CD146及其在纤维化的诊断和治疗中作为生物标志物和治疗靶点的用途

　　本发明涉及医学领域，特别是涉及纤维化的诊断和治疗。更具体来说，本发明涉及cd146及其在纤维化的诊断中作为生物标志物和在纤维化的治疗中作为治疗靶点的用途。本发明还涉及在对象中检测对纤维化的易感性，诊断、预后和/或监测纤维化的组合物和方法。本发明还涉及用于在对象中预防或治疗纤维化的cd146抑制剂和包含cd146抑制剂的组合物，以及在诊断或治疗背景中的组合物、试剂盒及其用途。

　　背景技术：

　　：纤维化是在修复性或反应性过程中在器官或组织中形成过多的纤维结缔组织。从生理学上讲，纤维化的作用是沉积结缔组织，这会消除下方器官或组织的体系结构和功能。由细胞外基质(ecm)蛋白的病理性积累所定义，纤维化引起瘢痕形成和受影响组织的增厚。它实质上是夸张的伤口愈合反应，干扰了正常的器官功能。组织变得更加僵硬并丧失功能。纤维化与瘢痕形成过程相似，因为两者都涉及受刺激的成纤维细胞铺放包括胶原蛋白和糖胺聚糖的结缔组织。当免疫细胞例如巨噬细胞释放刺激成纤维细胞的可溶性因子时，所述过程开始。表征最充分的促纤维化介导物是tgfβ，它由巨噬细胞以及任何受损的被称为间质的表面之间的组织释放。纤维化的其他已知可溶性介导物包括ctgf、血小板衍生生长因子(pdgf)和白介素4(il-4)。自身免疫疾病也可导致纤维化。这个组织修复过程是复杂的，其中ecm的合成和降解的严格调控确保维持正常的组织体系结构。所述整个过程尽管是必需的，然而如果组织损伤是严重或重复性的，或者如果伤口愈合反应本身变得失调，则可能导致进行性的不可逆的纤维化反应。纤维化可发生在体内的器官和许多组织中，通常是炎症或损伤的结果，其实例包括心脏(心房纤维化、心内膜心肌纤维化、梗塞特别是陈旧性心肌梗塞)、肾脏(肾纤维化)、肝脏(肝硬化、胆道闭锁)、肺(进行性大块纤维化)、脑(胶质瘢痕)、动脉(动脉僵硬)、关节例如膝或肩(关节纤维化)、肠(克罗恩病)、手、手指(杜普伊特伦挛缩)、皮肤(瘢痕疙瘩、肾源性系统性纤维化)、纵隔软组织(纵隔纤维化)、腹膜后软组织(腹膜后纤维化)、骨髓(骨髓纤维化)等。肾小球疾病可以逐步或迅速导致肾纤维化和慢性肾病(ckd)。快速进行性或新月体性肾小球肾炎(gn)是一组罕见的肾脏疾病，作为显著炎症并伴有肾小球损伤和新月体出现的结果，它们可能会迅速发展至晚期肾衰竭(mathieson,p，2007)。其他的肾区室也受到影响，包括肾小管间质，其表现出导致肾间质纤维化的炎症。这种结构性病变的功能性结果是肾功能的迅速恶化(moeller,m.j，2013)。尽管几项主要是关于实验性gn的临床前模型的研究提供了关于炎症过程和随之而来的纤维化两方面的病理生理学进展，但对所述疾病的调控和进展的分子认识仍然有限，并且当前的治疗仍仅仅部分有效。心肌纤维化是对某些形式的心脏病例如心肌梗塞、某些心肌病或高血压做出响应而自发发生的一种创伤愈合过程。它的特征在于细胞外基质蛋白(纤连蛋白、i型和iii型胶原蛋白)的沉积增加，并伴有参与基质降解的金属蛋白酶(mmp)的表达降低(talman和ruskoaho，2016)。这种组织积累造成受伤心脏的刚性增加和顺应性下降，心脏不仅丧失其收缩和松弛的能力，而且丧失其驱动固有心脏电活动的能力。所有这些变化最终导致患者发生心功能不全，从长远来看会导致心脏骤停(chaturvedi等，2010)。心肌纤维化根据其在心肌中的位置分为两类：-“反应性/间质性”纤维化，其对应于纤维化扩展到心肌细胞之间的间隙空间中。这种类型的纤维化在衰老的背景下得到了更具体的描述(chen和frangogiannis，2010；mays等，1991)。事实上，许多工作已显示，心脏衰老与变得肥大的心肌细胞的总数的减少以及心肌胶原蛋白沉积的显著增加相关。这些变化造成心脏顺应性下降，从而导致舒张功能障碍的建立而收缩功能得以保留(biernacka和frangogiannis，2011)，和-“修复性纤维化”，其是指对心脏病例如心肌梗塞做出响应的瘢痕组织形成(weber，1989)。目前，控制心肌纤维化的有害过程的有效疗法很少。因此，寻找抑制或逆转这一过程的新疗法是重要的公共卫生问题。由于人口老龄化和心血管疾病风险因子(糖尿病、肥胖和高血压)的加重，伴有纤维化的病症的频率显著增加。到目前为止，尚无可用于检测纤维化的特异性生物标志物。量化纤维化的唯一方式是组织活检。同样，没有可用于治疗纤维化的治疗方法，特别是没有可以逆转纤维化过程的治疗方法。仍然缺少一种诊断和监测纤维化或确定患者是否具有发生纤维化的风险的简单可靠且特异性的测试，并且所述测试对于快速建立旨在保护或改善患者健康的预防和治疗策略具有很高价值。这是本发明的目的。技术实现要素：本发明人在本文中首次将cd146鉴定为在纤维化的诊断中特别令人感兴趣的生物标志物以及在纤维化的治疗中有利的治疗靶点或治疗工具。因此，本文中描述了cd146蛋白，特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146(scd146)蛋白或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白，它们在对象中通常作为生物标志物，用于对纤维化特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性的检测，用于所述纤维化的诊断和/或预后，或用于所述纤维化的监测。本文还描述了一种在对象中检测对纤维化特别是心肌、肾、皮肤或肺纤维化的易感性或诊断和/或预后所述纤维化的体外、离体或体内方法。这种方法通常包括确定所述对象的生物样品中cd146蛋白的表达水平，通常是可溶性cd146蛋白的表达水平，特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的表达水平、seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的表达水平或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白的表达水平的步骤。本文还描述了一种在对象中监测纤维化、优选为心肌或肾纤维化的体外、离体或体内方法。所述方法通常包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中cd146蛋白的表达水平、特别是可溶性cd146蛋白的表达水平，所述可溶性cd146蛋白选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。本文还描述了一种在对象中监测纤维化、特别是皮肤或肺纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的人类可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。本文还描述了一种在对象中监测纤维化、特别是皮肤或肺纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点确定所述对象的生物样品中seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更低的可溶性cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更高的人类可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。本文还描述了一种cd146抑制剂，特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂，其用于在对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。本文还描述了一种cd146抑制剂，特别是seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂，其用于在对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是皮肤或肺纤维化。本文还公开了cd146抑制剂、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂的用途，其用于体外或离体制备组合物，以(用于)在需要的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。本发明人还在本文中提供了一种组合物，其包含cd146抑制剂、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂和可药用载体，用于在对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化。