
科学院。美国98，15113–15118。
Berger，F.，Lau，C.，Dahlmann，M.，和Ziegler，M.（2005年）。三种人烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶亚型的亚细胞区隔和不同催化特性。生物学杂志。化学。280, 36334– 36341.
Bieganowski，P.和Brenner，C.（2004年）。烟酰胺核糖苷作为一种营养素的发现和保守的NRK基因建立了一条在真菌和人类中与前iss处理程序无关的NAD+途径。117号房，495–502。
Bitterman，K.J.、Anderson，R.M.、Cohen，H.Y.、Latorre Esteves，M.和Sinclair，D.A.（2002年）。烟酰胺对沉默和加速衰老的抑制作用，烟酰胺是酵母sir2和人SIRT1的负调控因子。生物学杂志。化学。
277, 45099–45107.
Bustamante，S.，Jayasena，T.，Richani，D.，Gilchrist，R.B.，Wu，L.E.，Sinclair，D.A.，Sachdev，P.S.，和Braidy，N.（2017）。用串联液相色谱-质谱法定量细胞NAD+代谢组。代谢组学14，15。
Cheng，H.L.，Mostoslavsky，R.，Saito，S.，Manis，J.P.，Gu，Y.，Patel，P.，Bronson，R.，Appella，E.，Alt，F.W.，和Chua，K.F.（2003年）。Sir2同源物（SIRT1）缺陷小鼠的发育缺陷和p53高乙酰化。过程。纳特尔。
阿卡德。科学院。美国100，10794–10799。
Dalton，C.M.，Szabadkai，G.，和Carroll，J.（2014）。单个卵母细胞中ATP的测定：成熟和卵丘细胞对水平和消耗的影响。J.细胞。生理学。229, 353–361.
De Vos，M.、Smitz，J.和Woodruff，T.K.（2014年）。癌症妇女的生育能力保持。柳叶刀3841302–1310。
Dong，Y.，Digman，M.A.，和Brewer，G.J.（2019年）。荧光寿命成像显微镜观察亚细胞室中NADH的年龄和AD相关氧化还原状态。日耳曼科学41，51–67。
Ear，P.H.，Chadda，A.，Gumusoglu，S.B.，Schmidt，M.S.，Vogeler，S.，Malicoat，J.，Kadel，J.，Moore，M.M.，Migaud，M.E.，Stevens，H.E.等人（2019年）。母体烟酰胺核糖体促进产后体重减轻、幼子代发育和成年子代的神经发生。手机号26969–983。
Franasiak，J.M.，Forman，E.J.，Hong，K.H.，Werner，M.D.，Upham，K.M.，Treff，N.R.，和Scott，R.T.，Jr.（2014年）。随着女性伴侣年龄的增长，非整倍体的性质：15169例连续滋养细胞活组织检查的回顾性分析，采用全面的染色体筛查进行评估。弗蒂尔。甾醇。101, 656–663.
Ganeshan，L.，Li，A.，和O'Neill，C.（2010年）。转化相关蛋白53在小鼠早期胚胎中的表达通过阻止增殖内细胞团的形成而损害着床前胚胎发育。生物。雷普德。83, 958–964.
Ganeshan，L.，Jin，X.L.，和O'Neill，C.（2017年）。肿瘤抑制蛋白P53的诱导限制了细胞进入小鼠胚胎内多能干细胞团谱系。实验细胞研究358227-233。
Gosnell，M.E.，Anwer，A.G.，Cassano，J.C.，Sue，C.M.，和Goldys，E.M.（2016a）。功能性高光谱成像捕捉嗅觉神经球细胞（神经退行性疾病的疾病特异性模型）中细胞代谢的细微细节。杀了他。生物物理学。Acta 1863，第56–63页。
Gosnell，M.E.，Anwer，A.G.，Mahbub，S.B.，Perinchery，S.M.，Inglis，D.W.，Adhikary，P.P.，Jazayeri，J.A.，Cahill，M.A.，Saad，S.，和Pollock，C.A.（2016b）。基于多光谱自体荧光特征的定量无创细胞表征与识别。科学院。报告6，23453。
Greaney，J.、Wei，Z.和Homer，H.（2018年）。卵母细胞染色体分离的调控及女性减数分裂错误的细胞基础。哼。雷普德。
更新24135–161。
Grozinger，C.M.，Chao，E.D.，Blackwell，H.E.，Moazed，D.，和Schreiber，S.L.（2001年）。表型筛选鉴定NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin家族的一类小分子抑制剂。生物学杂志。化学。276, 38837–38843.
Habibalahi，A.、Bala，C.、Allende，A.、Anwer，A.G.和Goldys，E.M.（2019年）。利用多光谱自体荧光成像技术自动无创检测眼表鳞状瘤变的新方法。眼睛。冲浪。17, 540–550.
