T细胞细胞毒性的调节和相关治疗的制作方法

　　t细胞细胞毒性的调节和相关治疗发明领域1.本发明涉及用于调节(包括增强)t细胞细胞毒性的产品和方法。具体而言，公开了增强的t细胞细胞毒性以用于治疗增殖性病症，例如癌症。背景技术：2.肿瘤新生抗原是t细胞介导的癌细胞识别的关键底物(schumacher,t.n.&schreiber,r.d.,science 2015)。新生抗原特异性t细胞对免疫检查点阻断(immune checkpoint-blockade，icb)有响应，并且已在患有非小细胞肺癌(nsclc)和其他癌症类型的患者的血液和肿瘤中检测出(rizvi,n.a.et al.,science 2015；mcgranahan,n.et al.,science 2016；gros,a.et al.,nat.med.,2016)。虽然肿瘤突变负担(tumour mutational burden，tmb)预测对检查点阻断的响应(rizvi,n.a.et al.,science 2015；van allen,e.m.et al.,science 2015；snyder,a.et al.,n.engl.j.med.2014)，但临床上明显的肿瘤通常在没有治疗的情况下进展，这表明抗肿瘤t细胞应答的功能受损(thommen,d.s.&schumacher；t.n.,cancer cell 2018；reading,j.l.et al.,immunol.rev.2018)。3.t细胞活化由抗原特性决定，抗原特性包括丰度、理化特性、mhc亲和力和自相似性(zinkernagel,r.m.et al.,immunol.rev.1997；rolland,m.et al.,plos one 2007；neefjes,j.&ovaa,h.,nature chemical biology 2013)。在急性感染和疫苗接种中，最佳t细胞刺激导致从祖细胞(例如初始、中枢记忆)分化为效应物和效应物记忆表型，同时获得不同的效应物功能(zhu,j.,yamane,h.&paul,w.e.,annu.rev.immunol.2010；kaech,s.m.&wherry,e.j.,immunity 2007)。然而，癌症和慢性感染中持续的高抗原负荷驱使t细胞分化为功能障碍状态，由持续的t细胞受体(t cell receptor，tcr)刺激介导，该刺激诱导转录因子(包括tox)，其促进基因表达、表观遗传的和代谢的变化，逐渐限制t细胞效应物功能(wherry,e.j.&kurachi,m.rev.immunol.,2015；philip,m.&schietinger,a.curr.opin.immunol.2019；kallies,a.,zehn,d.&utzschneider,d.t.nat.rev.immunol.2019)。4.抗原暴露对肿瘤浸润cd4和cd8子集的相对平衡和功能特征的作用尚不清楚，并且可能与识别限制抗肿瘤t细胞功能的关键可靶向途径有关。5.guo et al.,nature medicine 24,978-985(2018)描述了基于组合的单一细胞表达和t细胞抗原受体的谱系追踪分析，揭示了肿瘤浸润淋巴细胞的多个亚群。这些包括经历耗竭的肿瘤浸润cd8+t细胞，以及表现出耗竭前状态的细胞。鉴定了在每个不同亚群中特异性表达的列表，包括耗竭的肿瘤cd8+t细胞(90个基因)。6.对增强免疫介导的癌症治疗的治疗剂和方法的需求仍未得到满足。本发明解决了这些和其他需要，并提供了如本文所述的相关优点。技术实现要素：7.广义地说，本发明涉及调节t细胞功能障碍以增强t细胞的细胞毒性，并从而增强抗癌治疗。具体而言，本公开内容涉及使用药理学药剂来增强针对肿瘤的免疫应答，以及使用经改造t细胞(包括嵌合抗原受体t细胞(car-t)、经改造以表达转基因t细胞受体的t细胞和新生抗原反应性t细胞(nar-t))，它们在治疗肿瘤时表现出增强的细胞毒性活性。如本文中详细公开的，本发明人已经鉴定了由来自具有高肿瘤突变负担的肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞群中扩增的功能障碍t细胞(称为新生抗原相关功能障碍t细胞，即neo-dys)表达的关键基因。他们还发现，这些基因是控制对功能障碍t细胞中抗肿瘤t细胞功能的限制的关键因素，并且靶向这些基因增强了新生抗原负荷高的癌症中的肿瘤免疫应答。特别是，靶向这些基因可能在可能表现出一些免疫逃逸的肿瘤，例如对免疫治疗有抗性或可能对免疫治疗有抗性的肿瘤的情况下特别有用。本发明人还通过实验验证了这些靶基因的子集，表明了所有鉴定的靶基因的可能效果。8.因此，在本发明的第一个方面中，提供了用于治疗增殖性病症的方法中的经改造t细胞，其具有经调节的选自以下的一种或更多种基因的表达：stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1和tnip3。在一些实施方案中，经改造t细胞具有降低的选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、cd82和tnip3，和/或者提高的选自以下的一种或更多种基因的表达或活性：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、cd82和tnip3。优选地，经改造t细胞具有降低的选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3，和/或者提高的cd7和/或sirpg的表达或者提高的cd7和/或sirpg的活性。在一些这样的实施方案中，一种或更多种基因选自axl、cd7、e2f1、fcrl3、furin、il1rap、pecam1、samsn1、sirpg、sit1、suv39h1、tnip3、和stom。在本公开内容的上下文中，基因的经调节表达包括转录水平和蛋白质产物水平下的调节。9.在一些实施方案中，一种或更多种基因选自stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1。这些基因中的每一个的调节已被实验地表明对t细胞活化有影响。特别地，一种或更多种基因可以有利地选自选自stom、furin、sit1和cd7的一种或更多种基因。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、和e2f1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自stom、furin、sit1、sirpg、il1rap和cd7。特别地，一种或更多种基因可以有利地选自sit1、sirpg和il1rap。优选地，一种或更多种基因包括sit1。10.在一些实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap、sirpg、axl、e2f1a、cd82、samsn1、和fcrl3。对cd8 t细胞中所有这些基因的调节已被实验地表明对t细胞活化有影响。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd8+t细胞。优选地，一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap和sirpg。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自cd7、cd82、cotl1、dusp4、fabp5、itm2a、park7、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、samsn1、sit1、sirpg和tnip3。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd8+t细胞。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自cd7、cd82、samsn1、sirpg和sit1。特别地，一种或更多种基因优选地包括sit1和/或sirpg。优选地，一种或更多种基因包括sit1。11.在一些实施方案中，一种或更多种基因选自epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、和il1rap。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、il1rap、e2f1、c5orf30、cldnd1、gfi1、rnaseh2a、sirpg和suv39h1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、il1rap、e2f1、c5orf30、cldnd1、gfi1、rnaseh2a、和suv39h1。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd4+t细胞，例如效应cd4+t细胞。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap、sirpg、axl、e2f1a、cd82、samsn1、和fcrl3。对cd4 t细胞中所有这些基因的调节已被实验地表明对t细胞活化有影响。优选地，一种或更多种基因选自axl、furin、il1rap、stom、fcrl3、sirpg和e2f1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自axl、furin、il1rap、stom、fcrl3、和e2f1。特别地，一种或更多种基因优选地包括il1rap和/或sirpg。12.在一些实施方案中，t细胞包含嵌合抗原受体t细胞(car-t)、经改造t细胞受体(tcr)t细胞、来源于pbmc的经改造t细胞、或新生抗原反应性t细胞(nar-t)。优选地，t细胞包含新生抗原反应性t细胞(nar-t)。在一些实施方案中，t细胞被改造以表达转基因t细胞受体(tcr)，例如癌症特异性tcr(例如ny eso-1)。在一些实施方案中，t细胞是如stadtmauer et al.(science 28feb 2020:vol.367,issue 6481,eaba7365)所述的经改造细胞，或如stadtmauer et al.中所述获得的细胞。在一些实施方案中，t细胞被改造以敲除编码内源性t细胞受体的一种或更多种基因(例如，编码内源性t细胞受体链tcrα(trac)和tcrβ(trbc)的基因)或下调其的表达。在一些实施方案中，经改造t细胞是tcr转导的t细胞。在一些实施方案中，一种或更多种基因包含sit1并且经改造t细胞包含来源于pbmc的经改造t细胞。经改造t细胞可以是car-t细胞或tcr转导的t细胞。13.在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以过表达cd7和/或sirpg。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是经改造以过表达cd7的肿瘤浸润淋巴细胞，或者其中经改造t细胞不是肿瘤浸润淋巴细胞并且经改造t细胞已被改造以过表达sirpg。在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以具有降低的cd7和/或sirpg的表达。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是经改造以具有降低的sirpg的表达的肿瘤浸润淋巴细胞，或者其中经改造t细胞不是肿瘤浸润淋巴细胞并且经改造t细胞已被改造以具有降低的cd7的表达。在一些实施方案中，t细胞对于所述对象是自体的。14.在本公开内容的任何方面的一些实施方案中，增殖性病症包括实体瘤。特别地，实体瘤可以是癌性肿瘤，包括原发性肿瘤或转移的继发性肿瘤。在本公开内容的任何方面的一些实施方案中，增殖性病症包括预计具有高新生抗原负荷的肿瘤。在一些实施方案中，如果肿瘤具有高肿瘤突变负担，则预测该肿瘤具有高新生抗原负荷。如果肿瘤具有每兆碱基至少1个体细胞突变、每兆碱基至少5个体细胞突变、或每兆碱基至少体细胞突变，则可以认为该肿瘤具有高肿瘤突变负担。