本文还描述了一种组合物，其包含cd146蛋白、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白和可药用载体，用于在对象、优选为人类中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化。本发明人还在本文中描述了一种针对cd146蛋白、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白、seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白的抗体及其片段。本文中新描述的优选抗体或其片段包含seqidno：94、seqidno：95和seqidno：96的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：97、序列fas和seqidno：98的轻链可变区(vl)cdr多肽序列。另一种本文新描述的抗体是包含seqidno：87、seqidno：88和seqidno：89的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：90、序列qvs和seqidno：91的轻链可变区(vl)cdr多肽序列的抗体或其片段。本发明人在本文中还描述了一种在对象中诊断纤维化、特别是心肌或肾纤维化的方法。这种方法通常包括在所述对象的生物样品中，通常在所述对象的血清中检测并优选地定量cd146、优选为选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146蛋白的量的步骤。这种方法通常涉及使用本文中描述的结合cd146蛋白、优选为scd146蛋白的抗体。本发明人还在本文中描述了一种在需要的对象中，通常是在已通过本文描述的方法鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象中治疗纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的方法。这种方法通常包括向所述对象给药通常为有效量的cd146抑制剂、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂或包含此类cd146抑制剂的组合物的步骤。还描述了一种体外、离体或体内监测药物、通常是cd146抑制剂、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂或组合物用于治疗纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的效能的方法。这种方法通常包括将在任何纤维化治疗之前来自于对象的第一生物样品中cd146、通常为可溶性cd146的表达，与已暴露于用于治疗纤维化的药物或组合物的同一对象的第二生物样品中cd146、通常为可溶性cd146的表达进行比较的步骤。另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含本文中描述的产品、通常为蛋白、(可溶性)cd146的抑制剂或组合物中的任一者或多者。通常，所述试剂盒还包含根据所公开的方法使用所述蛋白质、抑制剂或组合物的说明书。发明详述cd146是一种属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。已知它与内皮通透性、炎症和血管生成有关。膜型cd146是在无论任何血管口径或解剖区域的血管树的所有内皮细胞中检测到的一种粘附蛋白(bardin,n.2001；georgesf1991)。它主要位于细胞间连接处，并控制内皮细胞之间的内聚和细胞旁通透性(anfosso,f.,2001；solovey,a.n.,2001；jouve,n.,2015)，但是也控制单核细胞迁移(bardin,n.,2009)和血管生成(chan,b.,2005；harhouri,k.,2010；yan,x.,2003；haltjki,2016)。cd146以不同的同工型存在：带有假定的pdz结合基序的短同工型(kebir,a.,s.2001；taira,e.,1995；vainio,o.,1996)，所述结合基序可能介导其锚定到细胞骨架；带有假定的内吞作用基序的长同工型(guezguez,b.,2007)；以及作为膜cd146的金属蛋白酶依赖性脱落的结果的可溶性形式(scd146)(bardin,n.,2003；boneberg,e.m.,2009)。scd146可以在人类血清中检测到，并且其水平在不同病症例如炎性肠病(bardin,n.,2006)、异常妊娠(pasquier,e.,2005)或慢性肾衰(bardin,n.,2003)中受到调节。本发明人在本文中首次证实了cd146的短的和长的膜同工型分别通过tace和adam10蛋白酶脱落。此外，rna测序实验揭示出存在两种可选的scd146剪接变体，在本文中被鉴定为“i5-13-scd146”(或i5-13可溶性cd146)和“i10-scd146”(或i10可溶性cd146)。此外，本发明人已发现并且现在在本文中首次描述，cd146、通常为scd146可以有利地在纤维化诊断中用作生物标志物并在纤维化治疗中用作治疗靶点或治疗工具。对用于在对象中检测对纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性，用于所述纤维化的诊断和/或预后或用于所述纤维化的监测来说，cd146是特别有利的。在本发明的情形中，cd146通常是cd146蛋白，例如膜型cd146或可溶性cd146(scd146)，优选为选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146蛋白、seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白，正如在下文中进一步描述的。更准确来说，本发明人首次证实了可溶性cd146、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146蛋白参与心肌和肾纤维化的建立，并因此是心肌和肾纤维化的生物标志物。事实上，本发明人显示，scd146刺激造成纤维化的细胞，即成纤维细胞和内皮细胞。本发明人的实验具体来说证实了在严重肾纤维化诱导的两种模型(由肾小球基底膜血清诱导的模型和输尿管单侧梗阻模型)中cd146极大增加，并且循环血中scd146的浓度升高；在使用cd146的ko小鼠时对纤维化的影响大大降低。他们还证实了在小鼠中，在心肌梗塞模型中cd146和scd146增加；与对照动物相比，在cd146的ko动物中心肌梗塞后纤维化的量减少，并且与野生型(wt)小鼠相比，在kocd146小鼠中老年小鼠心肌纤维化的发生减少。他们还证实了可溶性cd146、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146蛋白在心脏和肾脏中具有促纤维化活性，因此是用于治疗心肌纤维化和/或肾纤维化的治疗靶点。因此，在选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂、特别是针对这种scd146蛋白的单克隆抗体存在下，纤维化现象可以被阻止或逆转。另一方面，本发明人证实了可溶性cd146、特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146蛋白在皮肤和肺中具有抗纤维化活性，因此可用于在对象中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化。本发明人还证实了新鉴定的同工型seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白和seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白均为纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的生物标志物。然而，这两种同工型不以相同的方式变化。在纤维化中i5-13可溶性cd146被上调，而i10可溶性cd146被下调。i5-13是用于治疗纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的治疗靶点，而i10可用作在对象中预防或治疗纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的治疗工具。正如上文中指明的，纤维化可能在缺血事件例如心肌梗塞后、在免疫疾病的情形中以及在衰老期间发生。术语“对象”是指任何可试验的对象，并且通常是指患者。