Hasmann，M.和Schemainda，I.（2003年）。FK866是一种高度特异的非竞争性烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂，是一种诱导肿瘤细胞凋亡的新机制。癌症研究63，7436–7442。
荷马，H.（2013）。雌性哺乳动物减数分裂中的APC/CⅠ.生殖146，R61–R71。
霍默，H.A.，麦克杜格尔，A.，莱瓦瑟，M.，雅洛普，K.，默多克，A.P.，和赫伯特，M.（2005）。Mad2抑制小鼠卵母细胞减数分裂Ⅰ期细胞周期蛋白B和securin的非整倍体和过早蛋白水解。基因发展19，202–207。
荷马，H.，桂，L.，和卡罗尔，J.（2009）。纺锤体组装检查点蛋白在前期I期阻滞和前中期进展中发挥作用。科学326991–994。
Janny，L.和Menezo，Y.J.（1996年）。母亲年龄对人类早期胚胎发育和囊胚形成的影响。分子复制。第45、31–37节。
Jemiolo，B.，Harvey，S.，和Novotny，M.（1986年）。雄性尿液成分的合成类似物促进雌性小鼠的惠腾效应。过程。
纳特尔。阿卡德。科学院。美国83，4576–4579。
Jin，F.，Hamada，M.，Malureanu，L.，Jeganathan，K.B.，Zhou，W.，Morbeck，D.E.，和van Deursen，J.M.（2010年）。Cdc20对雌性小鼠的减数分裂Ⅰ和生育能力至关重要。公共科学图书馆Genet。图6，e1001147。
Kapoor，T.M.、Mayer，T.U.、Coughlin，M.L.和Mitchison，T.J.（2000年）。用有丝分裂驱动蛋白Eg5的小分子抑制剂monastrol探讨纺锤体组装机制。细胞生物学杂志。150, 975–988.
Kawamura，Y.，Uchijima，Y.，Horike，N.，Tonami，K.，Nishiyama，K.，Amano，T.，Asano，T.，Kurihara，Y.，和Kurihara，H.（2010）。Sirt3保护体外受精小鼠植入前胚胎免受氧化应激诱导的p53介导的发育停滞。临床杂志。投资。120, 2817–2828.
Keshava，N.（2003年）。光谱分解算法综述。林肯。实验室J.14，55–78。
Keshava，N.和Mustard，J.F.（2002年）。光谱分解。IEEE信号处理。杂志19，44–57。
Keshava，N.，Kerekes，J.P.，Manolakis，D.G.，和Shaw，G.A.（2000年）。高光谱分解的算法分类。多光谱、高光谱和超光谱图像算法会议录VI 4049，42–63。
Kim，H.S.，Vassilopoulos，A.，Wang，R.H.，Lahusen，T.，Xiao，Z.，Xu，X.，Li，C.，Veenstra，T.D.，Li，B.，Yu，H.等人（2011年）。SIRT2通过调节APC/C活性维持基因组完整性并抑制肿瘤发生。癌细胞20487–499。
Kolenc，O.I.和Quinn，K.P.（2019年）。NAD（P）H和FAD的自体荧光显像评价细胞代谢。抗氧化剂。氧化还原信号。30, 875–889.
Komarov，P.G.、Komarova，E.A.、Kondratov，R.V.、Christov Tselkov，K.、Coon，J.S.、Chernov，M.V.和Gudkov，A.V.（1999年）。一种p53的化学抑制剂，保护小鼠免受癌症治疗的副作用。科学2851733–1737。
Kumar，P.、Sait，S.F.、Sharma，A.和Kumar，M.（2011年）。卵巢过度刺激综合征。J.哼。雷普德。科学院。4, 70–75.
Lane，M.和Gardner，D.K.（1997年）。氨基酸对小鼠胚胎发育和存活的差异调节。J.雷普德。弗蒂尔。109, 153–164.
Li，A.，Chandrakanthan，V.，Chami，O.，和O'Neill，C.（2007年）。合子培养可增加B6小鼠胚胎中TRP53[校正]的表达，从而降低胚胎活力。生物。雷普德。76, 362–367.
Li，A.，Ganeshan，L.，和O'Neill，C.（2012年）。Trp53基因剂量及遗传起源亲本对小鼠配子和胚胎功能的影响。生物。雷普德。86, 175.
Li，H.J.，Sutton McDowall，M.L.，Wang，X.，Sugimura，S.，Thompson，J.G.，和Gilchrist，R.B.（2016）。用cAMP调节剂延长预成熟期可通过缝隙连接增强卵丘对卵母细胞抗氧化防御和卵母细胞质量的贡献。哼。雷普德。31, 810–821.
Mahbub，S.B.，Plo¨schner，M.，Gosnell，M.E.，Anwer，A.G.，和Goldys，E.M.（2017）。生物样品中天然荧光团的无标记定量鉴别。科学院。代表715792。
Maniam，J.和Morris，M.J.（2010）。适口的自助餐厅饮食可以改善早期不良环境下的焦虑和抑郁症状。
心理神经内分泌学35717-728。
Marquard，K.L.、Stephens，S.M.、Jungheim，E.S.、Ratts，V.S.、Odem，R.R.、Lanzendorf，S.和Moley，K.H.（2011年）。多囊卵巢综合征和母亲肥胖影响体外受精/胞浆内单精子注射周期中卵母细胞大小。弗蒂尔。甾醇。95, 2146–2149.
Massudi，H.，Grant，R.，Braidy，N.，Guest，J.，Farnsworth，B.，和Guillemin，G.J.（2012年）。人体组织中氧化应激和NAD+代谢的年龄相关变化。公共科学图书馆一号，第7版，第42357页。
Mills，K.F.，Yoshida，S.，Stein，L.R.，Grozio，A.，Kubota，S.，Sasaki，Y.，Redpath，P.，Migaud，M.E.，Apte，R.S.，Uchida，K.等人（2016）。长期服用烟酰胺单核苷酸减轻小鼠年龄相关的生理衰退。细胞代谢。24, 795–806.