如果肿瘤属于具有高体细胞突变患病率(prevalence)的癌症类型(例如，每兆碱基的体细胞突变的中值至少为1、至少为5或至少为10的肿瘤类型)，则预测该肿瘤具有高新生抗原负荷。例如，肿瘤可以是黑素瘤或鳞状肺癌。alexandrov et al.(nature volume 500,pages 415–421(2013))中已经量化了多种癌症类型的体细胞突变患病率。在本公开内容任何方面的一些实施方案中，增殖性病症选自黑素瘤、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、膀胱癌、小细胞肺癌、食管癌、结直肠癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌和肝癌。15.在本公开内容的任何方面的一些实施方案中，增殖性病症包括预计已经发生免疫逃逸或处于发生免疫逃逸的风险中的肿瘤。根据本公开内容，预计已经发生免疫逃逸或处于发生免疫逃逸的风险中的肿瘤是已经获得或预测可能获得免疫治疗的抗性的肿瘤或者显示出对免疫治疗的抗性的肿瘤。这些可包括：(i)已经经历免疫治疗且对所述免疫治疗未能响应或不再响应于所述免疫治疗的患者中的肿瘤，(ii)预计不太可能响应于免疫治疗的患者中的肿瘤，其中所述患者可未经历过(免疫治疗)治疗，(iii)被确定不具有t细胞浸润或具有低t细胞浸润的肿瘤，和(iv)在肿瘤浸润t细胞群中具有高比例的功能障碍t细胞的肿瘤。在一些实施方案中，如果选自sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3的一种或更多种标志物的表达高于相应的对照值，和/或cd82的表达低于对照值，则可认为肿瘤在肿瘤浸润t细胞群中具有高比例的功能障碍t细胞，其中对照值可以对应于对照t细胞群中一种或更多种标志物的相应表达。在一些实施方案中，如果选自sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3的一种或更多种标志物的表达高于或低于相应的对照值，则可认为肿瘤在肿瘤浸润t细胞群中具有高比例的功能障碍t细胞，其中对照值可以对应于对照t细胞群中一种或更多种标志物的相应表达。对照t细胞群可以是对照肿瘤浸润t细胞群。对照t细胞群可以是不显示功能障碍表型的t细胞群。功能障碍t细胞表型可以是t细胞耗竭表型或终末分化表型。对照t细胞群可以是具有低pd1表达、低gzmb表达和/或低eomes表达的t细胞群。对照值可以对应于能够控制肿瘤增殖的对照t细胞群中的一种或更多种标志物的相应表达。对照值可以对应于在刺激之后表达ifnγ的对照t细胞群中一种或更多种标志物的相应表达。16.在任何方面的一些实施方案中，实体瘤包括癌。在一些实施方案中，癌选自非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)或肾细胞癌(renal cell carcinoma，rcc)。优选地，癌是非小细胞肺癌(nsclc)。在一些实施方案中，实体瘤包括黑素瘤。在任何方面的一些实施方案中，增殖性病症选自肺腺癌、肾透明细胞癌、胰腺腺癌、肾乳头状癌、肝细胞癌、肾上腺皮质癌和间皮瘤。17.在任何方面的一些实施方案中，降低的表达是通过一种或更多种基因的敲低(下调)或敲除来实现的。在一些实施方案中，敲除或下调是通过使用用于过表达的rna构建体或短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)的转录激活因子样效应物核酸酶(talen)瞬时下调、crispr/cas9介导的基因编辑来改造的。特别考虑了对所选基因和/或其调节元件(例如启动子)的编辑。18.在一些实施方案中，将经改造t细胞用于这样的治疗方法，所述治疗方法还包括同时、顺序或分开施用免疫检查点抑制剂治疗。在一些情况下，免疫检查点抑制剂治疗可包括ctla-4阻断、pd-1抑制、pd-l1抑制、lag-3(淋巴细胞激活3；基因id：3902)抑制、tim-3(t细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3；基因id：84868)抑制、tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体；基因id：201633)抑制和/或btla(b和t淋巴细胞相关；基因id：151888)抑制。特别地，免疫检查点抑制剂可以包含：伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)或度伐单抗(durvalumab)。19.在第二方面中，本发明提供了在哺乳动物对象中治疗增殖性病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的经改造t细胞，其中t细胞已被改造以具有经调节的选自以下的一种或更多种基因的表达：stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1和tnip3。在一些实施方案中，经改造t细胞具有降低的选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3，和/或者提高的cd7和/或sirpg的表达或者提高的cd7和/或sirpg的活性。在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以具有降低的选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、il1rap、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3，和/或者以具有提高的cd82的表达或提高的cd82的活性。20.优选地，一种或更多种基因选自stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自stom、furin、sit1和cd7。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自stom、furin、sit1、cd7、il1rap和sirpg。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、和e2f1。特别地，一种或更多种基因可以有利地选自sit1、sirpg和il1rap。优选地，一种或更多种基因包括sit1。21.在一些实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap、sirpg、axl、e2f1a、cd82、samsn1、和fcrl3。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd8+t细胞。在一些这样的实施方案中，一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap和sirpg。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自cd7、cd82、cotl1、dusp4、fabp5、itm2a、park7、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、samsn1、sit1、sirpg和tnip3。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd8+t细胞。优选地，一种或更多种基因选自cd7、cd82、samsn1、sirpg和sit1。特别地，一种或更多种基因优选地包括sit1和/或sirpg。优选地，一种或更多种基因包括sit1。22.在一些实施方案中，一种或更多种基因选自epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、ll1rap、e2f1、c5orf30、cldnd1、gfi1、rnaseh2a、sirpg和suv39h1。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd4+t细胞，例如效应cd4+t细胞。在一些实施方案中，经改造t细胞是cd4+t细胞并且一种或更多种基因选自sit1、cd7、stom、furin、il1rap、sirpg、axl、e2f1a、cd82、samsn1、和fcrl3。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin和il1rap。优选地，一种或更多种基因选自axl、furin、il1rap、stom、fcrl3、sirpg和e2f1。特别地，一种或更多种基因优选地包括sirpg和/或il1rap。23.在一些实施方案中，t细胞包含来源于pbmc的经改造t细胞、嵌合抗原受体t细胞(car-t)、经改造t细胞受体(tcr)t细胞或新生抗原反应性t细胞(nar-t)。优选地，t细胞包含新生抗原反应性t细胞(nar-t)。在一些实施方案中，t细胞经改造以表达转基因t细胞受体(tcr)，例如癌症特异性tcr(例如ny eso-1)。在一些实施方案中，一种或更多种基因包含sit1并且经改造t细胞包含来源于pbmc的经改造t细胞。在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以过表达cd7和/或sirpg。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是被改造以过表达cd7的肿瘤浸润淋巴细胞，或者其中经改造t细胞不是肿瘤浸润淋巴细胞，并且经改造t细胞已被改造以过表达sirpg。在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以具有降低的cd7和/或sirpg的表达。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是经改造以具有降低的sirpg的表达的肿瘤浸润淋巴细胞，或者其中经改造t细胞不是肿瘤浸润淋巴细胞并且经改造t细胞已被改造以具有降低的cd7表达。在一些实施方案中，t细胞对于所述对象是自体的。在自体t细胞治疗中，从对象中取出的t细胞通常是离体经改造的，例如以将t细胞靶向肿瘤上表达的抗原(例如以插入编码嵌合抗原受体的基因)。有利地，根据本发明，t细胞可以在该离体阶段期间或作为该离体阶段的一部分进行另外的改造，以在随后将t细胞返回对象之前下调一种或更多种选定基因的表达。24.在一些实施方案中，t细胞被改造以在施用于对象之前敲除一种或更多种选定基因或下调一种或更多种选定基因的表达。例如，t细胞可以被改造以敲除编码内源性t细胞受体的一种或更多种基因(例如，编码内源性t细胞受体链tcrα(trac)和tcrβ(trbc)的基因)或下调其的表达。在一些实施方案中，敲除或下调是通过使用用于过表达的rna构建体或短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)的转录激活因子样效应物核酸酶(talen)瞬时下调、crispr/cas9介导的基因编辑来改造的。25.在一些实施方案中，方法还包括向对象同时、顺序或分开施用免疫检查点抑制剂治疗。这样的组合治疗可产生抗肿瘤作用的协同增强。特别地，免疫检查点抑制剂治疗可包括ctla-4阻断、pd-1抑制、lag-3(淋巴细胞激活3；基因id：3902)抑制、tim-3(t细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3；基因id：84868)抑制、tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体；基因id：201633)抑制、btla(b和t淋巴细胞相关；基因id：151888)抑制和/或pd-l1抑制。例如，免疫检查点抑制剂可以选自：伊匹单抗、曲美木单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维单抗或度伐单抗。26.在一些实施方案中，方法还包括同时、顺序或分开施用根据第三方面的活性调节剂。27.在第三方面中，本发明提供了由选自以下的基因编码的一种或更多种蛋白质的活性调节剂：stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1和tnip3，所述活性调节剂用于增强患有增殖性病症的对象中的免疫治疗的方法中。