优选地，所述对象是哺乳动物，甚至更优选为人类。本发明可用于个体和整个群体两者。所述对象不论其年龄或性别如何均可被试验。“人类长cd146蛋白”或“长cd146”是指主要存在于内皮细胞的膜中并具有对应于本文中描述的seqidno：10的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子。“人类短cd146蛋白”或“短cd146”是指主要存在于内皮细胞的膜中并具有对应于本文中描述的seqidno：11的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子。“人类可溶性cd146蛋白”或“可溶性cd146”或“scd146”通常是指人类蛋白、肽或氨基酸分子。这种scd146蛋白通常存在于人类血清中。根据本发明的特定人类可溶性cd146蛋白包含选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列构成。在seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7中，seqidno：7是在本发明的其中所述对象是哺乳动物、特别是人类的情形中可用的优选人类可溶性cd146蛋白。正如前面解释的，根据本发明的典型scd146蛋白是在诊断情形中可用作生物标志物，并且在治疗性或预防性治疗的情形中可用作治疗靶点或治疗工具的蛋白质。本说明书还描述了相应地编码本文中描述的本发明的蛋白的核酸分子。此类核酸分子是rna或dna，它们通常编码具有生物活性的人类cd146蛋白、特别是人类可溶性cd146蛋白，或者可用于制备其重组形式。术语“治疗”或“疗法”是指治疗性和预防性治疗或措施两者，它们能够减轻、减缓或治愈(逆转)纤维化或导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态，通常为任何人类纤维化疾病。此类疾病的实例包括心房纤维化、心内膜心肌纤维化、梗塞特别是陈旧性心肌梗塞、肾纤维化、肝硬化、胆管闭锁、进行性大块纤维化、胶质瘢痕、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩病、杜普伊特伦挛缩、肾源性系统性纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、骨髓纤维化、系统性硬化等。这种“治疗”通常打算用于上文中所定义的需要的对象，通常为哺乳动物对象，优选为人类对象。被认为是此类对象的是患有导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象，或被认为“有风险发生”或被怀疑有风险发生此类必须被预防的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象。例如，所述患者可以是易于(或被怀疑易于)发生纤维化或本文中描述的导致纤维化、由纤维化引起或与纤维化相关的病症、疾病、障碍或功能失调状态之一的对象。例如，所述对象是患有或被认为“有风险发生”心肌纤维化(例如心房纤维化、心内膜心肌纤维化或梗塞特别是陈旧性心肌梗塞)或肾纤维化的对象。所述对象可以是无症状的，或表现出此类病症、疾病、障碍或功能失调状态的早期或晚期体征。典型的对象是由于本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化增加或具有预后不良的纤维化的对象。本文描述的另一个特定对象是一种选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白，其通常作为生物标志物，用于在对象、通常是哺乳动物、优选为人类中检测对纤维化、特别是心肌和/或肾纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。优选的人类可溶性cd146蛋白包含seqidno：7或由其构成。本文描述的另一个特定对象是seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白，其作为生物标记物用于在对象中检测对纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。本文描述的另一个特定对象是seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白，其作为生物标记物用于在对象中检测对纤维化、特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的易感性，用于诊断和/或预后所述纤维化，或用于监测所述纤维化。本文中具体描述了一种体外、离体或体内方法，其用于在对象、通常是哺乳动物、优选为人类中检测对纤维化、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的易感性或诊断和/或预后所述纤维化。在与心肌和/或肾纤维化相关的优选情况下，在这种方法中使用的scd146选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7。在与皮肤和/或肺纤维化相关的另一种优选情况下，在这种方法中使用的scd146是seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白。术语“诊断”是指在对象中检测或鉴定本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态、通常为纤维化，或评估(定量、比较)此类病症、疾病、障碍或功能失调状态的严重性或阶段。在特定情况下，本发明的诊断方法包括确定对象的生物样品中cd146、通常是scd146蛋白的存在和/或测量其存在的量，并优选地包括所述量与参比值的比较。术语“预测”是指评估所述对象发生本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态、通常为纤维化的易感性。术语“预后”是指在治疗或未治疗的对象中评估或监测本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态的进展(过程)，通常是指预测此类疾病或障碍的恶化和相关有害效应，或与之相反，预测所述对象健康的改善。本发明的预后方法可以包括在各个不同阶段包括早期、症状前和晚期阶段，在来自于所述对象的一个或多个生物样品中监测、定量cd146、通常为cd146蛋白和比较测量到的量或水平等的一个或几个步骤。预后通常包括评估(预测)纤维化的进展和表征对象以确定最适合的治疗。本文描述的方法通常包括在所述对象的生物样品中确认cd146、特别是scd146的存在或换句话说确定cd146蛋白表达的步骤，并优选地包括确定cd146的表达水平(测量cd146的量)的步骤。具体来说，本文中描述的人类cd146蛋白、通常为人类可溶性cd146蛋白中的任一者可用作生物标志物，为对象、通常为哺乳动物、优选为人类中纤维化或与纤维化相关的疾病、特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化的存在提供指示。在特定情况下，所述在对象中检测对纤维化的易感性或诊断和/或预后纤维化的方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中可溶性cd146蛋白的表达水平，所述可溶性cd146蛋白选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值例如预先确定的参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。在另一种特定情况下，所述在对象中检测对纤维化的易感性或诊断和/或预后纤维化的方法包括确定所述对象的生物样品中seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白的表达水平的步骤。更准确来说，在一种情况下，所述方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中i5-13可溶性cd146蛋白的表达水平，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。在另一种情况下，所述方法包括下述步骤：i)确定所述对象的生物样品中i10可溶性cd146蛋白的表达水平，ii)将所述在步骤i)中确定的表达水平与参比值进行比较，以及iii)当所述在步骤i)中确定的水平低于所述参比值时，得出所述对象具有易感性、患有纤维化或具有不良预后的结论，或者当所述在步骤i)中确定的水平高于所述参比值时，得出所述患者没有易感性、未患纤维化或具有良好预后的结论。