Munne′，S.，Sandalinas，M.，Escudero，T.，Ma′rquez，C.，和Cohen，J.（2002年）。卵裂期人类胚胎染色体嵌合体：母体年龄效应的证据。雷普德。生物群落。在线4223–232。
Y.Nishizuka和O.Hayaishi（1963年）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成的研究。哺乳动物组织中3-羟基邻氨基苯甲酸酶法合成烟酸核糖核苷酸。生物学杂志。化学。238, 3369–3377.
North，B.J.，Rosenberg，M.A.，Jeganathan，K.B.，Hafner，A.V.，Michan，S.，Dai，J.，Baker，D.J.，Cen，Y.，Wu，L.E.，Sauve，A.A.等人（2014年）。SIRT2诱导检查点激酶BubR1延长寿命。EMBO J.331438–1453。
国家围产期流行病学和统计股（2016年）。2016年澳大利亚和新西兰的辅助生殖技术（新南威尔士悉尼）。
奥尼尔，C.（1997）。小鼠植入前胚胎体外发育需要自分泌生长因子的证据。生物。雷普德。56, 229–237.
Okuno，E.和Schwarcz，R.（1985年）。大鼠肝和脑喹啉酸磷酸核糖转移酶的纯化。杀了他。生物物理学。Acta 841112–119号法案。
Peck，B.，Chen，C.Y.，Ho，K.K.，Di Fruscia，P.，Myatt，S.S.，Coombes，R.C.，Fuchter，M.J.，Xiao，C.D.，和Lam，E.W.（2010年）。SIRT抑制剂通过靶向SIRT1和SIRT2诱导细胞死亡和p53乙酰化。分子癌症治疗。9, 844–855.
Piacente，F.、Caffa，I.、Ravera，S.、Sociali，G.、Passalacqua，M.、Vellone，V.G.、Becherii，P.、Reverberi，D.、Monacelli，F.、Ballestrero，A.等人（2017年）。烟酸磷酸核糖转移酶调节癌细胞代谢、NAMPT抑制剂敏感性和DNA修复。癌症研究77，3857–3869。
Preiss，J.和Handler，P.（1958a）。二磷酸吡啶核苷酸的生物合成。一、中间体的鉴定。生物学杂志。化学。233, 488–492.
Preiss，J.和Handler，P.（1958b）。二磷酸吡啶核苷酸的生物合成。二。酶方面。生物学杂志。化学。233, 493–500.
邱，D.，侯，X.，韩，L.，李，X.，葛，J.，和王，Q.（2018）。Sirt2-BubR1乙酰化途径介导高龄母亲对卵母细胞质量的影响。老化细胞17，e12698。
Rajman，L.，Chwalek，K.，和Sinclair，D.A.（2018）。NAD促进分子的治疗潜力：体内证据。细胞代谢。27, 529–547.
Rehman，A.U.、Anwer，A.G.、Gosnell，M.E.、Mahbub，S.B.、Liu，G.和Goldys，E.M.（2017年）。HeLa细胞内游离和结合NADH荧光猝灭的高光谱成像和细胞自发荧光分离研究。
生物群落。选择。快递81488–1498。
Riepsamen，A.，Wu，L.，Lau，L.，Listijono，D.，Ledger，W.，Sinclair，D.，和Homer，H.（2015）。烟酰胺影响小鼠卵母细胞减数分裂Ⅰ的进入和退出。公共科学图书馆一号10，e0126194。
Riris，S.，Webster，P.，和Homer，H.（2014）。单个人卵母细胞功能重要基因的数字复合mRNA分析及转录水平变化与卵母细胞蛋白表达的相关性。弗蒂尔。甾醇。
101, 857–864.
Sauer，M.V.（2015年）。高龄产妇生育与产妇健康。弗蒂尔。甾醇。103, 1136–1143.
Schindelin，J.、Arganda Carreras，I.、Frise，E.、Kaynig，V.、Longair，M.、Pietzsch，T.、Preibisch，S.、Rueden，C.、Saalfeld，S.、Schmid，B.等人（2012年）。斐济：生物图像分析的开源平台。纳特。方法9676–682。
Tatone，C.，Di Emidio，G.，Barbonetti，A.，Carta，G.，Luciano，A.M.，Falone，S.，和Amicarelli，F.（2018年）。配子生物学和生殖生理学中的Sirtuins：在女性和男性不育中的新角色和治疗潜力。
哼。雷普德。更新24267–289。
Tian，W.N.，Braunstein，L.D.，Pang，J.，Stuhlmeier，K.M.，Xi，Q.C.，Tian，X.，和Stanton，R.C.（1998）。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性对细胞生长的重要性。生物学杂志。化学。273, 10609–10617.
Touati，S.A.，Buffin，E.，Cladie`re，D.，Hached，K.，Rachez，C.，van Deursen，J.M.，和Wassmann，K.（2015年）。小鼠卵母细胞依赖于BubR1进行染色体分离，但不依赖于前期I期阻滞。纳特。公社。6, 6946.