优选地，活性调节剂是抑制剂并且一种或更多种基因选自：stom、furin、cd7、sit1、il1rap、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、e2f1、和axl。在一些实施方案中，活性调节剂是抑制剂并且一种或更多种基因选自：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3。在一些实施方案中，活性调节剂是cd82的激活剂。在一些实施方案中，活性调节剂是cd7和/或sirpg的激活剂。特别地，活性调节剂是抑制剂并且一种或更多种基因选自：sit1、sirpg和il1rap。优选地，一种或更多种基因包括sit1。活性调节剂可以是抑制剂，例如小分子抑制剂或阻断抗体。活性调节剂可以是激活剂，例如激动剂(例如激动剂抗体或配体)。28.在一些实施方案中，活性调节剂是axl、cldnd1、e2f1、fabp5、furin、il1rap、samsn1、suv39h1或tnip3的小分子抑制剂。优选地，活性调节剂是axl、cldnd1、e2f1、furin、il1rap、samsn1、suv39h1或tnip3的小分子抑制剂。axl的可用小分子抑制剂包括bgb324(bemcentinib)和tp-093(dubermatinib)。e2f1的可用小分子抑制剂包括hlm006474(calbiochem,cas 353519-63-8)。fabp5的可用小分子抑制剂包括棕榈酸(pubchem substance id 24898107)。29.在一些实施方案中，活性调节剂是(多)肽，例如结合并抑制axl、cd7、fcrl3、epha1、il1rap、itm2a、park7、pecam1、tnip3或sirpg的抗体或其片段。优选地，活性调节剂是结合并抑制axl、cd7、fcrl3、或sirpg的抗体或其片段。结合axl的抗体包括yw327.6s2(creative)、af154(r&d)和h#11b7-t11(creative)。结合cd7的抗体包括v55p2f2*b12(vertebrates antibodies limited)、rtf2(creative)和cht2(creative)。结合epha1的抗体包括2g7(creative)。结合fabp5的抗体包括hpa051895和sab1401130结合il1rap的抗体包括jg38-07(creative)。结合itm2a的抗体包括cbacn-303(creative)。结合park7的抗体包括cbl625(creative)。结合pecam1的抗体包括2h8(thermo fisher)、hrc72h88e3(creative)等。结合sirpg的抗体包括3h7(creative)和ox-119(absolute antibody)。tnip3阻断肽(nbp1-77365pep)可从novus获得。30.在一些实施方案中，免疫治疗包括免疫检查点抑制、抗肿瘤疫苗或自体t细胞治疗。在一些实施方案中，免疫治疗包括施用根据第一或第二方面的经改造t细胞。在一些实施方案中，向对象施用的抑制剂/激活剂的量或剂量足以增强对象中cd4+t细胞和/或cd8+t细胞的细胞毒性活性。31.在第四方面中，本发明提供了由选自以下的基因编码的一种或更多种蛋白质的活性调节剂：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3，所述活性调节剂用于增强患有增殖性病症的对象的免疫应答的方法中。活性调节剂可以是激活剂或抑制剂。在一些实施方案中，活性调节剂是抑制剂，优选地是由选自以下的基因编码的一种或更多种蛋白质的抑制剂：stom、furin、cd7、sit1、il1rap、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、e2f1、和axl。在一些实施方案中，活性调节剂是激活剂，优选地是由选自cd7和sirpg的基因编码的一种或更多种蛋白质的激活剂。在一些实施方案中，活性调节剂是抑制剂并且一种或更多种基因选自：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、il1rap、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3。在一些实施方案中，活性调节剂是cd82的激活剂。在一些实施方案中，活性调节剂是sit1、sirpg或il1rap的抑制剂。在一些具体实施方案中，活性调节剂是cd82的抑制剂。32.在一些实施方案中，活性调节剂是axl、cldnd1、e2f1、furin、il1rap、samsn1、suv39h1或tnip3的小分子抑制剂。在一些具体实施方案中，活性调节剂是cldnd1、e2f1、furin、il1rap、samsn1、suv39h1或tnip3的小分子抑制剂。在一些具体实施方案中，活性调节剂是il1rap的小分子抑制剂。在一些实施方案中，活性调节剂是结合并抑制axl、cd7、fcrl3、或sirpg的抗体或其片段。在一些具体实施方案中，活性调节剂是结合并抑制cd7、fcrl3或sirpg的抗体或其片段。在一些具体实施方案中，活性调节剂是结合并抑制sirpg的抗体或其片段。33.在一些实施方案中，方法还包括施用免疫治疗。在一些这样的实施方案中，免疫治疗包括免疫检查点抑制、抗肿瘤疫苗或自体t细胞治疗。在一些实施方案中，免疫治疗包括使用根据第一或第二方面的经改造t细胞的t细胞治疗。在一些实施方案中，向对象施用的抑制剂/激活剂的量或剂量足以增强对象中cd4+t细胞和/或cd8+t细胞的细胞毒性活性。34.在第五方面中，本发明提供了治疗哺乳动物对象中的增殖性病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的由选自以下的基因编码的一种或更多种蛋白质的活性调节剂：stom、furin、cd7、sit1、il1rap、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、il1rap、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3，其中活性调节剂增强对象中一种或更多种t细胞的细胞毒性活性，并从而治疗增殖性病症。35.活性调节剂可以是激活剂或抑制剂。在一些实施方案中，活性调节剂是抑制剂，优选地是由选自以下的基因编码的一种或更多种蛋白质的抑制剂：stom、furin、cd7、sit1、il1rap、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、e2f1、和axl。在一些实施方案中，活性调节剂是激活剂，优选地是由选自cd7和sirpg的基因编码的一种或更多种蛋白质的激活剂。在一些实施方案中，活性调节剂是抑制剂并且一种或更多种基因选自：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、il1rap、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3。在一些实施方案中，活性调节剂是cd82的激活剂。在一些实施方案中，活性调节剂是sit1、sirpg或il1rap的抑制剂。在一些具体实施方案中，活性调节剂是sit1的抑制剂。36.在一些实施方案中，治疗方法还包括施用根据第一或第二方面的经改造t细胞。37.在第六方面中，本发明提供了在哺乳动物对象中治疗增殖性病症的方法，其包括施用治疗有效量的根据第一或第二方面的经改造t细胞。在一些实施方案中，治疗方法还包括施用根据第三方面的活性调节剂。38.根据第七方面，本发明提供了用于产生经改造t细胞的方法，其包括对t细胞进行遗传改造以增强选自以下的一种或更多种基因的表达和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、cd82和tnip3。在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、cd82和tnip3。在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强选自cd7和sirpg的一种或更多种基因的表达。39.在一些实施方案中，方法还包括在适合扩增的条件下培养t细胞以提供扩增的细胞群。在一些实施方案中，方法在体外进行。在一些实施方案中，对t细胞进行遗传改造是通过以下来进行的：使用用于过表达的rna构建体或短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)的转录激活因子样效应物核酸酶(talen)瞬时下调、crispr/cas9介导的基因编辑，或者通过将核酸或载体引入细胞中。40.在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强cd82的表达和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3。在一些这样的实施方案中，一种或更多种基因选自axl、cd7、e2f1、fcrl3、furin、il1rap、pecam1、samsn1、sirpg、sit1、suv39h1、tnip3、和stom。在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强cd7和/或sirpg的表达，和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：stom、furin、sit1、cd7、samsn1、sirpg、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1。在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强cd82的表达和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、和e2f1。特别地，一种或更多种基因可以有利地选自sit1、sirpg和il1rap。优选地，一种或更多种基因包括sit1。41.在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强cd82的表达和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：cd7、cotl1、dusp4、fabp5、itm2a、park7、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、samsn1、sit1、sirpg和tnip3。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd8+t细胞。优选地，方法包括对t细胞进行遗传改造以增强cd82的表达和/或者敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：cd7、samsn1、sirpg和sit1。特别地，一种或更多种基因优选地包括sit1和/或sirpg。优选地，一种或更多种基因包括sit1。42.在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、和il1rap。在一些实施方案中，方法包括对t细胞进行遗传改造以敲除选自以下的一种或更多种基因或者下调选自以下的一种或更多种基因的表达：stom、furin、sit1、samsn1、cd82、fcrl3、il1rap、axl、e2f1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自：epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、il1rap、e2f1、c5orf30、cldnd1、gfi1、rnaseh2a、sirpg和suv39h1。在一些实施方案中，一种或更多种基因选自：epha1、fcrl3、pecam1、stom、axl、furin、il1rap、e2f1、c5orf30、cldnd1、gfi1、rnaseh2a、和suv39h1。