术语“参比值”、“对照值”或“截止值”可以是指基础值，其对应于使用参比群体，通常为健康对象、即未患有本文中所定义的病症、疾病、障碍或功能失调状态的对象的群体或组群所获得的值(测量到的水平、量或浓度)的平均值。所述参比值也可以是统计或判别值，即已通过在健康对照群体和具有本文中所定义的已知病症、疾病、障碍或功能失调状态的群体两者中测量所述参数而确定的值。所述判别值在分析健康对照群体与患病患者群体的参数值和已知临床数据之间的关系的基础上，以预定的特异性和/或预定的灵敏度鉴定所述患病群体。以这种方式确定的判别值对将来的各个试验中相同的实验设置有效。例如，参比值对于i5-13可溶性cd146蛋白来说可以是300ng/ml，对于i10可溶性cd146蛋白来说可以是50ng/ml。本文描述的一种特定方法是在对象中监测纤维化、特别是心肌或肾纤维化的体外、离体或体内方法。所述方法通常包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定可溶性cd146蛋白的存在和/或测量可溶性cd146蛋白的表达水平或可溶性cd146蛋白的量，所述可溶性cd146蛋白选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7，与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中cd146蛋白的存在(在不存在之后)或更高的cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加或纤维化的恶化，而更低的可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化稳定或换句话说没有进展。本文描述的另一种特定方法是在对象中监测纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更高的可溶性cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更低的人类可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。本文描述的另一种特定方法是在对象中监测纤维化的体外、体内或离体方法，所述方法包括在两个或更多个时间点在所述对象的生物样品中确定seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白的表达水平，其中与较早时间点在所述对象的生物样品中获得的参比值相比在较晚时间点所述对象的生物样品中更低的可溶性cd146蛋白表达水平指示了所述对象中纤维化的增加，而更高的人类可溶性cd146蛋白水平指示了纤维化的减少，并且相等的人类可溶性cd146蛋白水平指示了在所述对象中纤维化没有进展。为了评估纤维化的演变或控制治疗效率，在治疗下或任何治疗之前测试患者，并在几天、几周或几个月后在治疗下(通常在不存在任何治疗中断的情况下)测试同一患者，可能是有帮助的。在这种情形中，将所述第二次测试的结果(测量值)与第一次测试的结果进行比较。“超过参比值”或“高于参比值”的cd146量/表达水平可以意味着统计学显著的提高，例如提高至少2个标准偏差。术语“生物样品”包括来自于对象、特别是哺乳动物对象、通常为人类的任何生物样品。所述生物样品可以是组织活检样品例如心脏活检样品或生物流体样品。可用于本发明的情形的生物样品的典型实例可以选自血浆、血液、血清、尿液、脑脊液和唾液样品。优选地，所述生物样品是血浆、血液或血清样品，甚至更优选为血清样品。所述生物样品优选为稀释的样品，稀释度通常为1/25、1/50、1/100、1/200或1/400，优选为1/25。具体来说，在检测对纤维化的易感性、诊断、预后或监测纤维化的方法中，所考虑的cd146蛋白的血清浓度可以指示高的值。事实上，可以将所述测量值与对象的健康状态相关的标准值进行比较。具体来说，所考虑的cd146形式、通常为选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的scd146或seqidno：9的i5-13可溶性cd146蛋白的过表达，可以指示纤维化的存在。优选地，cd146、特别是scd146的存在的确定以及其量的测量，在免疫测定法中通过其中将对象的生物样品与适合的抗cd146抗体直接接触的一步法或通过隐含生物样品的预处理的方法来确定。与cd146、特别是scd146结合并且能够在对象的生物样品中鉴定/定量它的抗体在本领域中是已知的。优选的抗体是单克隆抗体，优选为选择性结合cd146、特别是选择性结合scd146(相比于膜cd146)的单克隆抗体。选择性结合scd146的特定抗体，可以从选择性结合包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：9(相比于膜cd146)、优选为seqidno：7、seqidno：8或seqidno：9或由它们构成的蛋白质的抗体中选择。有利情况下，根据本发明的选择性结合scd146(相比于膜cd146)的抗体包含seqidno：87、seqidno：88和seqidno：89的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：90、序列qvs和seqidno：91的轻链可变区(vl)cdr多肽序列。seqidno：87对应于下述氨基酸序列：gytftshfseqidno：88对应于下述氨基酸序列：ifpgsgdtseqidno：89对应于下述氨基酸序列：artwayseqidno：90对应于下述氨基酸序列：qsllysdgktyseqidno：91对应于下述氨基酸序列：aqtthfplt在特定情况下，根据本发明的抗体或其片段包含含有seqidno：93的轻链可变区(vl)和含有seqidno：92的重链可变区(vh)。有利情况下，根据本发明的选择性结合scd146(相比于膜cd146)的抗体包含seqidno：94、seqidno：95和seqidno：96的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：97、序列fas和seqidno98的轻链可变区(vl)cdr多肽序列。seqidno：94对应于下述氨基酸序列：gftfsdygseqidno：95对应于下述氨基酸序列：iyydsskmseqidno：96对应于下述氨基酸序列：aafqfdyseqidno：97对应于下述氨基酸序列：qgistsseqidno：98对应于下述氨基酸序列：qqsynlpyt在特定情况下，根据本发明的抗体或其片段包含含有seqidno：100的轻链可变区(vl)和含有seqidno：99的重链可变区(vh)。任何本文中描述的抗体可以以容易由本领域专业技术人员确定的相应的适合剂量并入到组合物、通常为诊断组合物中，所述组合物还包含可药用载体或支持物。所述结合cd146的抗体通常以有效量使用或存在于所述组合物中。表述“有效量”是指足以在对象中或对象的生物样品中检测和/或测量cd146、特别是scd146的抗cd146抗体的量或浓度。在诊断情形中用于哺乳动物、通常为人类中的抗cd146抗体的典型有效量在约1μg/ml至5μg/ml之间，优选在约1μg/ml至2.5μg/ml之间或约2.5μg/ml至5μg/ml之间。所述免疫测定法可以通过本领域的公知方法来进行：在固相或均相中，在一个或两个步骤中，通过竞争性方法等。更优选地，所述免疫测定法选自elisa、feia、western印迹、斑点印迹、基于珠子的测定法、抗原阵列和放射免疫测定法。在elisa中，抗原必须被固定到固体表面，然后与连接到酶的抗体复合。检测通过经与底物温育以产生有色产物以评估所述偶联的酶活性来实现。在feia中，所述有色产物是荧光的。在放射免疫测定法中，所述最终产物是有放射活性的。使用斑点印迹方案的蛋白质检测与western印迹相似，因为两种方法都允许鉴定和分析感兴趣的蛋白质。斑点印迹方法与传统的western印迹技术的区别在于不使用电泳来分离蛋白质样品。相反，将样品蛋白点在膜上并与抗体探针杂交。基于珠子的测定法或抗原阵列是允许调查人员同时测量生物和环境样品中的多种分析物的新方法。半定量测量可以利用每种前述方法来获得，使用例如正常对照将所述值归一化然后建立比率，或使用阳性对照作为校准物(以任意单位表示)。所述检测可以在固体支持物例如微孔板上进行，在所述支持物上以确定且有序的方式布置多种抗体，以便检测和/或定量一种或不同形式的cd146，或者可以在固体粒子、试管等上进行。在其中所述抗体是结合可溶性cd146蛋白的抗体，例如选择性结合可溶性cd146蛋白(相对于膜型cd146)、特别是包含seqidno：7或由其构成的可溶性cd146蛋白的抗体的特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的血清中所述可溶性cd146蛋白水平的提高，指示了纤维化或纤维化的增加，特别是心肌和/或肾纤维化或纤维化的增加。