Trammell，S.A.，Schmidt，M.S.，Weidemann，B.J.，Redpath，P.，Jaksch，F.，Dellinger，R.W.，Li，Z.，Abel，E.D.，Migaud，M.E.，和Brenner，C.（2016）。烟酰胺核糖苷是一种独特的口服生物利用度在小鼠和人类。纳特。
公社。7, 12948.
Vaziri，H.，Dessain，S.K.，Ng Eaton，E.，Imai，S.I.，Frye，R.A.，Pandita，T.K.，Guarente，L.，和Weinberg，R.A.（2001）。hSIR2（SIRT1）是一种依赖NAD的p53脱乙酰酶。107、149–159号牢房。
Vidal，M.和Amigo，J.M.（2012年）。高光谱图像的预处理。图像分析前的基本步骤。化学计量计。内尔。实验室系统。117, 138–148.
Wang，Y.P.，Zhou，L.S.，Zhao，Y.Z.，Wang，S.W.，Chen，L.L.，Liu，L.X.，Ling，Z.Q.，Hu，F.J.，Sun，Y.P.，Zhang，J.Y.，et al.（2014年）。SIRT2和KAT9对G6PD乙酰化的调节在氧化应激期间调节NADPH内稳态和细胞存活。EMBO J.331304–1320。
Wu，L.E.，Meoli，C.C.，Mangiafico，S.P.，Fazakerley，D.J.，Cogger，V.C.，Mohamad，M.，Pant，H.，Kang，M.J.，Powter，E.，Burchfield，J.G.等人（2014）。系统性VEGF-A中和改善饮食诱导的代谢功能障碍。
糖尿病63，2656–2667。
Yahata，N.，Yuasa，S.，和Araki，T.（2009年）。线粒体基质中烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶的表达延缓了Wallerian变性。神经科学杂志。29, 6276–6284.
Yeo，C.X.，Gilchrist，R.B.，Thompson，J.G.，和Lane，M.（2008年）。卵母细胞成熟液中外源性生长分化因子9促进小鼠胚胎发育和胎儿存活。哼。雷普德。23, 67–73.
Yoshino，J.、Mills，K.F.、Yoon，M.J.和Imai，S.（2011年）。烟酰胺单核苷酸是一种关键的NAD（+）中间体，治疗饮食和年龄诱导的小鼠糖尿病的病理生理学。细胞代谢。14, 528–536.
Zhang，L.，Hou，X.，Ma，R.，Moley，K.，Schedl，T.，和Wang，Q.（2014）。小鼠卵母细胞减数分裂中Sirt2在纺锤体组织和染色体排列中的作用。FASEB J.28，1435–1445。
张，J.，方，L.，陆，Z.，熊，J.，吴，M.，史，L.，罗，A.，和王，S。
(2016). sirtuins是卵巢老化的标志物吗？基因575680–686。
Zhu，C.T.和Rand，D.M.（2012年）。联氨偶联循环试验证实了果蝇在饥饿条件下氧化还原率的降低。公共科学图书馆一号，e47584。
关键资源表
在可能的情况下，我们使用SciCrunch数据库中的RRID数字列出了资源。
抗体Alexa Fluor 546标记的山羊抗人抗体体内激素注册登记号：AB_Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠抗体体内激素注册登记号：AB_人抗着丝粒抗体（ACA）免疫视觉注册登记号：AB_小鼠抗b微管蛋白西格玛注册登记号：AB\ U 2827403SIRT2号西格玛注册登记号：AB_SIRT1号细胞信号技术注册登记号：AB\ U 2617130肌动蛋白微孔注册登记号：AB\ U 2223041HRP偶联羊抗兔IgG美国伯乐注册登记号：AB\ U 11125143HRP偶联羊抗鼠IgG美国伯乐注册登记号：AB\ U 11125547NMNAT1型圣克鲁斯注册登记号：AB君215313NMNAT3型圣克鲁斯注册登记号：AB_
化学品、肽和重组蛋白Hoescht 33342（双苯甲酰亚胺33342）西格玛奥尔德里奇，澳大利亚99403电化学发光检测系统通用电气医疗RPN232型烟酰胺单核苷酸香港基因港生物科技有限公司药方：妊娠母马血清促性腺激素（卵泡素）MSD动物健康，澳大利亚Intervet，荷兰博克斯米尔Triton?声波风廓线仪X-100西格玛奥尔德里奇，澳大利亚T8787型3-异丁基-1-甲基黄嘌呤西格玛奥尔德里奇，澳大利亚一七零一八石蜡油EMD密理博，澳大利亚ES-005-C型M2媒体西格玛奥尔德里奇，澳大利亚M7167型牛血清白蛋白西格玛奥尔德里奇，澳大利亚单甾醇西格玛M8515型Sytox绿色核酸染色体内激素S7020系列HEPES缓冲a-最低基本培养基GIBCO Life Technologies，纽约州格兰德岛人绒毛膜促性腺激素Chorulon，MSD动物健康，澳大利亚5-（和-6）-氯甲基-20,7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H2DCFDA）体内激素C6827型洗涤介质（研究洗涤）IVF兽医解决方案（澳大利亚阿德莱德）解理培养基（研究解理）IVF兽医解决方案（澳大利亚阿德莱德）