在一些这样的实施方案中，经改造t细胞是cd4+t细胞，例如效应cd4+t细胞。优选地，一种或更多种基因选自100流式组群患者的人口统计详细信息。47.图2–通过流式细胞术表征nsclc肿瘤内cd4 t细胞分化情况(a至i)对来自tracerx 100组群中14名患者的44个肿瘤区域的肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行19标志物的流式细胞术。组合区域数据的无监督聚类确定了20个cd4亚群，这些亚群基于标志物表达和统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection，umap)降维空间中的共定位来手动分组为9个元集群。研究了与tmb的相关性。(a)热图代表由从所有样品中获得的流式细胞术数据的无监督聚类鉴定的所有20个集群的最小-最大级别(scaled)标志物表达。单独细胞中的数字代表集群中每种标志物的中值表达水平。左侧的条形示出每个集群内的事件数量。根据集群的表型特征和umap降维图中的共定位，将集群组合成元集群。(b)cd4分化情况的umap降维。来自(a)的元集群的位置已编号。(c)在无监督聚类的1000次迭代中的集群稳定性。细胞的集群身份(identity)是针对一次代表性迭代确定的(标签位于热图的右侧)。对于每种细胞，表示了在1000次迭代中在每个集群(标签在图下方)中被鉴定的概率。(d)肿瘤与ntl组织之间所有20个集群的差异丰度。显示了fdr调整的–log10p值和log2倍数变化值。(e)cd4群丰度与肿瘤基因组特征之间的关系。反映所测试的关系的方向和大小的p值和回归斜率(β系数)来自混合效应回归模型。(f)用于限定示例性样品的早期、tdys和tdt群的设门策略。(g)对于具有不同cd4染色的样品，显示了每个子集在所有手动设门(manually gated)中的cd4+细胞百分比。(h)早期、tdys和tdt子集丰度高vs.低的患者的无病存活(disease free survival，dfs)概率(根据中值分类)。示出了每个时间点的有风险的患者数量、对数秩p值和风险比(95％的置信区间)。(i)cd4子集丰度与阶段的关系。示出了混合效应回归模型p值(ns＝不显著)。48.图3-cd4分化偏斜(skewing)的出现与肿瘤突变负担相关。(a)来自肿瘤内cd4 t细胞的高维流式细胞术数据的迭代聚类，用于鉴定随tmb变化的群。(b)热图示出发现丰度随tmb稳定变化的群。集群丰度与tmb之间的相关性示出在右侧(皮尔逊r值)。(c)肿瘤vs.ntl组织中的差异集群丰度。示出了错误发现率调整的p值和log2倍数变化值。点的大小反映了集群的丰度。(d)评价的所有肿瘤区域中早期、tdys和tdt集群的分布。区域tmb显示在图上方。(e)在从前100名tracerx患者得到独立组群中的，早期的丧失和具有tmb的功能障碍子集的丰度增加。示出了发现组群1、验证组群2(左列和中列)和组合分析(右列)中手动设门群(以所有cd4细胞的百分比表示)的独立分析。每个点代表一个肿瘤区域，皮尔逊p值和r值与针对组织学和肿瘤多区域性校正的p值(pc)(来自混合效应回归模型)一起示出。(f)umap对cd4分化情况的降维。示出了不同tmb水平的cd4分化情况以及pd1和eomes荧光强度的分布。49.图4-早期、tdys和tdt子集的表征。(a)手动设门早期、tdys和tdt子集的pd1 vs.cd57表达谱。(b)验证组群2中手动设门子集的标志物谱。山脊图(ridge plot)示出了有助于双轴图的独立样品的标志物分布。(c)根据(a)中表示的阈值，对关键标志物呈阳性的细胞百分比。示出了wilcoxon秩和检验p值(*p《0.05，**p《0.001，***p《0.0001，ns＝不显著)。50.图5-早期、tdys和tdt子集的单一细胞转录组学特征揭示了不同的调节机制。(a)早期、tdys和tdt子集是基于流式细胞术鉴定的特征通过应用于单一细胞rnaseq数据的双轴设门策略鉴定的。示出了tdys和tdt细胞的设门方案(cd3e+cd3g+cd4+cd8-细胞被预设门(pregate)，参见图s3a)。表达值表示为经归一化的log10转换的每百万读取计数(log10cpm)。(b)tdys和tdt随早期丰度的变化(占所有cd4+细胞的百分比)。示出了皮尔逊p值和r值。(c)使用设门策略中未使用但其预期表达(log10cpm)根据流式细胞术数据分析而已知的标志物确认子集身份。每个点代表一种单独的cd4 t细胞，并且示出了wilcoxon秩和检验p值(*p《0.05，**p《0.001，***p《0.0001，ns＝不显著)。(d)示出了参与关键t细胞调节途径的基因的差异表达的热图。示出的所有基因在早期vs.tdys或早期vs.tdt之间的差异表达均》2倍，其中fdr调整的p《0.01。表达以z评分缩放的log10 cpm值表示。(e，f)tdys和tdt vs.早期的差异表达的基因中cd4功能障碍特征的富集。(g)使用charoentong et al.2017的模块，在tdys和tdt vs.早期中富集的t辅助子集特征的gsea。示出了归一化富集评分(normalised enrichment score，nes)和fdr调整的p值。51.图6–早期、tdys和tdt子集的单一细胞转录组学的表征(a)通过单一t细胞rna表达鉴定cd4早期子集的全设门策略。(b)早期、tdys和tdt子集之间典型th1、th2和tfh基因的差异表达。示出了wilcoxon秩和检验p值(*p《0.05，**p《0.001，***p《0.0001，ns＝不显著)。52.图7-早期、tdys和tdt子集的单一细胞转录组学的表征在早期、tdys和tdt群中，在单一t细胞rna表达水平上独有表达的表面蛋白编码基因(a)以及转录因子编码基因(b)。每种基因在一个子集vs.其子集中具有》4倍的差异表达，fdr调整的p《0.01。编码黏附分子和趋化因子受体(c)和含有itim的蛋白质(d)的差异表达基因；示出的所有基因在早期vs.tdys或早期vs.tdt之间的差异表达均》2倍，调整的p《0.01。(e)用于确认早期vs.tdys/tdt细胞的t中枢记忆样转录状态的gsea。示出了经归一化的富集评分(nes)和fdr调整的p值。53.图8-cd4ds的经验证的基因特征预测了肺癌存活。(a)基因特征验证概述。使用具有高维流式细胞术和rnaseq二者的区域，在流式细胞术数据中鉴定了早期、tdys和tdt子集，并在rnaseq数据中测量了表达特征，以鉴定预测独立cd4子集的丰度的基因特征。(b)选定的cd4基因特征与早期、tdys和tdt子集的丰度之间的相关性。示出了皮尔逊相关r和fdr调整的-log10 p值。进一步评价了显著相关的特征与tdys(中图)和tdt子集(右图)的关系。(c)xcell th2特征(xcell分化偏斜；xds)与tracerx rnaseq和tcga nsclc组群中的tmb相关。xds特征值是z评分缩放的，tmb值经过log10转换。示出了来自考虑肿瘤多区域性和组织学的混合效应回归模型的tracerx组群的经校正p值(pc)。示出了tcga分析的皮尔逊相关r值和p值。(d)kaplan-meier图表示具有高vs.低xds的患者的tracerx rnaseq组群中的无病存活(dfs)和tcga nsclc组群中的总存活(overall survival，os)，根据上四分位数进行分类。示出了对数秩p值、风险比和95％置信区间。(e)tracerx中的dfs与作为连续变量的xds之间的关系的多变量cox回归分析。(f)kaplan-meier图表示具有高vs.低xds的从癌症基因组图谱(tcga)可公开获得的六个组群中的无病存活(dfs)，根据上四分位数分类。示出了对数秩p值。(g)tcga组群中的dfs与作为连续变量的xds之间的关系的多变量cox回归分析，针对突变负担、阶段和t细胞浸润进行了校正。54.图9-经验证的cd4ds基因特征预测了肺癌存活。(a)三个组群中患者阶段与xds特征之间的相关性。p值来自考虑组织学和多区域性的混合效应模型。(b)tracerx rnaseq组群中的多变量cox回归，针对克隆突变负担进行了校正。(c)tcga luad和lusc中的多变量cox回归分析，其示出了xds富集与存活之间的关系。55.图10-基因特征、cd4子集丰度、tmb和dfs之间的相关性(a)tracerx rnaseq组群中分化偏斜的基因特征与cd4子集丰度之间的相关性。基因特征值已经进行z评分缩放。xue tcf7/lef1特征在具有tcf7和lef1双敲除的小鼠t细胞中富集。xds.核心特征是通过在原始xds特征中保留由tcf7/lef1敲除细胞上调的基因而获得的。xds.其他特征由剩余的xds基因组成。zheng cd4耗竭特征与通过流式细胞术测量的cd4ds不相关，并被选为阴性对照。皮尔逊p值和r值示出在图上。(b)与tmb的特征关系。(c)示出了多变量cox回归模型中与dfs的特征关系(包括t细胞浸润、组织学、阶段和tmb作为协变量(每个特征在单独的模型中进行评价))的森林图。56.图11-cd4分化偏斜与treg丰度相关。(a)手动设门foxp3+treg丰度与组合tracerx流式细胞术组群中的tmb:早期丰度比率呈正相关。ith(肿瘤内基因组异质性)定义为[克隆/总突变负担]。绘制了皮尔逊r和fdr调整的-log10 p值。(b)根据中值将区域分为高tmb vs.低tmb。在每组中，将区域根据三分位数进一步分为高、中和低cd4早期丰度(左侧图)。六个限定组中的每一个中的treg分布示出在右侧图中(示出了anova p值)。(c)先前发表的treg富集转录特征与通过流式细胞术测量的treg丰度之间的相关性，针对tracerx区域，其具有配对细胞术，以及rnaseq数据。(d)tracerx rnaseq中treg和cd4分化特征之间的关系，以及(e)tcga luad组群。示出了皮尔逊r值和p值以及针对样品多区域性校正的混合效应模型p值(pc)。(f)与tcga luad中的treg浸润呈正相关的趋化因子编码基因。在tracerx rnaseq组群中同样相关的基因被标为黑色，其他被标为灰色。(g)通过scrnaseq数据集中的早期、tdys、tdt和treg子集的编码与(f)中趋化因子相对应的趋化因子受体的基因的log10 cpm表达。特征富集值经z评分缩放。(h)tmb、cd4 t细胞分化情况变化和患者结局之间关系的拟议模型。tmb产生增强肿瘤抗原性的抗原，促进了在充满祖细胞样cd4 t细胞的肿瘤的背景下的有效免疫。抗原持续性导致cd4分化偏斜。独立于tmb，treg也促进了cd4分化偏斜。tmb的竞争性免疫促进和妥协作用之间的平衡可有助于确定患者结局。[0057]图12-cd4分化偏斜与treg丰度相关。(a)tracerx流式细胞术组群中cd57+、cd57-和总treg丰度(占所有cd4细胞的百分比)与tmb之间的关系。(b至d)tracerx腺癌(b)、鳞状细胞癌(c)和tcga lusc(d)中treg转录特征与xds之间的关系。示出了皮尔逊p值和r值，以及来自在适当的情况下考虑了样品多区域性的混合效应回归模型的经校正p值(pc)。[0058]图13-实施例2的研究中使用的tracerx.100样品的患者人口统计和总结。a.consort图。b.患者组群的临床特征和组学分析(omics analysis)。c.根据组织学亚型和组织进行流式细胞术样品总结。luad：肺腺癌，lusc：肺鳞状细胞癌。[0059]图14-新生抗原负担限定了luad中的cd8 t细胞子集情况。a.上侧图：luad til内每个flowsom集群中cd8 t细胞的频率。集群由数字限定，彩色标题表示t细胞子集分类。下侧图：每个集群的经归一化标志物表达的热图。x轴表示集群描述。b.在luad病例中的每个cd8 t细胞集群的频率vs推定的新生抗原负荷的斯皮尔曼等级相关系数，实心圆圈和箭头表示显著相关性。c.luad til中新生抗原负荷vs集群频率的相关性图。d至f.luad肿瘤中cd8 t细胞的统一流形逼近与投影显示出标志物的相对表达(d)，根据亲代子集染色的所有cd8 t细胞集群(e)或与新生抗原负荷相关的集群(f)。g.