在其中所述抗体是结合包含seqidno：8或由其构成的i5-13可溶性cd146蛋白的抗体的另一种特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的生物样品、通常为血清中所述i5-13可溶性cd146蛋白水平的提高，指示了纤维化或纤维化的增加，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化或纤维化的增加。在其中所述抗体是结合包含seqidno：9或由其构成的i10可溶性cd146蛋白的抗体的另一种特定情况下，当与参比水平相比时所述测试对象的生物样品、通常为血清中所述i10可溶性cd146蛋白水平的提高，指示了纤维化的减少，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化的减少。本发明人还在本文中描述了一种在对象中诊断纤维化、特别是心肌或肾纤维化的方法。这种方法通常包括在所述对象的血清中检测并优选地测量/定量cd146、优选为scd146的量的步骤。这种方法通常包括使用本文中所描述的结合cd146蛋白、优选为scd146蛋白的抗体。本发明人还在本文中描述了一种cd146抑制剂，特别是选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂或包含这种cd146抑制剂的组合物，其用于在对象、通常是通过本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。本发明人还在本文中描述了一种seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂或包含这种cd146抑制剂的组合物，其用于在对象、通常是通过本文中描述的方法已被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化，特别是皮肤纤维化和/或肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。本文中描述的以至少一种特定形式的cd146、通常为scd146或cd146的受体的过量表达为特征的引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的病症、疾病、障碍或功能失调状态，在有利情况下通过本文中所描述的cd146抑制剂，优选为针对cd146、优选地针对人类cd146、特别是人类scd146的抗体或针对这种cd146的任何其他cd146拮抗剂来治疗。事实上，本发明人已发现，一旦给药到对象中，这种cd146抑制剂能够预防、停止或甚至逆转纤维化。具体来说，本说明书涉及cd146抑制剂、优选为选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白的抑制剂、seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂或包含这种cd146抑制剂的组合物的用途，其用于体外或离体制备组合物、通常为药物组合物，所述组合物用于在需要的对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌、肾、皮肤和/或肺纤维化，或引起纤维化、由纤维化引起或与纤维化有关的任何病症、疾病、障碍或功能失调状态。在典型情况下，所述cd146抑制剂选自抗体、适体、多肽、有机小分子和核酸。在优选情况下，所述cd146抑制剂是抗cd146抗体或cd146抗原结合分子，优选为抗scd146抗体或scd146抗原结合分子，其功能性片段(即能够与cd146结合的片段)或其衍生物。术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(即抑制纤维化)即可。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子、单域抗体(例如来自于骆驼科动物)、鲨鱼nar单域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段也可以是指包含cdr或抗原结合结构域的结合组成部分，包括但不限于vh区(vh、vh-vh)、抗运载蛋白(anticalin)、佩普体(pepbody)、抗体-t-细胞表位融合体(troybody)或肽体(peptibody)。根据本发明的抗体可以是任何类别，例如igg、iga、igd1、ige1、igm1或igy1，尽管igg抗体通常是优选的。抗体可以是任何哺乳动物或禽类来源的，包括人类、鼠类(小鼠或大鼠)、驴、绵羊、山羊、兔、骆驼、马或鸡。可以通过将任何类型的分子共价附连到所述抗体来修饰所述抗体。例如但非限制性地，所述抗体衍生物包括已被修饰的抗体，所述修饰例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白或本领域中已知的其他修饰。通常，用于制备抗体(包括多克隆抗体、单克隆抗体和杂交瘤)和用于使用抗体检测抗原的技术在本领域中是公知的，例如harlow&lane，《抗体使用实验指南》(usingantibodies,alaboratorymanual)，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1998；kohler&milstein,nature256:495-497(1975)；kozbor等，immunologytoday4:72(1983)；和cole等，《单克隆抗体和癌症疗法》(monoclonalantibodiesandcancertherapy)，第77-96页，1985。此外，根据本发明的抗体可以被融合到标志物序列例如肽标签，以便于纯化；适合的标签是六聚组氨酸标签。抗体也可以通过本领域中已知的方法偶联到诊断或治疗药剂。用于制备此类偶联物的技术在本领域中是公知的。制备这些单克隆抗体以及嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体的其他方法在本领域中是已知的。在特定情况下，所述抗cd146抗体特异性/选择性地识别/结合到人类可溶性cd146蛋白，优选为包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列或由其构成的蛋白，或它们的参与纤维化过程的表位。这种抗体优选地还中和所述被靶向的cd146蛋白、特别是被靶向的选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白和/或seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白、优选为被靶向的人类可溶性cd146蛋白的生物活性。优选地，所述单克隆抗体在本文中所定义的对象、通常为哺乳动物、优选为人类中减少或抑制纤维化。特定的单克隆抗体优选地也能够降低或抑制可溶性cd146受体或cd146蛋白受体亚基的过量表达(与标准表达相比)。结合人类cd146蛋白、通常为人类可溶性cd146蛋白和cd146或可溶性cd146蛋白受体(或cd146蛋白受体亚基)两者的抗体也可用于本发明的情形。制造此类抗体的方法在本领域中是已知的(参见例如despoixn,walzert,jouven,blot-chabaudm,bardinn,paulp,lyonnetl,viviere,dignat-georgef,vélyf.，“小鼠cd146/mcam是自然杀伤细胞成熟的标志物”(mousecd146/mcamisamarkerofnaturalkillercellmaturation)，eurjimmunol.2008；38:2855-64)。由本发明人选出的可用于本发明的情形的能够选择性结合可溶性cd146(相比于膜cd146)的优选抗体，可以是包含seqidno：87、seqidno：88和seqidno：89的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：90、序列qvs和seqidno：91的轻链可变区(vl)cdr多肽序列的抗体，或包含seqidno：94、seqidno：95和seqidno：96的重链可变区(vh)cdr多肽序列和seqidno：97、序列fas和seqidno：98的轻链可变区(vl)cdr多肽序列的不同的抗体。在特定情况下，所述抗体包含含有seqidno：93的轻链可变区(vl)和含有seqidno：92的重链可变区(vh)。在另一种特定情况下，所述抗体包含含有seqidno：100的轻链可变区(vl)和含有seqidno：99的重链可变区(vh)。