二甲双胍和秋水仙碱对急、慢性肾损伤的不同调节作用

　　抗3-硝基酪氨酸(克隆39B6)、4-羟基肌动蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA，克隆EPR 5368)、波形蛋白(克隆EPR 3776)和文化学蛋白(克隆EPR 8185)的抗体来源于英国剑桥。抗ATG 5(克隆D5F5U)、ATG7(克隆D12B11)、Atg 12(克隆D88H11)、Beclin-1(克隆D40C5)、LC3(克隆D3U4C)和β-actin(克隆8H10D10)的抗体来自细胞信号技术(Danvers，MA)。肾损伤分子(Kim)-1抗体来源于温菲科学(Waltham，MA).秋水仙碱、二甲双胍和羟氯喹来自Sigma Aldrich(圣路易斯，MO)，TUNEL TMR试剂盒也是如此。二氢乙锭来自分子探针(Eugene，美国)。脂多糖(LPS-EB)来源于Invivogen(加利福尼亚州圣迭戈).纯化的CD 16/CD 32(2.4G2)、CD 45(104)BUV 395、CD3(145-2c11)FITC、NK1.1(PK 136)FITC、CD4(RM4-5)PE-Cy7、CD8(53-6.7)APC-Cy7、CD62L(MEL-14)PE、CD 44(IM7)BV 711、F4/80(T45-2342)BV 420、CD11b(M1/70)V 500、CD11c(3)APC、Ly-6G(1A8)PE、CD 103(M290)PE、B220(RA3-6b2)FITC、F4/80(T45-2342)BV 420、CD11b(M1/70)V 500、CD11c(3)APC、Ly-6G(1A8)PE、CD 103(M290)PE、B220(RA3-6b2TaqMan引物来自Invitrogen(Carlsbad，CA)。

　　C57BL/6小鼠(野生型，WT)来自澳大利亚生物资源公司(ABR，澳大利亚悉尼)。动物被安置在标准条件下，并提供标准的周食和Libitum。所有研究都是根据西悉尼地方卫生区动物伦理委员会(#4277)批准的规程进行的，并按照澳大利亚国家卫生和医学研究理事会制定的“为科学目的照顾和使用动物守则”进行。

　　肾IR为动物诱发AKI提供了一种方便的方法。12周龄雄性C57BL/6小鼠用异氟醚和氧滴定麻醉，急性缺血再灌注损伤(IRI)模型体温维持在36°C，采用腹部中线切口，放置微动脉瘤夹闭双肾蒂20 min(诱导缺血)，取出夹闭器(再灌注)。腹部用5/0单丝缝合。在IRI发生前，分别腹腔注射车辆对照(PBS)、秋水仙碱(0.4mg/kg，IRI前1h)或二甲双胍(IRI前一天和IRI日0.25mg/kg)。药物剂量是根据文献中描述的方法选择的。17,20,25,26。在某些实验中，在IRI的前一天和第一天分别给予二甲双胍(0.25 mg/kg/d)和羟氯喹(50 mg/kg/d)。在进一步的实验中，小鼠接受了肾脏IRI，然后在手术后第二天使用单剂量二甲双胍或秋水仙碱，并于48h进行安乐死。

　　对于慢性肾损伤模型，小鼠仅在左肾行单侧肾缺血再灌注损伤。再灌注后第7天行右肾切除术。右侧切口为肋下切口，肾脏识别。右肾蒂用4/0丝缝线连接于肾门，起始处与主动脉/下腔静脉相连。切断肾蒂，将右肾与肾周脂肪分离。观察肾床止血情况，腹部用5/0单丝缝合。以这种方式，所有的肾功能都依赖于愈合，损伤左肾，模拟一个减少肾肿块的临床情景。肾切除术后，小鼠腹腔注射秋水仙碱(0.4 mg/kg)或二甲双胍(0.25 mg·kg)，连续4周。在安乐死时(AKI为D+1，CKD为D+28)，取血，将肾组织冷冻、包埋、冷冻于最佳切割温度(OCT)中，或固定于10%中性缓冲福尔马林中。

　　取4μm石蜡包埋肾，用标准方法进行苏木精和伊红(H&E)染色。27。简单地说，切片被分离，浸入二甲苯，然后依次放置在100%，95%和75%乙醇中。切片用苏木精染色(POCD保健；北岩，澳大利亚)，洗后浸入伊红(POCD保健)。使用纳米成像系统安装、拼接和成像(Hamamatsu光子学；日本)。急性肾小管损伤指标(管腔扩张、细胞坏死、梗死、铸型形成)采用皮质髓质连接百分比半定量计算，其特征为：0，无；1，1-10%；2，11-25%；3，26-45%；4，46-75%；5，>75%。组织学检查由随机选取的5个领域(放大×100)的2名独立评估人员以“盲”的方式进行。光学显微镜图像是在相同的设置下获得的。