显示所示的集群(上)或手动设门cd8 t细胞子集(下)vs luad中新生抗原负荷的比率的相关性图。肿瘤区域(左)或患者(右)。所有图中的数据来自16名患者的n＝32个肿瘤区域。b、c、g中的r和padj来自由bh校正的2尾斯皮尔曼等级相关系数，fdr 0.05。luad：肺腺癌，lusc：肺鳞状细胞癌，temra：重新表达cd45ra的终末分化效应记忆细胞，tde：终末分化效应细胞，tcm：中枢记忆样细胞，trm：组织驻留记忆细胞，tdys：具有功能障碍表型的t细胞，cl：集群。[0060]图15–tracerx nsclc样品中cd8 t细胞的无监督流式细胞术分析。a.用于导出活cd8 t细胞进行聚类的设门树。直方图示出来自串联正常组织和til的cd8 t细胞中的pd-1表达。b.luad til中cd8 t细胞的原始flowsom聚类热图和树枝形结构关系图(dendogram)c.来自50次聚类迭代的luad和lusc正常组织和til中cd8 t细胞的串联flowsom热图。d.pd-1hi trm子集中指示集群的左侧直方图和右侧流式细胞术图。e.luad til中每个集群中按丰度降序排列的cd8 t细胞的频率。f.根据luad和lusc样品的组织类型，每个集群中cd8 t细胞的频率。g.来自所示患者(cruk00xx)的luad肿瘤区域(表示为r1至r6)的til样品的图例中所示的每个子集或集群中cd8 t细胞的频率。肿瘤区域luad n＝34(17名患者)，lusc n＝39(18名患者)，ntl luad＝10，lusc＝12。til：肿瘤样品，ntl：非肿瘤肺。luad：肺腺癌，lusc：肺鳞状细胞癌。temra：重新表达cd45ra的终末分化效应记忆细胞，tde：终末分化效应细胞，tcm：中枢记忆样细胞，trm：组织驻留记忆细胞，trm-dys：具有功能障碍表型的组织驻留记忆细胞，cl：集群。*padj《0.05(通过bh校正调整的双向anova)。[0061]图16–通过流式细胞术鉴定的nsclc中的cd8 t细胞子集。cd8 t细胞集群通过迭代无监督聚类进行鉴定，并根据flowsom树枝形结构关系图上的超集群形成、降维空间中的定位和功能的手动注释分类为所示的子集。有关参考，参见“实施例2-结果”。pd-1hi trm子集中的集群在最后3行中被细分。temra：重新表达cd45ra的终末分化效应记忆细胞，tde：终末分化效应细胞，tcm：中枢记忆样细胞，trm：组织驻留记忆细胞，trm-dys：具有功能障碍表型的组织驻留记忆细胞，cl：集群，icb：免疫检查点阻断，ln：淋巴结。[0062]图17–tracerx中配对正交数据的流式细胞术分析的集成。a.使用流式细胞术数据进行免疫组学相关分析的样品分析流程示意图。b.流式细胞术组群中的肿瘤区域的组学数据可用性vs样品id(患者：区域)，根据组织学区分。path.til＝浸润的病理学til估计值。c.研究中具有可用流式细胞术数据的样品中预测的新生抗原数量。d.示出了tmb和新生抗原负荷之间的相关性，样品来自流式细胞术分析中使用的n＝32tluad til样品。luad：肺腺癌，lusc：肺鳞状细胞癌。[0063]图18–luad和lusc肿瘤中cd8 t细胞的无监督和手动设门流式细胞术分析。a.luad肿瘤中cd8 t细胞的统一流形逼近与投影，示出了所示标志物的相对表达和b.根据亲代子集着色的独立集群。c.用于确认flowsom集群的手动设门策略。d.比较了luad til中通过聚类和手动设门鉴定的cd8 t细胞的频率的相关矩阵，热反映了斯皮尔曼等级相关系数。e.tdys:trm比率与x轴上表示的突变或新生抗原的数目之间的斯皮尔曼相关性热图。f.luad til中指示的cd8 t细胞集群频率与高亲和力克隆新生抗原负荷的相关性。g.luad和lusc肿瘤中cd8 t细胞集群的频率。h.lusc til中指示的cd8 t细胞集群频率与新生抗原负荷的相关性。a至d、g中的数据来自n＝33个肿瘤区域(17名患者)，e至f n＝32xy对(16名患者)。g至h中的lusc样品来自来自18名患者的n＝36(g)或n＝32xy对(h)。*padj《0.05 2尾斯皮尔曼秩检验(d，e，f，h)或双向anova(g)。《50nm＝预测的neo亲和力阈值，tmb＝肿瘤突变负担，mb＝突变负担，non-neo＝预测的非新生抗原编码突变。neo＝新生抗原。[0064]图19-与新生抗原负荷相关的cd8 t细胞表现出功能障碍的表型标志和分子标志。a.示出的标志物的荧光强度是在与新生抗原负荷相关的cd8 t细胞集群上测量的。b.tdys上指示的标志物的相对mfi vs trm集群2、3和5上的平均表达以有利于tdys的log2倍数变化表示。c.指示标志物的几何mfi与tdys设门luad cd8 t细胞中新生抗原负荷的相关性。d.为rnaseq分析分离的cd8 t细胞子集的分选逻辑，其示出了代表性患者。e.示出了来自tracerx中n＝3名nsclc患者(cruk0024、cruk0069、cruk0017)的t细胞子集的rnaseq数据的差异基因表达分析的火山图，y轴代表多重比较调整的p值(fdr 0.05下的bh)。f.使用来自nsclc和黑素瘤cd8 t细胞子集的基因集的rnaseq数据的gsea。g.用于分析rnaseq数据的9个基因集中的4个的gsea富集图。padj＝fdr 0.05下的bh校正的p值。[0065]图20–与新生抗原负担相关的cd8 t细胞群的扩展分析。a.指定集群中标志物的mfi，示出了来自16名luad患者的33个肿瘤区域的数据。对于trm集群，绘制了cl.2、3、5的平均值。b.在来自luad til的n＝32xy对中，总cd8 t细胞上指示的标志物的mfi vs新生抗原负荷的相关性。c.低和高新生抗原负荷luad til区域中hla-dr表达的直方图(中值分割)。d.示出e的分析方法的示意图。e.示出每个标志物的斯皮尔曼等级相关值与x轴上指示的集群中的新生抗原负荷的相关矩阵。*padj《0.05。[0066]图21-与新生抗原负担相关的cd8 t细胞表现出肿瘤特异性功能障碍重编程和克隆型扩增。a.16名luad患者的n＝33个肿瘤区域的非设门或cd45ra-cd57-pd-1hi cd8 t细胞中tdys(cl.1)的频率，配对t检验。b.手动设门的cd45ra-cd57-pd-1hi cd8 t细胞vs新生抗原负荷的相关性图，来自16名luad患者的n＝32xy对肿瘤区域。c.从tracerx中n＝3名nsclc患者(cruk0024、cruk0069、cruk0017)的til或匹配的正常组织中分选出来的pd-1hicd57-ccr7-cd45ra-cd8 t细胞(tdys)或所有其他cd8 t细胞(非tdys)的rnaseq数据中差异表达基因的热图。d.使用来自鼠tcr转基因新生抗原诱导的肿瘤特异性t细胞功能障碍模型(schietinger et al immunity 2016)的基因集如上所述分选的til的gsea。e.来自cruk0024、cruk0069、cruk0017的肿瘤切除的tcrseq文库中的扩增的(1000个中》2个)t细胞受体序列的数量，所述tcrseq文库在分选的t细胞子集的rnaseq数据中匹配。黑色代表来自tcrseq中存在的rnaseq的扩增tcr序列。f.在每个分选的子集中鉴定的扩增tcr中的重叠或排他性。*padj《0.05，**padj《0.01。[0067]图22–从nsclc患者中分离的新表位特异性cd8 t细胞表现出功能障碍的表型。a.对在tracerx研究的试点病例中通过mhc多聚体分析检查的新表位反应性的描述。b.相对于来自l011、l012、l021的ntl、til和n＝3新表位反应性(neo-ag til)中匹配的pbmc的pd-1mfi，误差棒代表sem。c.在患者l011中指示的群中所指示的标志物的表达。d.图例中指示的群的facs图和spice共表达谱由饼弧上示出的标志物表达限定。*padj《0.05，**padj《0.01。[0068]图23-新表位特异性cd8 t细胞表达功能障碍的基因程序，这些程序与多个组群中的突变负担相关。a.三个nsclc病例的离体til中的四种新表位反应性的mhc-多聚体鉴定，以及多聚体阳性或阴性til和匹配的ntl和pbmc上相关的pd-1表达。b.来自患者l011的多聚体阳性(n＝33)和阴性(n＝22)cd8 til的scrnaseq数据的分选策略和火山图。c.用于分析scrnaseq数据的9个基因集中的4个的gsea富集图。d.使用来自nsclc和黑素瘤cd8 t细胞子集的基因集的scrnaseq数据的gsea。e.示出了从来自小鼠和黑素瘤患者(melan.sv40 cd8 tdys)的新表位特异性cd8 t细胞和分选的tdys细胞(neo cd8 t dys)肿瘤特异性功能障碍cd8 t细胞或nsclc的初始cd8 t细胞(初始cd8 t)发展的新生抗原负荷vs基因特征的经z转换的rnaseq评分的相关性图。来自tx.100luad(上排，来自35名患者的n＝68个肿瘤区域)或tcgaluad(n＝110)的数据。来自斯皮尔曼等级相关系数的相关性图中的r值和padj。e中的误差带代表95％的置信区间。*padj《0.05，**padj《0.01。[0069]图24–新生抗原相关功能障碍cd8 t细胞基因评分的产生、验证和应用。a.来自cl.1富集的集群rnaseq(trm-dys)和来自l011的新生抗原特异性cd8 t细胞(neo.cd8)neo.cd8 scrnaseq分析的gsea前沿基因vs来自guo et al在nsclc中的“tex”标志物基因(参阅正文以供参考)。红色突出了在每个数据集或两者(被用作neo.dys评分)中富集的基因。集群频率vs rnaseq评分的b.示意图和c.相关矩阵，用于使用利用流式细胞术的配对的luad病例验证基因特征。d.举例说明了rnaseq评分与wes数据整合的示意图和e.具有rnaseq数据的tx.100样品清单，示出了luad和lusc患者的可用组学数据。f.rnaseq评分分析中使用的luad病例的肿瘤区域中的病理学til估计值由样品集的中值新生抗原负荷分割。数据示出了12名患者的24个肿瘤区域(c)和35名患者的74个区域(f)。f中的误差棒代表sem。*padj《0.05，2尾斯皮尔曼检验。[0070][0071]图25–新生抗原负荷和mhc途径中断共同定义了cd8 t细胞功能障碍。a.来自具有可用的wes加rnaseq或流数据的tx.100中luad病例的抗原加工和呈递中的突变以及肿瘤区域中的hlaloh。b.在有或没有抗原呈递缺陷的证据的情况下，luad肿瘤区域中tdys细胞的频率(n＝32个区域)。c.来自luad肿瘤区域的rnaseq数据，其示出了按新生抗原负荷(根据中值)和抗原呈递中断分类的组中的neo.tdys z-评分值。d.显示出在没有(左)或有(右)抗原呈递缺陷证据的情况下的luad肿瘤区域中新生抗原负荷vs neo.tdys rnaseq评分的相关性图。在c至d中，n＝74个肿瘤区域。*padj《0.05。**padj《0.01。分析通过anova(b至c)或2尾斯皮尔曼秩检验(d)进行。通过r到z fisher变换计算的r的差异。[0072]图26-luad中cd8 t细胞子集与新生抗原定向免疫逃逸的关联。a.在有或没有抗原呈递缺陷的肿瘤中cd8 t细胞flowsom集群的频率。来自16名luad患者的n＝32个肿瘤区域。b.在根据新生抗原负荷低或高区域(由中值限定)分组的抗原呈递缺陷分类肿瘤区域中的tdys cl.1cd8 t细胞的频率。c至d.根据c.分组或d.相关性分析vs luad肿瘤区域中的新生抗原负荷通过流式细胞术分析的有或没有抗原呈递缺陷的肿瘤区域中的tdys:trm比率。e.具有rnaseq数据的新生抗原高肿瘤区域中的新生抗原负荷，根据抗原呈递缺陷组进行区分。f至g.来自luad肿瘤区域的rnaseq数据，其示出了按新生抗原负荷(根据中值)和抗原呈递缺陷分类的组中的melan.sv40 tdys z评分值。f.显示出在没有(左)或有(右)免疫逃逸证据的luad肿瘤区域中的新生抗原负荷vs melan.sv40tdys rnaseq评分的相关性图。g.组分析。在d至e中，n＝74个肿瘤区域。h.未经治疗的luad中的cd8 t细胞分化模型。*padj《0.05。**padj《0.01。