所述cd146抑制剂也可以是适体。适体是在分子识别方面代表了抗体的替代方案的一类分子。适体是具有以高亲和性和特异性识别几乎任何类型的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。正如在tuerkc和goldl.，1990中所述，此类配体可以通过随机序列文库的指数富集配体系统进化(selex)技术来分离。所述随机序列文库可以通过dna的组合化学合成来获得。在这种文库中，每个成员是具有独特序列的最终被化学修饰的线性寡聚物。这类分子的可能的修饰、用途和优点已综述在jayasenas.d.，1999中。通过双杂交方法从组合文库选择的肽适体由平台蛋白例如大肠杆菌硫氧还蛋白a展示的构象受限的抗体可变区构成(colas等，1996)。在另一种情况下，所述cd146抑制剂是包含氨基酸残基的肽或多肽分子。当在本文中使用时，术语“氨基酸残基”是指采取(l)或(d)构型的任何天然/标准和非天然/非标准氨基酸残基，并包括α或α-双取代的氨基酸。它是指异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸。它还包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸(aib)、4-氨基-丁酸、n-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸(例如l-鸟氨酸)、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、n-甲基异亮氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、环丁基丙氨酸、环丙基丙氨酸、环己基甘氨酸、环戊基甘氨酸、环丁基甘氨酸、环丙基甘氨酸、正亮氨酸(nle)、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、l-高精氨酸(harg)、n-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2,4,-二氨基丁酸(d-或l-)、对氨基苯丙氨酸、n-甲基缬氨酸、硒代半胱氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸(hoser)、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸或2,3-二氨基丁酸(d-或l-)等。这些氨基酸在生物化学/肽化学领域中是公知的。在本发明的情形中使用的包括肽的化合物可以包含至少一个肽键被电子等排修饰的替换。本发明的包括肽的化合物可以是肽模拟物。肽模拟物的特征通常在于保留它的肽对等物的极性、三维尺寸和功能性(生物活性)，但是其中一个或多个肽键/连接通常已被对蛋白水解更加稳定的连接代替。通常，所述代替酰胺键的键(酰胺键替代物)保留了所述酰胺键的许多或所有性质，例如构象、空间位阻、静电特点、氢键形成潜力等。典型的肽键替换包括脂类、多胺及其衍生物以及取代的烷烃和烯烃，例如氨基甲基和酮基亚甲基。例如，所述肽可以具有一个或多个肽连键被诸如-ch2nh-、-ch2s-、-ch2-ch2-、-ch═ch-(顺式或反式)、-ch(oh)ch2-或-coch2-、-n-nh-、-ch2nhnh-的连键或其中侧链被连接到氮原子而不是碳原子的类肽连键代替。此类肽模拟物相对于它的肽对等物可能具有更高的化学稳定性、增强的生物学/药理学性质(例如半衰期、吸收、效价、效率等)和/或降低的抗原性。在另一种情况下，所述cd146抑制剂是有机小分子。术语“有机小分子”是指与制药中通常使用的有机分子尺寸相当的分子。所述术语排除了生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的尺寸范围至多约5000da，更优选地至多2000da，最优选地至多约1000da。在另一种情况下，所述cd146抑制剂是核酸。所述cd146抑制剂通常可以是多核苷酸或寡核苷酸，通常为抑制性核苷酸。它们包括短干扰rna(sirna)、microrna(mirna)和合成的发夹rna(shrna)、反义核酸、互补dna(cdna)或指导rna(可以在crispr/cas系统的情形中使用的grna)。在某些优选实施方式中，使用靶向cd146表达的sirna。在各种不同的生物体中已显示了通过双链rna例如sirna干扰内源基因的功能和表达。参见例如a.fire等，“在秀丽隐杆线虫中通过双链rna进行的强力特异性遗传干扰”(potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedrnaincaenorhabditiselegans)，nature391:806-811(1998)；j.r.kennerdell&r.w.carthew，“使用dsdna介导的遗传干扰证实卷曲蛋白和卷曲蛋白2在wingless途径中发挥作用”(useofdsdna-mediatedgeneticinterferencetodemonstratethatfrizzledandfrizzled2actinthewinglesspathway)，cej95:1017-1026(1998)；f.wianni&m.zernicka-goetz，“在小鼠早期发育中通过双链rna特异性干扰基因功能”(specificinterferencewithgenefunctionbydouble-strandedrnainearlymousedevelopment)，nat.cellbiol.2:70-75(2000)。sirna可以包括包含自身互补的序列或双链序列的发夹环。sirna通常具有少于100个碱基对，并且可以是例如约30bps或更短，并且可以通过本领域中已知的方法，包括使用互补dna链或合成方法来制造。这种双链rna可以通过从模板的两个方向读出的单链rna的体外转录和正义和反义rna链的体外退火来合成。靶向cd146的双链rna也可以从cdna载体构建物合成，在所述构建物中cd146基因(例如人类cd146基因)以相反方向被克隆并被反向重复序列隔开。在细胞转染后，所述rna被转录，并且互补链重新退火。靶向cd146基因的双链rna可以通过适合的构建物的转染引入到细胞中。通常，由sirna、mirna或shrna介导的rna干扰在翻译水平上介导；换句话说，这些干扰rna分子阻止相应mrna分子的翻译并导致它们的降解。也有可能rna干扰也可在转录水平上工作，阻断对应于这些干扰rna分子的基因组区域的转录。这些干扰rna分子的结构和功能在本领域中是公知的，并被描述在例如通过参考并入本文的r.f.gesteland等主编，《rna世界》(thernaworld)(第三版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2006),第535-565页中。对于这些方法来说，在克隆至载体和转染的方法在本领域中也是公知的，并被描述在例如通过参考并入本文的j.sambrook&d.r.russell，《分子克隆实验指南》(molecularcloning:alaboratorymanual)(第三版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,2001)中。除了双链rna之外，靶向cd146的其他核酸试剂也可用于本发明的实践，例如反义核酸。反义核酸是与特定靶mrna分子的至少一部分互补的dna或rna分子。在细胞中，所述单链反义分子与该mrna杂交，形成双链分子。细胞不翻译这种双链形式的mrna。因此，反义核酸干扰mrna翻译成蛋白质，并因此干扰被转录成该mrna的基因的表达。反义方法已被用于在体外抑制许多基因的表达。参见例如cj.marcus-sekura，“使用反义寡脱氧核糖核苷酸研究基因表达的技术”(techniquesforusingantisenseoligodeoxyribonucleotidestostudygeneexpression)，anal.biochem.172:289-295(1988)；j.e.hambor等，“将epstein-ban病毒游离型复制子用于人类细胞毒性t细胞克隆中的反义rna介导的基因抑制”(useofanepstein-banvirusepisomalrepliconforanti-senserna-mediatedgeneinhibitioninahumancytotoxict-ceilclone)，proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:4010-4014(1988)；harima等，“通过硫代磷酸酯反义寡核苷酸在鼠类巨噬细胞样细胞中特异性抑制白介素-10的生产”(specificinhibitionoflnterleukin-10productioninmurinemacrophage-likecellsbyphosphorothioateantisenseoligonucleotides)，antisensenucl.aciddrugdev.8:319-327(1998)；和w.