实验模型：生物体/菌株C57BL6/JAusb小鼠澳大利亚生物资源公司注册识别码：MGI:6200612瑞士老鼠澳大利亚生物资源公司SIRT2转基因小鼠B6.Cg-Col1a1tm1（CAG-SIRT2）Jmi/DsinJ），菌株#029604杰克逊实验室RRID:IMSR\u JAX:029604SIRT2基因敲除小鼠（B6.129-Sirt2tm1.1Fwa/J），品系#012772杰克逊实验室RRID:IMSR\u JAX:012772NMNAT1转基因小鼠根据日本NCPP的材料转让协议获得。注册识别码：IMSR\ U RBRC03166NMNAT3转基因小鼠根据日本NCPP的材料转让协议获得。注册登记号：IMSR\ U RBRC03167
软件和算法NIS-C采集分析软件尼康，日本ImageJ斐济软件注册识别码：SCR\u 002285
（下页续）
继续的
试剂或资源源标识符Xcalibur软件版本2.22011ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆注册登记号：SCR\ U 014593G*功率3.1杜塞尔多夫海因里希大学注册识别码：SCR\ U 013726Prism v8.1.2版GraphPad公司注册识别码：SCR\u 002798
其他a1mp+多光子共焦显微镜尼康，日本玻璃底35mm共焦盘马特克公司。TSQAccess质谱仪ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆Prime 95B cMOS显微照相机（多光谱成像）光学性质FluoroMax Plus-C荧光计（多光谱成像显微镜校准）堀场食物（老鼠饲料）Gordon的特色饲料Yanderra，澳大利亚新南威尔士州Accu-check（手持式血糖仪）罗氏EchoMRI（定量MRI，身体成分）EchoMRI，美国德克萨斯州休斯顿VISUALONICS Vevo 2100超声波视觉电子学注册识别码：SCR\ U 015816
铅接触和材料可用性
更多信息和对资源和试剂的要求应直接提交给首席联系人Lindsay Wu，并由其完成(林赛·吴@新南威尔士大学). 这项研究没有产生任何新的独特试剂。我们从日本NCCP的MTA下从Toshiyuki Araki实验室获得了NMNAT1和NMNAT3转基因小鼠系，并将在每次请求获得日本NCCP许可之前共享这些菌株。
实验模型和主题细节
转基因和野生型小鼠（Mus musculus）品系在澳大利亚新南威尔士州莫斯谷的澳大利亚生物资源公司（ABR）培育，并在6-7周龄时送到新南威尔士州悉尼。动物被关在温度为22℃、湿度为80%、密度为每笼5只的通风笼中，可随意获得食物和水。所有的水在这个动物的房子被酸化到pH3与盐酸，以减少微生物的生长。新南威尔士州动物之家保持12小时的明暗循环，7点开灯，19点熄灯。除了图2C中使用的瑞士小鼠外，其他动物都是C57BL/6JAusb背景。每个实验中动物的年龄可以在人物传说中找到。实验是在获得新南威尔士州动物护理和伦理委员会（ACEC）事先批准的情况下进行的，ACEC编号为13/134B、15/134A和18/133A。新南威尔士州动物护理和伦理委员会是根据澳大利亚国家健康和医学研究委员会（NHMRC）的动物伦理准则运作的。此处使用的SIRT2、NMNAT1和NMNAT3转基因小鼠品系的产生如前所述（North等人，2014；Yahata等人，2009）。
方法详细信息
卵巢刺激、卵母细胞收集用于体外成熟和纺锤体评估（图1和图2）
为了收集生发泡（GV）期卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行计数和体内成熟以进行纺锤体形态评估，在用7.5 IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）刺激卵巢44至46小时后，从每只小鼠的两个卵巢恢复（MSD Animal Health，Australia），腹腔注射给药。在显微镜下仔细迅速地去除卵巢周围的脂肪和组织。卵母细胞从卵巢机械释放M2培养基中补充3毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）在生长抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（西格玛奥尔德里奇，澳大利亚）的存在下，在50毫米处使用27针。释放的卵母细胞，包括卵丘卵母细胞复合体（COC）和处于生发载体（GV）阶段的去核卵母细胞（DO），通过抽吸管（Sigma-Aldrich）收集，并转移到另一滴涂有石蜡油的IBMX-M2培养基（EMD-Millipore corporation，USA）中，将其预热至37℃，然后计数卵母细胞，并进行细胞计数用口吸管机械破坏去除卵丘细胞。卵母细胞在含3 mg/ml BSA的无IBMX M2（Sigma-Aldrich，Australia）中漂洗3次，在5%CO2中进行24小时pH校准，以从卵母细胞中冲洗出IBMX，然后转移到另一个干净的、pH校准的M16培养基中，该培养基上覆有油，并在37℃下，在5%CO2的增湿气氛中返回培养箱，以使其保持稳定评估随后的减数分裂发育。减数分裂成熟度测定包括生发泡破裂率（GVBD）和第一极体挤出率（PBE）。GVBD的发生率是通过计算卵母细胞的数量来测定的，卵母细胞在释放后的头两小时内核膜消失。丢弃2小时后未能发育到GVBD期的卵母细胞，然后继续培养剩余的GVBD期卵母细胞，以在14小时、16小时和20小时后产生第一极体来评估PBE的发育。