通过anova或2尾斯皮尔曼秩检验进行分析。[0073]图27–对来自tracerx的肺癌患者的样品中的靶标的验证。(a至i)通过流式细胞术分析从iv期非小细胞肺癌中获得的肿瘤浸润淋巴细胞((a)中的sirpg、(d)中的sit1和(g)中的fcrl3的数据)。在不同子集的t细胞：非αβt细胞(群1)、pd1-tim3-cd8 t细胞(非肿瘤反应性的，群2)、pd1+tim3-cd8 t细胞(肿瘤反应性的，非耗竭的，群3)、pd1+tim3+cd8 t细胞(耗竭的cd8 t细胞，群4)和pd1+tim3+cd39+41bb+cd8 t细胞(新生抗原反应性cd8 t细胞，群5)上分析靶标表达。在两个不同的患者中分析每个靶标的表达，并绘制其平均荧光强度图((b)中的sirpg、(e)中的sit1和(h)中的fcrl3的数据)并显示在每个细胞子集的直方图中((c)中的sirpg、(f)中的sit1和(i)中的fcrl3的数据)。[0074]图28-sit1敲除t细胞显示出在体外再刺激之后ifnγ的产生增加。(a至c)将人外周血单个核细胞用αcd3和αcd28抗体刺激三天。在第三天，将细胞用cas9蛋白和靶向sit1的crrna进行电穿孔。将细胞用低剂量的白介素(interleuquin)2保持培养10天。在第10天，将细胞用cell trace violet染色，并用含有αcd3和αcd28的低剂量dynabead再刺激4天。在第14天，将细胞与布雷菲德菌素a(brefeldin a)一起培养4小时以积累细胞因子。将细胞染色用于流式细胞术并在facs symphony中获得细胞。(a)培养14天之后总cd3+t细胞上sit1表达的流式细胞术分析。(b)使cell trace violet(ctv)褪色(dilute)的ifnγ+cd4和cd8细胞的流式细胞术分析，将未经刺激的细胞用作对照。(c)ifnγ+t细胞的量化，对照非编辑相对于sit-1敲除。(d)所用方案的示意图。[0075]图29-选定的提出靶标的基因敲除。将人外周血单个核细胞用αcd3和αcd28抗体刺激三天。在第三天，将细胞用cas9蛋白和靶向每个所示靶基因(sirpg、sit1、il1rap)的crrna进行电穿孔。该图示出了在左上角图中鉴定的t细胞群(cd8和cd4 t细胞)中，fmo(荧光减一)对照(每个图中的顶部曲线)、未编辑的对照(每个图中的中间曲线)和已编辑的细胞(每个图中的底部曲线)中的每个靶基因的信号(事件数)，以及在相应曲线旁边以百分比表示的阳性细胞的相关频率。[0076]图30.sit1敲除肿瘤浸润t细胞获得增强的增殖能力。将从nsclc患者获得的肿瘤浸润淋巴细胞ko并使用快速扩增方案(rapid expansion protocol，rep)扩增21天。在第21天，将细胞用ctv染色并用低剂量的αcd3/cd28珠再刺激。在四天之后，使用流式细胞术测量ctv稀释度。[0077]图31.与人t细胞共培养的表达okt3的肿瘤细胞。(a)pbmc来源的细胞：使用每个基因2种不同的crrna(命名为aa、ab、ac或ad)敲除人pbmc，然后进行cas9:crrna复合物的电穿孔。在4天之后，将经编辑的pbmc与表达抗cd3的肺肿瘤细胞(h228-oxt3)共培养。在24和72小时之后使用高维流式细胞术测量读出。(b)til：使用每个基因2种不同的crrna(命名为aa、ab、ac或ad)敲除nsclc til，然后进行cas9:crrna复合物的电穿孔。在4天之后，将经编辑的til与表达抗cd3的肺肿瘤细胞(h228-oxt3)共培养。在24和72小时后使用高维流式细胞术测量读出。[0078]图32.限定cd8 t细胞和cd4 t细胞中pd1+群的设门策略。这些图说明了用于限定cd4(b)和cd8(a)t细胞的pd1-、pd-1高和pd-1总(pd-1int+pd-1高)群的设门策略。使用了四种不同的条件：未经刺激(左上)、用包被有抗cd3和抗cd28抗体的dynabead刺激(右上)、与肺癌细胞共培养(左下)以及与经修饰以表达抗cd3的肺癌细胞共培养(右下)。这些图示出了经修饰细胞示例样品(单一furin ko扩增的til样品)的结果。[0079]图33.与人pbmc来源的t细胞共培养的表达okt3的肿瘤细胞。这些图示出了图31a中描述的实验方案的结果。(a)体外刺激对照，cd8 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+lamp-和pd1+lamp1+阳性。(b)体外刺激对照，cd4 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+lamp1-和pd1+lamp1+阳性。(c)共培养的cd8 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+lamp-和pd1+lamp1+阳性。(d)共培养的cd4 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+lamp1-和pd1+lamp1+阳性。(e)共培养的cd4 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+tim3+阳性。(f)共培养的cd8 t细胞，其在刺激72小时之后呈pd1+tim3+阳性。(a，b)未经刺激＝未经刺激的t细胞；dynabead＝用acd3/adc28覆盖的珠进行体外刺激；pma/离子霉素＝用pma和离子霉素进行体外刺激。(c，d)ctrl＝未经修饰的肿瘤细胞(x轴)；acd3＝经修饰以表达抗cd3的肿瘤细胞；1acd3 1:10＝经修饰以表达抗cd3的肿瘤细胞与未修饰的肿瘤细胞的1:10混合物；ctrl＝无规crrna(e，f)h228＝未经修饰的肿瘤细胞，h228-okt3＝经修饰以表达抗cd3的肿瘤细胞；1/10h2228-okt3＝经修饰以表达抗cd3的肿瘤细胞与未经修饰肿瘤细胞的1:10混合物；ctrl＝无规crrna。[0080]图34.h2228-okt3与nsclc til的共培养鉴定了pd1信号传导的调节物。nsclc til的敲除、与经修饰以表达抗cd3的肺癌细胞的共培养以及读出如关于图31b所解释的那样进行。该图示出的读出是cd4 t细胞群(a，b)和cd8 t细胞群(c，d)中pd-1总细胞(a，c)pd-1高细胞(b，d)的百分比。每种情况都是两次重复的结果，并示出平均值(主条)和平均值周围的标准偏差(细条)。对照是cd4 t和cd8 t细胞，其来自未经修饰的nsclc til(与经修饰以表达抗cd3的肺癌细胞共培养)。[0081]图35.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til furin ab ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。这些图比较了未经编辑的cd4 til和furin ko cd4 til(a)、未经编辑的cd8 til和furin ko cd8 til(b)之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，由流式细胞术量化。每种情况都是两次技术重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0082]图36.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til axl ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和axl ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和axl ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。对于每种情况，显示了两次重复的值，以及这些重复的平均值和平均值周围的标准偏差。[0083]图37.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til il1rap ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和il1rap ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和il1rap ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0084]图38.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til stom ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和stom ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和stom ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0085]图39.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til e2f1ako的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和e2f1a ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和e2f1a ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0086]图40.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til samsn1 ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和samsn1 ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和samsn1 ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0087]图41.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til sirpg ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和sirpg ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和sirpg ko cd8til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0088]图42.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til cd7 ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和cd7ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和cd7 ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0089]图43.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til cd82 ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和cd82ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和cd82 ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0090]图44.与h2228-okt3肿瘤细胞共培养72小时之后，cd4和cd8 nsclc til fcrl3 ko的功能性和t细胞分化的变化。如关于图31b所述进行nsclc til的敲除、共培养和读出。a.未经编辑的cd4 til和fcrl3 ko cd4 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。