-f.hou等，“针对各个钙调蛋白基因转录本的反义寡脱氧核苷酸对pc12细胞的增殖和分化的影响”(effectofantisenseoligodeoxynucleotidesdirectedtoindividualcalmodulingenetranscriptsontheproliferationanddifferentiationofpc12cells)，antisensenucl.aciddrugdev.8:295-308(1998)，所有上述文献通过参考并入本文。反义技术被进一步描述在通过参考并入本文的c.lichtenstein&w.nellen主编，《反义技术：实用方法》(antisensetechnology:apracticalapproach)(irlpress,oxford,1997)。来自于人类和许多其他动物、特别是哺乳动物的cd146多核苷酸序列在本领域中已知。基于所述已知序列，可以使用本领域中公知的方法容易地合成靶向cd146的抑制性核苷酸(例如sirna、mirna或shrna)。根据本发明的示例性sirna可以具有至多29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bp或这些数字之间的任何整数个碱基对。用于设计最佳抑制性sirna的工具包括可以从dnaengineinc.(seattle,wash.)和ambion,inc.(austin,tex)获得的工具。本发明的氨基酸分子可以被设计，以改善它们的性能和/或与在对象、通常为哺乳动物、优选为人类中的诊断、治疗或预防用途的相容性。它们可以被例如糖基化、甲基化、乙酰化、磷酸化或融合到另一个多肽，优选被甲基化、乙酰化、磷酸化或融合到另一个多肽，用于优选地在人类中靶向不同类型的组织，特别是病理组织例如通常为心脏或肾组织。本发明人还在本文中提供了一种组合物，其包含通常为治疗有效量的cd146抑制剂和可药用赋形剂、支持物、介质或载体。所述组合物可以包含几种不同的cd146抑制剂，例如针对特定形式的cd146例如选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白和seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抗cd146抗体，和针对相同或不同形式的cd146的不同抗cd146抗体。任何本文中描述的抗体可以以容易被本领域技术人员确定的相应的适合剂量并入到还包含可药用载体或支持物的组合物中。所述组合物还可以包含旨在预防或治疗纤维化的不是cd146抑制剂的另外的不同治疗性化合物。在特定情况下，本文中描述的包含抗体、特别是特异性针对本文描述的人类可溶性cd146的抗体的组合物，还可以包含至少一种其他的抗纤维化因子。在本发明的情形中，抗纤维化因子是抑制或干扰成纤维细胞发育或抑制或干扰细胞外基质沉积的因子。可以在本发明的情形中使用的抗纤维化因子可以选自骨形态发生蛋白7(bmp7)、松弛素、格列扎(glitazar)和mirna(例如mir-29或mir-101)。cd146抑制剂的“治疗有效量”是允许在需要的对象、通常为哺乳动物、优选为人类中预防或治疗纤维化的量。在哺乳动物、通常为人类中使用的典型的治疗有效量在约5mg/kg至15mg/kg之间，例如约5mg/kg至10mg/kg之间或约10至15mg/kg之间。可以在本发明的情形中使用的可药用赋形剂、支持物、介质或载体是例如等渗缓冲盐溶液例如20％甘露糖醇，并任选地与稳定剂例如同基因白蛋白或任何其他稳定性蛋白、甘油等以及佐剂例如聚凝胺或deae葡聚糖等组合。所述组合物通常用于在对象中预防或治疗纤维化，特别是心肌和/或肾纤维化。本文中描述的包含seqidno：8的i5-13可溶性cd146蛋白的抑制剂和可药用载体的特定组合物用于在对象中预防或治疗肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化。本文中描述的特定组合物包含选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的可溶性cd146蛋白或seqidno：9的i10可溶性cd146蛋白和可药用载体，用于在对象、优选为人类中预防或治疗皮肤纤维化和/或肺纤维化，特别是与系统性硬化相关的肺纤维化。本发明人还在本文中描述了一种在需要的对象、通常为已通过本文中描述的方法被鉴定为对纤维化具有易感性、正患有纤维化、具有无进展的纤维化、具有纤维化的增加或具有预后不良的纤维化的对象中预防或治疗纤维化、特别是心肌、皮肤、肺和/或肾纤维化的方法。这种方法通常包括向所述对象给药通常为有效量的cd146抑制剂、特别是scd146抑制剂或特定scd146或包含这种cd146抑制剂或特定scd146的组合物的步骤。在特定情况下，所述方法包括向所述对象给药(有效量的)抗体、通常为本文中所描述的抗cd146抗体或包含这种抗体的组合物(通常为药物组合物)的步骤。本文描述的诊断或药物组合物的剂量可以由专业技术人员根据被治疗的对象、给药途径、靶组织、生物活性化合物(本文中所公开的)等进行调整。所述给药可以使用各种不同的方案，例如抗cd146抗体、cd146抑制剂或如上所述的任何其他化合物的同时或顺序给药、单次或重复给药等，这可以由专业技术人员进行调整。考虑到所述靶病理组织或区域，所述含有根据本发明的产品的诊断或药物组合物可以系统性、皮下、脊柱内、脑内或真皮内给药到患者。优选的注射方式是系统性注射，特别是静脉内或动脉内注射或皮下注射。本文中还描述了一种体外、离体或体内监测药物、通常为cd146抑制剂或组合物用于治疗纤维化、特别是心肌、皮肤、肺和/或肾纤维化的效能的方法。这种方法通常包括将在任何纤维化治疗之前来自于对象的第一生物样品中cd146的表达，与已暴露于用于治疗纤维化的药物或组合物的同一对象的第二生物样品中cd146的表达进行比较的步骤。本文中还提供了一种试剂盒，其包含通常为有效或治疗量的本文中描述的产品中的任一者或多者、通常为蛋白质、抗体、(可溶性)cd146的抑制剂或包含此类产品的组合物，任选地包含用于将所述产品给药到需要的对象的手段或装置，并任选地包含为在本文中所描述的方法的情形中使用所述产品提供指导的说明书。优选存在于所述试剂盒中的抗体通常针对本文中描述的cd146蛋白之一，优选地针对本文中描述的scd146蛋白之一。它优选为单克隆抗体。通常，所述试剂盒还包含根据所公开的方法使用所述蛋白质、抗体、抑制剂或组合物的说明书。本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中描述，所述实验部分应当被视为说明性的，而不是限制本申请的范围。在本申请中引用的所有参考文献通过参考并入本文。附图说明图1.在小鼠中cd146在实验性gn中被诱导在小鼠中，在nts(去补体的肾毒性血清)给药后第4天至第15天，损伤肾脏中的cd146逐步地被高度上调，并主要位于受损的肾小球中(a)。这种上调通过western印迹得以确认(b、c)。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。显微照片的放大倍数：x200。图2.cd146敲除小鼠受到保护免于nts诱导的肾小球肾炎。在疾病诱导后小鼠中的体重增加(a)。肾功能通过被表示为克蛋白/mmol肌酐的蛋白尿(b)和bun(c)来评估。所有三种参数揭示出在cd146敲除动物中疾病的进展较慢。肾切片的梅森三色染色(d)显示出在cd146敲除动物中肾结构得以保留，因为它们发生更少的肾小球新月体(e)和肾小管扩张(f).新月体被表示为呈现出细胞新月体的肾小球的百分率(％)。*，p<0.05；**，p<0.01。显微照片的放大倍数：x200。图3.cd146敲除小鼠发生更少的肾炎症和纤维化。il-1β(a)、tnf-α(b)和icam-1(c)的qpcr显示出在诱导nts-gn后15天，cd146ko小鼠的肾脏中受限的炎症反应。f4/80(d、e)和cd3(f、g)的免疫组织化学分别确认了cd146ko小鼠中有限的单核细胞和淋巴细胞粘附。在相同的时间点，tgfβ(h)、胶原蛋白iii(i)的qpcr和天狼猩红染色(j)的定量显示出cd146ko小鼠中纤维化反应的限制。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。显微照片的放大倍数：x200。图4.