　　按标准方案进行Picosirius红染色。切片被分离，放置在0.1%的天狼星溶液中，用安装介质清洗和覆盖。幻灯片是在Brightfield条件下观看的。在随机选取的5个皮质髓质区进行纤维化评分，并用ImageJ进行量化。

　　肾功能测定采用SIEMENS维度VISTA系统测定血清肌酐。

　　原代C57BL/6肾小管上皮细胞分离28。用多组织解离试剂盒和GentleMacs(Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国)消化肾脏，用CD 326(EpCAM)微球(Miltenyi)孵育，并通过LS柱。阳性细胞在规定的K1培养基中悬浮：DMEM/F12培养基+25 ng/ml表皮生长因子(Sigma Aldrich，St Louis，MO)，1ng/ml前列腺素E。1(开曼化学品公司，Ann Arbor，MI)，5×10?11M三碘甲状腺原氨酸(Sigma Aldrich)，5×10?8M氢化可的松(Sigma-Aldrich)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂(Sigma Aldrich)、1%青霉素/链霉素(热力科学，Waltham，MA)、25 mm HEPES(热裂变材料科学)、5%FCS(热裂变剂科学)和5%FCS(热裂变材料科学)，并在胶原包膜盘上培养(BD生物科学、富兰克林湖，新泽西州)。

　　细胞传代2~4代进行实验研究。原代培养24h，单纯LPS(1μg/mL，InvivoGen；美国圣地亚哥)，LPS+秋水仙碱(1μM)，LPS+二甲双胍(1mm)。在进一步的实验中，rtc受到常氧(FiO)的影响。2(21%)或缺氧(FiO)2(1%)24 h，所有药物治疗均在LPS刺激或缺氧前2h进行。收集细胞裂解物进行RNA和蛋白质检测。

　　组织或细胞在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma Aldrich)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche应用科学，Hercules，CA)的RIPA缓冲液(细胞信号传递技术)中进行匀浆。裂解物用DC法(BioRad，Hercules，CA)定量。蛋白质经SDS-PAGE分析后转移到硝化纤维素膜(BioRad)上.用原始抗体对印迹进行检测，并利用ImageStudioLite(Licor)在奥德赛成像系统(Licor，Lincoln，NE)上显示。利用ImageStudioLite对波段的强度进行了量化。.

　　采用柱上DNase处理分离物-ⅡRNA MiniKits(伦敦，伦敦)提取RNA.RNA用纳米滴(BioTek，Winooski，VT)定量，用SensiFAST cDNA合成试剂盒(Bioline)进行反向转录。用基因特异性引物(Invitrogen)在CFX 384实时PCR机(BioRad)上扩增cDNA。热循环条件为95°C×2 min，95°C×5s，60°C 40次，30 s，数据用ΔΔCT法进行分析，表达符合管家基因，假手术动物为对照。

　　采用糖酵解应激试验试剂盒和SeahorsXFe 96生物分析仪(Agilent，Santa Clara，CA)实时测定代谢通量。Rtc接种于24孔v7 ps细胞培养微板(Agilent Technologies；Santa Clara，CA)，密度为3×10。4每100μL/井细胞。对细胞的粘附性进行监测，并让细胞在一夜之间生长，直到达到所需的汇合度，以获得一致的单层。化验前，1毫米L-在100 mL XF DMEM培养基中加入谷氨酰胺，pH 7.4(Agilent Technologies)，然后清洗两次细胞。这个盘子被放置在一个非CO的容器里。237℃孵育1h。利用糖酵解应激试验试剂盒(Agilent Technologies)，将水化传感器Cartridge的药物注射口分别装载10 mm葡萄糖、1μM寡霉素(模拟)、50 mm2脱氧-D-葡萄糖(2-DG)。测定基础细胞外酸化率(ECAR)30 min，并评估糖酵解能力。细胞经LPS(100 ng/ml)和/或二甲双胍(1mm)处理24h。