b.未经编辑的cd8 til和fcrl3 ko cd8 til之间的功能性和t细胞分化的代表性标志物的阳性群的频率，通过流式细胞术量化。每种情况都是两次重复的结果，并显示平均值和平均值附近的标准偏差。[0091]表1-用使用的crispr rna序列进行的crispr-cas9敲除所靶向的基因列表。具体实施方式[0092]在描述本发明时，将采用以下术语，并且其旨在如以下所指示进行定义。[0093]在前述说明书中、或在所附权利要求中、或在附图中公开的以其特定的形式或者在用于进行所公开的功能的方式或者用于获得所公开的结果的方法或工艺方面表示的特征可以适当地分别或以这样的特征的任何组合用于以其多种形式实现本发明。[0094]虽然已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开内容时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，以上阐述的本发明的示例性实施方案被认为是举例说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方案进行多种改变。[0095]为了避免任何疑问，出于改善读者的理解的目的提供了本文中提供的任何理论说明。本发明人不希望受到任何这些理论说明的束缚。[0096]本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。[0097]在整个说明书(包括所附的权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和“包括”以及变化形式将被理解为暗示包含所指出的整体或步骤或者整体或步骤的组，但是不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。[0098]必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。范围可在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用在前的“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一个实施方案。与数值相关的术语“约”是任选地，并且意指例如+/-10％。[0099]axl：本文中使用的“axl”是指由基因axl编码的酪氨酸蛋白激酶受体ufo蛋白。人axl蛋白的uniprot登录号是p30530。人bcl6的氨基酸序列以uniprot p30530-1显示，日期为2018年3月28日-v4(通过引用整体并入本文)。人axl基因的geneid是558。[0100]axl抑制剂：本文中使用的“axl抑制剂”是指抑制axl作为受体酪氨酸激酶的功能的化合物或药剂(包括干扰axl基因表达的药剂，例如rnai)。在一些实施方案中，axl抑制剂可以是小分子或肽。在一些实施方案中，axl抑制剂可以是小分子抑制剂bgb324(bemcentinib)或tp-093(dubermatinib)。在另一个实施方案中，axl抑制剂可以是抗体yw327.6s2(creative)、af154(r&d )或h#11b7-t11(creative)、或其衍生物。[0101]sit-1：“sit-1”(信号传导阈值调节跨膜衔接蛋白1，在本文中也称为“sit1”)由基因sit1编码。人sit-1的uniprot登录号是q9y3p8。人sit-1的氨基酸序列以q9y3p8-1显示，日期为1999年11月1日-v1(通过引用整体并入本文)。人sit-1基因的geneid是27240。[0102]samsn1：“samsn1”(含有sam结构域的蛋白质samsn-1)由基因samsn1编码。人samsn1的uniprot登录号是q9nsi8。人samsn1的氨基酸序列以q9nsi8-1显示，日期为2000年10月1日-v1(通过引用整体并入本文)。人samsn1基因的geneid是64092。[0103]sirpg：“sirpg”(信号调节蛋白γ)由sirpg基因编码。人sirpg的uniprot登录号是q9p1w8。人sirpg的氨基酸序列以q9p1w8-1显示，日期为2007年1月23日-v3(通过引用整体并入本文)。人sirpg基因的geneid是55423。[0104]cd7：“cd7”(t细胞抗原cd7)由基因cd7编码。人cd7的uniprot登录号是p09564。人cd7的氨基酸序列以p09564-1显示，日期为1989年7月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人cd7基因的geneid是924。[0105]cd82：“cd82”(cd82抗原)由基因cd82编码。人cd82的uniprot登录号是p27701。人cd82的氨基酸序列以p27701-1显示，日期为1992年8月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人cd82基因的geneid为3732。之前提出了cd82活性和免疫功能之间的关联(参见例如shibagaki et al.,eur j immunol.1999dec；29(12):4081-91和eur j immunol.1998apr；28(4):1125-33；lebel-binay s et al.,j immunol.1995jul1；155(1):101-10；laguadriere-gesbert et al.,eur j immunol.1998dec；28(12):4332-4344)。然而，本发明人首次证明cd82在功能障碍的t细胞中异常表达，并且增强cd82活性(通过蛋白质的表达或活化)可用于治疗增殖性病症。[0106]fcrl3：“fcrl3”(fc受体样蛋白3)由基因fcrl3编码。人fcrl3的uniprot登录号是q96p31。人fcrl3的氨基酸序列以q96p31-1显示，日期为2001年12月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人fcrl3基因的geneid是115352。[0107]il1rap：“il1rap”(白介素-1受体辅助蛋白)由基因il1rap编码。人il1rap的uniprot登录号是q9nph3。人il1rap的氨基酸序列以q9nph3-1显示，日期为2003年8月22日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人il1rap基因的geneid是3556。[0108]弗林蛋白酶：“弗林蛋白酶”由基因furin编码。人弗林蛋白酶的uniprot登录号是p09958。人弗林蛋白酶的氨基酸序列以p09958-1显示，日期为1990年4月1日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人furin基因的geneid是5045。[0109]stom：“stom”(红细胞带7完整膜蛋白)由基因stom编码。人stom的uniprot登录号是p27105。人stom的氨基酸序列以p27105-1显示，日期为2007年1月23日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人stom基因的geneid是2040。[0110]e2f1：“e2f1”(转录因子e2f1)由基因e2f1编码。e2f1a是指e2f1的e2f1a转录物。因此，本文对“e2f1a”的任何提及应解释为指代e2f1，并且对“e2f1”的任何提及应解释为包含e2f1a。人e2f1的uniprot登录号是q01094。人e2f1的氨基酸序列以q01094-1显示，日期为1993年7月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人e2f1基因的geneid是1869。[0111]c5orf30：“c5orf30”(unc119结合蛋白c5orf30)由基因c5orf30编码。人c5orf30的uniprot登录号是q96gv9。人crorf30的氨基酸序列以q96gv9-1显示，日期为2001年12月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人c5orf30基因的geneid是90355。[0112]cldn1：“cldn1”(密封蛋白-1)由基因cldn1编码。人cldn1的uniprot登录号是o95832。人cldn1的氨基酸序列以o95832-1显示，日期为1999年5月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人cldn1基因的geneid是9076。[0113]cotl1：“cotl1”(毛状样蛋白)由基因xx编码。人cotl1的uniprot登录号是q14019。人cotl1的氨基酸序列以q14019-1显示，日期为2007年1月23日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人cotl1基因的geneid是23406。[0114]dusp4：“dusp4”(双特异性蛋白磷酸酶4)由基因dusp4编码。人dusp4的uniprot登录号是q13115。人dusp4的氨基酸序列以q13115-1显示，日期为1996年11月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人dusp4基因的geneid是1846。[0115]epha1：“epha1”(肝配蛋白a型受体1)由基因epha1编码。人epha1的uniprot登录号是p21709。人epha1的氨基酸序列以p21709-1显示，日期为2011年1月11日-v4(通过引用将其整体并入本文)。人epha1基因的geneid是2041。[0116]fabp5：“fabp5”(脂肪酸结合蛋白5)由基因fabp5编码。人fabp5的uniprot登录号是q01469。人fabp5的氨基酸序列以q01469-1显示，日期为2007年1月23日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人fabp5基因的geneid是2171。[0117]gfi1：“gfi1”(锌指蛋白gfi-1)由基因gfi1编码。人gfi1的uniprot登录号是q99684。人gfi1的氨基酸序列以q99684-1显示，日期为2003年8月15日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人gfi1基因的geneid为2672。[0118]itm2a：“itm2a”(完整膜蛋白2a)由基因itm2a编码。人itm2a的uniprot登录号是o43736。人itm2a的氨基酸序列以o43736-1显示，日期为1999年7月15日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人itm2a基因的geneid是9452。[0119]park7：“park7”(蛋白质/核酸去糖化酶dj-1)由基因park7编码。人park7的uniprot登录号是q99497。人park7的氨基酸序列以q99497-1显示，日期为2004年7月5日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人park7基因的geneid是11315。[0120]pecam1：“pecam1”(血小板内皮细胞黏附分子)由基因pecam1编码。人pecam1的uniprot登录号是p16284。人pecam1的氨基酸序列以p16284-1显示，日期为2018年3月28日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人pecam1基因的geneid为5175。[0121]phlda1：“phlda1”(普列克底物蛋白同源物样结构域家族a成员1)由基因phlda1编码。人phlda1的uniprot登录号是q8wv24。