为了进行免疫荧光和纺锤体分析，从培养基中取出已实现极体挤出的卵母细胞，并通过PHEM溶液（pH 6.9下的60 mM管，25 mM HEPES，10 mM EGTA，2 mM MgCl2.7H2O）非常短暂地洗涤，在室温下用0.25%tritonx-100（Sigma）在PHEM中预渗透5s以软化透明带之前。卵母细胞在3.7%多聚甲醛（Sigma）溶液中固定20分钟，然后在0.25%tritonx-100溶液中渗透10分钟。然后将卵母细胞在含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（Sigma）（洗涤液）中在室温下洗涤5分钟，然后在含有3%BSA和0.05%吐温-20（封闭液）的PBS中在4℃下封闭过夜，使卵母细胞在室温下保持平衡，并用一级抗体进行检测。
对于免疫标记，分别使用人类抗着丝粒抗体（ACA；1:40；免疫视觉）和小鼠抗b-微管蛋白（1:800；Sigma）标记动粒和微管。一级抗体孵育后，将卵母细胞洗涤并放入以下二级抗体中：Alexa Fluor 546标记的山羊抗人抗体（1:200；Invitrogen）用于检测ACA；Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体（1:200；Invitrogen）用于检测b-微管蛋白。用hoechst33342（1mg/ml；双苯甲酰亚胺；Sigma）在PBS中孵育60s，RT标记DNA。然后将卵母细胞转移到玻璃底皿中矿物油下1-2ml的PBS微滴中进行共聚焦成像。
使用配备有C-Apochromer 63x/1.4 NA浸油物镜的A1 MP+多光子共聚焦显微镜（日本尼康），以0.5 mm的间隔捕获固定卵母细胞的连续Z切片，以跨越纺锤体的整个区域，并使用NIS Elements C采集和分析软件（日本尼康）进行处理。使用成像软件FIJI对共焦图像进行投影和进一步处理。
对于纺锤体分析，卵母细胞表现出桶形双极纺锤体，具有组织良好的微管纤维，以及在中期板上紧密排列的染色体，被认为是正常的。纺锤体紊乱和染色体滞后被认为是异常的。为了使研究者无法进行分析，为每个培养皿给卵母细胞一个色码进行成像和评分，这些色码对应于一个治疗组，该治疗组在成像和评分后才对研究者进行盲处理。
单雌醇治疗与倍性鉴定
体外成熟后，MII卵母细胞在含有100 mM单雌醇（Sigma）的M2培养基（Sigma）中培养2 h，这是一种驱动蛋白-5抑制剂，用于排列染色体以研究染色体数目和动力学（Kapoor等人，2000）。然后固定卵母细胞，阻断卵母细胞并进行免疫染色。用人抗着丝粒一级抗体（ACA；ImmunoVision）检测着丝粒，然后在Alexa Fluor 546标记的山羊抗人抗体（1:200；Invitrogen）中培养。在1:5000稀释的Sytox绿色核酸染色剂（Invitrogen）中培养10分钟，标记DNA。使用上述显微镜以0.5 mm的间隔获取图像，并使用斐济软件进行处理。
为了获得每个卵母细胞的染色体计数，首先分析Z投影图像以确定动粒对的数目。在有可能的动粒重叠或模棱两可的地方，连续的共焦切片进行分析，同时仔细观察染色体的方向。染色体过度聚集的卵母细胞和计数不明确的卵母细胞被排除在最终的非整倍体评估之外。一个训练有素的观察者进行所有的计算和倍性测定。通过使用与成像和分析后才对研究者致盲的治疗组相对应的色码，治疗组在倍性测定后才对研究者致盲。
卵母细胞采集和共聚焦成像-DCFDA染色
为了收集成熟的MII COC，小鼠通过腹腔内（i.p.）注射10 IU妊娠母马血清促性腺激素（Folligon；Intervet，Boxmeer，Holland）来刺激卵泡生长，然后通过腹腔内注射10 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG；Chorulon，MSD Animal Health，46小时后诱导排卵。在注射hCG后14-16小时，用一根27英寸的针从输卵管壶腹收集COC，并收集在HEPES缓冲a-最低基本培养基（a-MEM；GIBCO Life Technologies，Grand Island，NY）中，补充有3毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich，St Louis，MO）。
为了评估卵母细胞氧化应激防御机制的反应，使用荧光探针5-（和-6）-氯甲基-20,7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H2DCFDA）（Invitrogen）评估卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）水平。如图1E所示，在未受挑战的卵母细胞中，如前所述（Li et al.，2016），MII卵母细胞在染色和成像之前被机械剥离其卵丘细胞。卵母细胞在37℃避光下，在含有10 mM CM-H2DCFDA的HEPES缓冲a-MEM中培养30分钟。卵母细胞在HEPES缓冲a-MEM培养基中洗涤三次，然后转移到2毫升的HEPES缓冲a-MEM培养基中，在玻璃底35毫米共聚焦培养皿中覆盖石蜡油（MatTek公司）。利用Nikon A1+共聚焦显微镜，在37℃下使用20X物镜，在亮场和荧光下立即对卵母细胞成像。