　　未治疗和秋水仙素治疗的小鼠进行肾IRI的描述。对小鼠进行安乐死，取肾、脾。肾皮质被手工切割成1mm。3在37℃下，在DMEM/F12培养基(Invitrogen；Carlsbad，CA)中消化20 min，加入1mg/mLⅡ型胶原酶(Worthington生化试剂；Lakewood，NJ)、BSA和DNase(Sigma-Aldrich)。用PBS冲洗脾，人工解剖。用70μm滤池和离心细胞悬液冲洗肾组织和脾组织。细胞颗粒再悬浮于红细胞裂解液中，室温下孵育3 min，用MacS缓冲液(PBS，0.5%FBS，2mm EDTA)洗涤。细胞与CD 45孵育+MACS微珠子(Miltenyi Biotec；Bergisch，德国)在4°C下保护15分钟，然后通过LS柱(Miltenyi Biotec)获得CD 45。+白细胞。取肾、脾细胞在Fc块(0.5μg/μL)中孵育20 min，然后按兴趣板在4°C保护下用抗体鸡尾酒染色2 0 min，用FACS洗涤液(2%FCS)洗涤，DAPI(活力染色)染色。收购是在BD Fortessa上进行的。在可行的情况下，在不同的小组中使用相同的抗体，而在另一些情况下，使用不同的氟色，以尽量减少向其他细胞群体扩散的溢出效应。用FCS法和SSC法对小鼠脾细胞上所有抗体的阳性和阴性平均荧光强度(MFI)信号进行了评估，以计算染色指数。29。抗体的使用以染色指数、荧光亮度、抗原密度、共表达和门控策略为基础。使用UltraCompeBeads(eBioscience；马萨诸塞州，美国)为每个氟载体创建补偿设置。用BD FACSDiva软件计算补偿矩阵。数据用FlowjoV 10(BD制药)进行分析。

　　行肾IRI和OCT冻存的全肾切片。切片置于超低温超贴片(热费舍尔科学)上，与10μM二氢乙锭(DHE)共同孵育22 min，置于37°C光保护加湿室内。切片用pbs清洗，用DAPI反染色，并安装荧光安装介质(美国达科；加利福尼亚州)。TUNEL染色用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定，然后渗透(0.1%TritonX-100，0.1%柠檬酸钠)。切片用PBS洗涤，并与含有TUNEL标记和酶的反应混合物在37°C下孵育1h。切片用PBS洗涤，用DAPI孵育，用荧光安装介质安装。

　　染色切片使用奥林巴斯共焦V 1000与40 X硅浸没物镜(奥林巴斯，日本)。所有拍摄的图像都使用奥林巴斯FV10-ASW 4.2b版进行了分析。活性氧阳性细胞用德州红激光(559 Nm)检测，细胞核用DAPI激光(405 Nm)鉴定。用ImageJ对dhe+荧光进行定量，从n=5只小鼠中选取4个随机视野(2 0 0μm×2 0 0μm)，计算出平均生源积分密度。TUNEL染色通过计数每节随机选取的5个野的TUNEL阳性细胞数来定量死亡细胞数量。

　　石蜡包埋切片(4μm)染色。切片与抗兔金-1抗体孵育(1：200)。免疫检测采用DAKO Envision+系统-HRP标记的聚合物检测试剂盒(Agilent)，根据制造商的指示和幻灯片进行染色。安装后，纳米动物园观看幻灯片(日本岩田市滨松)。所有标本均在一次检测中染色。用ImageJ计算染色强度。

　　如前所述，肾组织在冰冷裂解缓冲液中进行匀浆。30,31。组织经冷冻/解冻循环进一步溶解，并通过30毫米针。裂解液于1000℃离心 g(5分钟，4°C)，然后在28,000 g(15 min，4°C)。去除上清液，将膜重新悬浮在裂解缓冲液中，用Bradford微板法测定蛋白质浓度。超氧化物歧化酶的产生由NADPH的加入引起，并以Promega，Madison，WI为起始线性速率，利用Biotek Synergy 4杂交多模式微板阅读器(Promega，Madison，WI)计算细胞色素c的还原率。测定过氧化氢(H)2O2肾组织经冰冷破坏缓冲液(含0.1mm EDTA、10%甘油、蛋白酶抑制剂鸡尾酒和0.1mm苯甲基磺酰氟)进行匀浆，超氧化物歧化酶(SOD)进一步裂解。将溶出物加入测定混合物中，加入NADPH引发反应。确认H2O2在平行井中加入过氧化氢酶，由标准曲线量化过氧化氢酶的产率。

　　数据经学生分析t-测试，曼-惠特尼U-多组比较的测试或方差分析。图基或邓尼特的多重比较后测试是在相关的情况下进行的。一个p<0.05的值有显着性意义。