人phlda1的氨基酸序列以q8wv24-1显示，日期为2009年5月5日-v4(通过引用将其整体并入本文)。人phlda1基因的geneid是22822。[0122]rab27a：“rab27a”(ras相关蛋白rab-27a)由基因rab27a编码。人rab27a的uniprot登录号是p51159。人rab27a的氨基酸序列以p51159-1显示，日期为2006年10月17日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人rab27a基因的geneid是5873。[0123]rbpj：“rbpj”(无毛的重组结合蛋白抑制剂，也称为cbf-1、jκ-重组信号结合蛋白、rbp-j、rbp-jk和肾癌抗原ny-ren-30)由基因rbpj编码。人rbpj的uniprot登录号是q06330，并且uniprot标识符是suh_human。人rbpj的氨基酸序列以q06330-1显示，日期为2011年6月28日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人rbpj基因的geneid是3516。[0124]rgs1：“rgs1”(g蛋白信号传导调节物1)由基因rgs1编码。人rgs1的uniprot登录号是q08116。人rgs1的氨基酸序列以q08116-1显示，日期为2009年3月24日-v3(通过引用将其整体并入本文)。人rgs1基因的geneid是5996。[0125]rgs2：“rgs2”(g蛋白信号传导调节物2)由基因rgs2编码。人rgs2的uniprot登录号是p41220。人rgs2的氨基酸序列以p41220-1显示，日期为1995年2月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人rgs2基因的geneid是5997。[0126]rnaseh2a：“rnaseh2a”(核糖核酸酶h2亚基a)由基因rnaseh2a编码。人rnaseh2a的uniprot登录号是o75792。人rnaseh2a的氨基酸序列以o75792-1显示，日期为2002年5月15日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人rnaseh2a基因的geneid是10535。[0127]suv39h1：“suv39h1”(组蛋白-赖氨酸n-甲基转移酶suv39h1)由基因suv39h1编码。人suv39h1的uniprot登录号是o43463。人suv39h1的氨基酸序列以o43463-1显示，日期为1998年6月1日-v1(通过引用将其整体并入本文)。人suv39h1基因的geneid是6839。[0128]tnip3：“tnip3”(tnfaip3相互作用蛋白3)由基因tnip3编码。人tnip3的uniprot登录号是q96kp6。人tnip3的氨基酸序列以q96kp6-1显示，日期为2009年11月24日-v2(通过引用将其整体并入本文)。人tnip3基因的geneid是79931。[0129]嵌合抗原受体[0130]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是提供抗原结合和t细胞活化功能二者的重组受体分子。例如，在dotti et al.,immunol rev(2014)257(1)中回顾了car结构和改造，该文献通过引用整体并入于此。[0131]car包含与跨膜结构域连接的抗原结合结构域以及信号传导结构域。任选的铰链结构域可以提供抗原结合结构域与跨膜结构域之间的分隔，并且可以充当柔性接头。[0132]car的抗原结合结构域可以基于抗体的抗原结合区，所述抗体对car所靶向的抗原具有特异性。例如，car的抗原结合结构域可以包含与靶蛋白特异性结合的抗体的互补决定区(complementarity-determining region，cdr)的氨基酸序列。car的抗原结合结构域可以包含与靶蛋白特异性结合的抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列或由其组成。抗原结合结构域可以作为包含抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列的序列的单链可变片段(scfv)提供。car的抗原结合结构域可以基于其他蛋白质:蛋白质相互作用(例如配体:受体结合)来靶向抗原；例如，已经使用基于il-13的抗原结合结构域开发了靶向il-13rα2的car(参见例如kahlon etal.2004cancer res 64(24):9160-9166)。[0133]跨膜结构域位于car的抗原结合结构域与信号传导结构域之间。跨膜结构域提供用于将car锚定到表达car的细胞的细胞膜上，其中抗原结合结构域位于胞外空间，而信号传导结构域位于细胞内部。car的跨膜结构域可以来源于cd3-ζ、cd4、cd8或cd28的跨膜区序列。[0134]信号传导结构域允许活化t细胞。car信号传导结构域可包含cd3-ζ胞内结构域的氨基酸序列，其为表达car的t细胞的磷酸化和活化提供了免疫受体酪氨酸激活模体(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，itam)。包含其他含itam的蛋白质序列的信号传导结构域也已用于car，例如包含fcγri的含itam区域的结构域(haynes et al.,2001j immunol 166(1):182-187)。包含来源于cd3-ζ胞内结构域的信号传导结构域的car通常被称为第一代car。[0135]car的信号传导结构域还可以包含来源于共刺激分子的信号传导结构域的共刺激序列，以促进与靶蛋白结合之后表达car的t细胞的活化。合适的共刺激分子包括cd28、ox40、4-1bb、icos和cd27。具有包含另外共刺激序列的信号传导结构域的car通常被称为第二代car。[0136]在一些情况下，car被改造以提供不同胞内信号传导途径的共刺激。例如，与cd28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(p13k)途径，而4-1bb介导的信号传导是通过tnf受体相关因子(traf)衔接蛋白。因此，car的信号传导结构域有时包含来源于超过一种共刺激分子的信号传导结构域的共刺激序列。包含具有多个共刺激序列的信号传导结构域的car通常被称为第三代car。[0137]任选的铰链区可以提供抗原结合结构域与跨膜结构域之间的分隔，并且可以充当柔性接头。铰链区可以是允许结合部分以不同方向定向的柔性结构域。铰链区可以来源于免疫球蛋白的igg1或ch2ch3区域。[0138]新生抗原反应性t细胞(nar-t)[0139]新生抗原是新形成的抗原，其以前没有呈递给免疫系统。新生抗原是肿瘤特异性的，它是癌细胞内突变的结果，并因此不被健康(即非肿瘤)细胞表达。[0140]与野生型健康细胞表达的非突变蛋白质相比，新生抗原可由改变癌细胞所表达的蛋白质的任何非沉默突变引起。例如，突变蛋白质可以是易位或融合。[0141]“突变”是指与来自同一个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中核苷酸序列(例如dna或rna)的差异。核苷酸序列的差异可导致来自同一个体的健康细胞不表达的蛋白质的表达。例如，突变可以是单核苷酸变体(single nucleotide variant，snv)、多核苷酸变体、缺失突变、插入突变、易位、错义突变、或剪接位点突变，其导致氨基酸序列变化(编码突变)。[0142]人白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)系统是编码人中的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)蛋白的基因复合物。可以加工新生抗原以产生不同的肽，当在mhc分子的环境中呈递时，这些肽可以被t细胞识别。这样呈递的新生抗原可代表对象中治疗或预防癌症的治疗性或预防性干预的靶标。[0143]干预可以包括主动免疫治疗方法，例如向对象施用包含新生抗原的免疫原性组合物或疫苗。或者，可以采用被动免疫治疗方法，例如过继性t细胞转移或b细胞转移，其中识别新生抗原的t和/或b细胞从肿瘤或其他身体组织(包括但不限于淋巴结、血液或腹水)分离，离体或体外扩增并重新施用于对象。[0144]t细胞可以在已知为t细胞提供促有丝分裂刺激的条件下通过离体培养进行扩增。例如，t细胞可以与细胞因子(例如il-2)或促有丝分裂抗体(例如抗cd3和/或cd28)一起培养。t细胞可以与可能已被辐照的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，apc)共培养。apc可以是树突状细胞或b细胞。树突状细胞可能已经用含有已鉴定新生抗原的肽作为单一刺激剂或作为刺激新生抗原肽的合并物进行脉冲。t细胞的扩增可以使用本领域已知的方法进行，包括例如使用提供另外共刺激信号的人工抗原呈递细胞(artificial antigen presenting cell，aapc)以及呈递适当肽的自体pbmc。自体pbmc可以用含有新生抗原的肽作为单一刺激剂，或者作为刺激新生抗原的合并物进行脉冲。[0145]经改造t细胞[0146]本发明提供了经改造t细胞，其中选自以下的基因的表达或者由这些基因编码的蛋白质的表达或活性已被调节以增强细胞毒性活性：sit1、samsn1、sirpg、cd7、cd82、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3。事实上，发现上述基因与肿瘤浸润t细胞中的功能障碍表型相关。特别地，在这些功能障碍的群中观察到sit1、samsn1、sirpg、cd7、fcrl3、il1rap、furin、stom、axl、e2f1、c5orf30、cldnd1、cotl1、dusp4、epha1、fabp5、gfi1、itm2a、park7、pecam1、phlda1、rab27a、rbpj、rgs1、rgs2、rnaseh2a、suv39h1、和tnip3的表达上调，以及cd82的下调。[0147]细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是人或非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括奶牛(cow))，例如奶牛(dairy cow)，或牛目(order bos)中的任何动物)、马(包括马科(order equidae)中的任何动物)、驴和非人灵长类)。[0148]在一些实施方案中，细胞可以来自人对象或可以已经从人对象获得。[0149]细胞可以是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施方案中，细胞是靶蛋白反应性car-t细胞。在本文的实施方案中，“靶蛋白反应性”car-t细胞是这样的细胞，其响应于car的抗原结合结构域所具有特异性(例如在细胞表面表达)的靶蛋白而表现出t细胞的某些功能特性。在一些实施方案中，特性是与效应t细胞(例如细胞毒性t细胞)相关的功能特性。[0150]在一些实施方案中，经改造t细胞可以表现出一种或更多种以下特性：对包含或表达靶蛋白的细胞的细胞毒性；增殖、ifnγ表达提高、cd107a表达提高、il-2表达提高、tnfα表达提高、穿孔素表达提高、颗粒酶b表达提高、颗粒溶素表达提高、和/或fas配体(fasl)表达提高(响应于靶蛋白或者包含或表达靶蛋白的细胞)。[0151]在一些实施方案中，经改造t细胞表达经改造t细胞受体。例如，经改造t细胞可以表达癌症特异性t细胞受体，例如ny-eso-1t细胞受体。在一些实施方案中，经改造t细胞不表达内源性t细胞受体。在一些实施方案中，经改造t细胞不表达免疫检查点分子程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)。在一些实施方案中，经改造t细胞已被改造以移除内源性t细胞受体和/或免疫检查点分子程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)。在一些实施方案中，经改造t细胞是如stadtmauer et al.(science 28feb 2020