对于图S1D所示的H2O2激发的卵母细胞，从PMSG刺激的动物中回收GV卵丘卵母细胞复合物，并机械去除，在37℃的5%CO2培养箱中，用50 mM IBMX在a-MEM中孵育过夜。然后将卵母细胞在加入25 mM H2O2的带有IBMX的HEPES缓冲的a-MEM中孵育，然后洗涤三次并在带有IBMX的HEPES缓冲的a-MEM中恢复90分钟，并在含有10 mM DCFDA的带有IBMX的HEPES缓冲的a-MEM中染色30分钟。在37℃冲洗卵母细胞，用共焦显微镜对卵母细胞进行成像，用488nm和520nm的激发和发射波长检测ROS诱导的CM-H2DCFDA对DCF荧光的裂解。在固定的激光能量、信号检测（增益）和针孔尺寸条件下拍摄图像。在卵母细胞赤道平面上记录厚度为10mm，切片间增量为1mm的共聚焦z堆。使用ImageJ斐济软件（Schindelin et al.，2012），在每组至少25个卵母细胞中测量DCF的平均相对荧光强度。
体外受精与胚胎培养
通过检测卵母细胞支持体外受精（IVF）后着床前胚胎发育的能力来评价卵母细胞的发育能力。体外受精和胚胎培养如Yeo等人（2008）所述进行。所有体外受精介质均从IVF兽医解决方案公司（澳大利亚阿德莱德）购买。简言之，在用5 IU（年轻）或10 IU（老年）PMSG和hCG刺激雌性大鼠后，COCs从输卵管壶腹用27号针收集，并收集在HEPES缓冲a-最低必需培养基中COCs在补充有4mg/ml BSA的洗涤培养基（研究洗涤）中洗涤三次，并与获能精子在补充有4mg/ml BSA的受精培养基中在37℃、5%O2、6%CO2和50℃下共孵育4h89%氮气。精子从12周龄以上的杂交CBB6F1雄性中回收。假定的合子在洗涤培养基中洗涤三次，然后在添加4 mg/ml BSA的卵裂培养基（研究卵裂）中洗涤一次，并以每2 ml 1个胚胎的密度用矿物油分层培养。每24小时评估受精率和随后的按时发育。
在简单定义的培养基生长条件下（图4C–E、S5C、S5G和S5H），如上所述收集卵母细胞，然后将卵母细胞保存在补充有谷氨酰胺和EDTA（HTF-GE）的人输卵管液中，进一步补充有3 mg/ml BSA，BSA是不含任何激素或营养配体的最低必需培养基（奥尼尔，1997年）。胚胎在10ml滴液中单独培养，通过稀释自分泌营养配体进一步诱导培养应激。在受精后92小时固定胚胎进行细胞计数。
G6PD活性
从卵巢中回收PMSG刺激动物的GV卵母细胞，并通过口吸管机械去除卵丘层，然后收集到体积为35 mL的50 mM Tris-HCl pH 7.44缓冲液中，每个样品有5个卵母细胞。在单次冻融循环后裂解卵母细胞，并在16000 g，4度下旋转10分钟以分离细胞碎片。对上清液（34 mL）进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性的测量，如前所述测定（Tian等人，1998）。分别测定6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）活性和G6PD+6PGD活性，用G6PD+6PGD总酶活性值减去6PGD活性测定内源性G6PD活性。每个反应混合物由50 mM Tris-HCl、pH 7.44、2 mM NADP+和待测量G6PD活性的样品组成。通过添加4 mM G6P+4 mM 6PGL或单独添加4 mM 6PGL来启动反应，并且在室温下使用分光光度计在384孔板中的总体积为60 mL中测量活性。在吸光度340nm处每隔30s测量NADPH产生，并以AU/小时为单位测定NADPH合成速率。
NAD+测量
在图1C和1D中，通过质谱法测量NAD+和NADH。安乐死后，快速解剖卵巢，去除脂肪，称重，液氮速冻，然后在80℃保存。卵巢置于冰凉的80%甲醇中，在冰上超声处理2 3 30 s，在30℃孵育20 min，然后在14℃离心，收集上清液并加入固定体积的内标混合物（烟酰胺-d4；b-NADH-d5二铵盐；b-NADd4，来自加拿大多伦多化学研究所），并使用真空离心干燥。样品在100 mM NH4OAc中重组并通过0.22 mM过滤器过滤。如Bustamante等人（2017年）所述，通过LC-MS/MS对代谢物进行定量，并进行了细微修改。简而言之，代谢物在Phenomenex NH2柱（150 mm x 2 mm x 3 mm）上分离，使用由5 mm NH4OAc（用氨调节pH 9.5）和乙腈组成的二元溶剂梯度，流速为250 ml/min。代谢物使用TSQ接入质谱仪（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA）测量。利用每个校准品的峰面积比（代谢物的峰面积除以所选内标物的峰面积）与其浓度的关系，构建了单个代谢物的校准曲线。选择的内标物如下：烟酰胺-d4代表烟酰胺；b-NADH-d5代表NADH；b-NAD-d4代表NAD+。组织提取物中内源性代谢物的浓度由这些校准曲线获得。数据按卵巢重量标准化。使用Xcalibur软件（版本2.22011，ThermoFisher Scientific）处理光谱并整合峰面积。使用软件的LCquan功能执行数据处理。原始数据集可在我们的门德雷网站。
质谱法测定NAD的样本量（如上所述）是通过功率计算确定的，该功率计算基于使用之前描述的Zhu和Rand（2012）的NAD+循环方法获得的试验结果。这些功率计算和影响大小的试验结果可在单独的补充信息中获得。在这些初步研究中，在安乐死后，从动物身上快速解剖卵巢，并在液氮中快速冷冻，然后在80℃下储存。然后通过超声使样品在NAD+提取缓冲液（10 mM烟酰胺，50 mM Tris-HCl，0.1%Triton X-100，pH 7.4）中均质化。然后将样品在7000 g下在4℃下离心5分钟，以去除不溶性碎片。取小份样品用于以后的蛋白质测定，然后将样品以14000 g的浓度通过10 kDa Amicon过滤器，在4℃下30分钟以去除样品中的蛋白质。从这些含有无蛋白代谢物的样品中流出的液体被分成两份。为了单独评估NAD+，在其中一份样品中，将HCl添加到10 mM中，并将样品在70℃下加热30 min–此步骤降解NADH，留下NAD+。每个样品以技术一式三份进行测量，将25 mL样品加入100 mL ADH循环混合物（0.2 mg/mL乙醇脱氢酶，2%乙醇，100 mM Tris pH 8.5）。使样品在室温下循环10分钟，然后添加50 mL MTT/PMS溶液（0.1 mM吩嗪甲硫酸盐、0.8 mM 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）、100 mM Tris-HCl pH 8.5）。然后培养板，在循环反应过程中，每隔5分钟在570 nM处测量吸光度，10分钟的时间点用于此处提供的数据。NAD浓度从标准曲线外推，并标准化为BCA蛋白质分析测定的蛋白质浓度。
高光谱成像
在这项工作中，我们通过添加一些定制的荧光通道（Gosnell et al.，2016a，2016b；Habibalahi et al.，2019；Rehman et al.，2017），利用适合多光谱成像的荧光显微镜来表征卵母细胞的天然荧光。图像是在下表所列的下列频道中拍摄的。我们在40倍放大（40x）的条件下，在每个通道中生成了相同细胞的一系列自体荧光图像。为了获得荧光图像，使用了一个灵敏的相机（来自Photometrics的prime95bcmos）。摄像机在65摄氏度以下工作，以减少传感器产生的噪音。
为了准备用于定量分析和光谱分解的光谱图像，首先，进行了多步骤图像准备程序（Gosnell等人，2016a、2016b；Mahbub等人，2017；Vidal和Amigo，2012）。该程序消除了误差源，降低了噪声，并使光谱图像标准化。这些步骤包括（i）图像均衡，（ii）去噪，（iii）背景照明平坦化，以及（iv）细胞分割，这在我们之前的研究中有详细报道（Mahbub等人，2017）。简单地说，为了均衡图像，每个通道的强度值被转换成每像素每秒光子的单位（PPS）。PPS-unite标准化了采用不同采集参数（如相机量子效率和曝光时间）采集的图像。其次，为了减少随机噪声，如尖峰和泊松噪声，分别采用了阈值限制窗和小波滤波器。
此外，两个参考多光谱图像，包括水和校准捕获使用我们的多光谱显微镜系统在每个实验开始。在去噪后，从光谱图像中减去水图像，以去除显微镜玻片、培养皿、传感器上的污垢等不可避免的自体荧光信号，从而形成对所有光谱图像的附加自体荧光背景贡献。使用荧光计（FluoroMax Plus-C，Horiba）校准显微镜。为此，我们使用了校准液，它是30 mM NADH（量子产率0.019）和5 mM核黄素（量子产率0.24）的混合物，在我们的所有光谱通道中具有非零荧光响应。这种液体的荧光光谱用荧光计测量，并在我们所有的光谱通道中在多光谱显微镜上成像。然后对校准液的荧光图像进行平滑处理，并最小化相关的随机噪声。将平滑后的光谱图像减去水背景，再除以校准液图像，再乘以荧光计测得的校准液荧光响应。这是在一个频道一个频道的基础上进行的。最后，为了在单个细胞分辨率下执行分离过程，通过使用叠加在选定自体荧光图像上的DIC图像来手动分离（分割）细胞。
在分解过程中，将测得的细胞光谱特征与特定荧光团的参考光谱进行比较，以确定它们的丰度。本研究采用线性混合模式（LMM）进行混合。LMM描述了每个像素的荧光信号是端元部分光谱的线性组合。LMM定义了与这些组分光谱对应的分子浓度相关的权重。这些浓度以丰度分数表示（Keshava，2003；Keshava et al.，2000；Keshava and芥末，2002），并采用稳健相关成分分析（Mahbub et al.，2017）（RoDECA）算法（可在我们的Mendeley网站上获得）来识别主要的天然荧光团并计算其相对丰度。所有原始数据集都可以在我们的Mendeley网站上找到。
曝光时激发发射波长二向色镜功率
光谱通道波长（nm）（带宽）（nm）长程（nm）物镜（mW）时间（s）1345 ± 5414 (46)3896.0102345 ± 5451 (106)3896.263345 ± 5575 (59)5525.7104358 ± 5414 (46)3895.2105371 ± 5414 (46)3896.8106358 ± 5451 (106)3895.2107371 ± 5451 (106)3896.9108358 ± 5575 (59)5526.3109371 ± 5575 (59)5529.91010377 ± 5575 (59)55218.61011437 ± 5575 (59)55228.81012457 ± 5575 (59)55225.21013476 ± 5575 (59)55224.11014358 ± 5594（长传）5526.71015371 ± 5594（长传）55210.410
本研究中使用的信道的频谱规格