在nts给药后肾小球内皮细胞中cd146被强烈诱导。cd146和肾小球组分例如内皮细胞(cd31/pecam1)(a)、足细胞(巢蛋白)(b)、壁细胞(紧密连接蛋白-1)(c)和系膜细胞(α-sma)(d)的各种不同标志物的双重免疫荧光素染色的肾皮质切片显示出在nts-gn后7天，cd146表达主要在肾小球内皮细胞中被诱导。显微照片的放大倍数：x400。图5.cd146-ec-del小鼠的产生。首先将cd146-floxed小鼠与表达荧光蛋白zsgreen1作为cre-重组酶活性的报告物的b6.cg-gt(rosa)26sortm6(cag-zsgreen1)hze/j小鼠(jacksonlaboratories)杂交。然后，通过将cd146flox-zsgreen动物进一步与ralfadams建立的cdh5(pac)-creert2小鼠株系杂交，产生了具有cd146基因的内皮细胞特异性缺失的小鼠(a)。所述cd146基因的缺失通过i.p.注射在玉米油中稀释的他莫昔芬(10mg/ml溶液，1mg他莫昔芬/注射)并连续给药3天来诱导。cd146的免疫荧光确认了它从血管内皮缺失(b)。相应地，在cd146-ec-del小鼠的肾脏中cd146mrna表达也降低(c)。*，p<0.05；**，p<0.01；#，p＝0.05(nts相比于ctl)。显微照片的放大倍数：x200。图6.在nts-gn诱导后cd146的内皮特异性缺失保护肾功能和结构在cd146-ec-del小鼠中，nts诱导的体重(a)、蛋白尿(b)和bun(c)的增加均被减弱。此外，肾皮质切片中的梅森三色染色(d)揭示出在nts注射后15天肾小球新月体(e)和肾小管扩张(f)大大减少。*，p<0.05；**，p<0.01(nts相比于cd146-ec-del)；#，p<0.05；##，p<0.01(nts相比于ctl-pbs)。显微照片的放大倍数：x200。图7.cd146内皮特异性缺失保护小鼠免于炎症和肾间质纤维化两者f4/80染色显示在nts注射后15天，cd146-ec-del小鼠中的单核细胞浸润被减弱(a)。相应地，vcam-1(b)和mcp-1(c)的qpcr显示出这些炎性标志物的上调被减弱。此外，tgf-β1(d)和col1a1(e)的qpcr显示出相似的结果。*，p<0.05；**，p<0.01。显微照片的放大倍数：x200。图8.在人类中肾小球疾病中cd146转录本的表达从患有糖尿病性肾病(dn)、微小病变肾病(mcd)、iga肾病(iga)、局灶性节段性肾小球硬化(fsgs)、膜性肾小球肾炎(mgn)、狼疮性肾炎(sle)、快速进行性肾小球肾炎(rpgn)的患者的分离的肾小球和对照(移植前同种异体移植物活检组织)获得的基因表达数据。与对照相比，在肾小球疾病中cd146表达被显著且差异地调控。图9.由心肌梗塞诱导的心肌纤维化的阶段(a)和产生成肌纤维细胞的细胞群体(b)(v.rai,mol.cellbiochem.,2017)。图10.心肌梗塞的模型冠状动脉左降支经历永久性结扎(a和b)。在手术后21天将动物处死，以便进行各种不同检查(c)。图11.免疫组织学原理和方法感兴趣的蛋白质的间接免疫检测使用信号放大系统来进行。在这种方法中，使用第一抗体检测组织上存在的感兴趣的蛋白质。这种抗体的杂交通过偶联到生物素分子的第二抗体来检测。添加连接到酶、即辣根过氧化物酶(hrp)的亲和素-生物素复合物，使得在沉积特异性底物(二氨基联苯胺)后可以检测所述靶抗原。所述反应产生稳定的棕色沉淀物，其可以通过光学显微术观察(表i和ii)。图12.western印迹的原理图13.在“mi”(或“im”)动物中心肌纤维化带的位置(a和b)和cd146rna表达(c)(n＝3)梗死/纤维化带或区(“iz”或“ia”或“fz”或“fa”)位于结扎下方左室心尖处。边缘带或区(“bz”或“ba”)紧邻所述梗死带，并且远端/远离带或区(“dz”或“da”或“rz”或“ra”)位于结扎带上方。心肌纤维化(b，60x物镜)位于梗死带(红色箭头)处并在边缘带(蓝色箭头)中传播。图14.心肌梗塞模型中cd146/scd146的表达(n＝3)(a)cd146的免疫检测。cd146的免疫检测显示出与假手术组动物相比，在mi动物的心室壁中标记更多。纤维化带未被标记(“ia”)，而外周心肌细胞被标记(“ba”)。某些图像在20x物镜下获取，而其他图像在60x下获取。(b)cd146elisa(n＝2)。在2只假手术组和2只mi小鼠的血清中确定了cd146浓度。结果以ng/ml为单位给出。图15.衰老相关的纤维化模型中cd146的表达(n＝3)24月龄动物(e、f)的心肌切片的天狼猩红染色(e)和cd146免疫检测(f)。图16.在衰老期间cd146在心肌纤维化中的作用a-24月龄雌性动物的心肌纤维化的天狼猩红染色(a、b：40x物镜)和被胶原蛋白占据的面积分数的定量(c)(n＝3)(p＝0.0001)。胶原蛋白rna表达的rt-pcr定量(d)(n＝1)。b-细胞膜的染色和心肌细胞尺寸的定量(n＝3)(p<0.0001)。图17.cd146在成肌纤维细胞表型获得中的作用细胞增殖研究显示出在使用cd146刺激期间的增加与使用tgf-β观察到的可比(a)(p<0.05)。在rna(b)和蛋白质(c)分析中，在用cd146(50ng/ml)刺激48小时后成肌纤维细胞标志物sma的表达提高，并且肌动蛋白纤维更大(d)，其方式与使用tgf-β的刺激相同(20x物镜)。在用cd146刺激后纤连蛋白和i型胶原蛋白的表达(e)也提高，其方式与使用tgf-β刺激后相同。cd146在rna水平上诱导tgf-β表达的提高(f)。图18.在不同时间使用抗scd146抗体治疗具有肾衰竭和纤维化的uuo(单侧输尿管阻塞)小鼠模型8至12周龄的雄性c57bl/6小鼠经历右侧输尿管结扎。通过中线腹部切口暴露出右侧输尿管，并在肾盂下方1cm用5.0结扎丝线完全阻塞(结扎的动物)。在手术后，准备4组各7只动物。一组动物被用作对照，并在第1、4、7和10天用介质iv治疗。一组动物在手术后第1、4和10天用每只小鼠10微克的抗scd146抗体iv治疗。另一组动物用相同的方案但仅在手术后第7和10天治疗。最后一组动物在手术后第1、4、7和10天用每只小鼠10微克的对照iggiv治疗。图19.抗scd146治疗对肾纤维化的效果在手术后第14天，将动物处死并取出肾脏用于免疫组织化学。在实验肾或对侧肾上的纤维化使用天狼猩红来估算。结果显示与对侧肾相比，在实验肾中纤维化增加。使用igg的治疗不改变纤维化。相反，从第1至14天或从第7至14天使用抗scd146抗体的治疗显著减少纤维化。图20.抗scd146治疗对α-sma表达的影响在手术后第14天，将动物处死并取出肾脏。通过使用特异性抗体的免疫组织化学来确定实验肾或对侧肾上的α-sma表达。结果显示与对侧肾相比，在实验肾中α-sma增加。使用igg的治疗不改变α-sma表达。相反，从第1至14天或从第7至14天使用抗scd146抗体的治疗显著降低α-sma表达。图21.在内皮细胞中蛋白酶抑制剂对可溶性cd146分泌的影响a：在ecfc中确定了对使用20ng/mltnf、20ng/mlvegf、5ng/mltgfb、50ng/ml纺锤蛋白、50ng/mlwnt5a和50ng/mlwnt3a的24h治疗做出响应的可溶性cd146(cd146s)的分泌。b：通过elisa试验了在ecfc细胞中泛抑制剂gm6001对cd146s分泌的影响。实验在对照条件下和用20ng/mltnf治疗24h后进行。插图显示出tnf治疗从治疗的24h起显著增加cd146s。在1至50μm之间进行了gm6001效果的剂量依赖性实验。结果是5次实验的平均值+/-sem。c：在对照条件下和用20ng/mltnf治疗24h后，测试了50μm的弗林蛋白酶转化酶抑制剂(if)对cd146s分泌的影响。结果是3次实验的平均值+/-sem。d：在对照条件下和用20ng/mltnf治疗后，测试了timp-1、-2和-3(1μg/ml)对cd146s分泌的影响。结果是3次实验的平均值+/-sem。*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，实验相比于对照。图22：在ecfc中adam10参与cd146的长同工型的脱落a：将ecfc用靶向cd146的短(shcd146)或长(lgcd146)同工型的sirna和对照sirna(c)转染。确定可溶性cd146(scd146)的分泌。结果是4次不同实验的平均值+/-sem。b：将ecfc用靶向mt1-mmp、mmp2、adam10或tace的sirna和对照sirna(c)转染。确定可溶性cd146(scd146)的分泌。在一种条件下，将细胞用10μmgm6001处理。结果是5次不同实验的平均值+/-sem。c：将在基础条件(ebm2)下培养的ecfc中的adam10免疫沉淀。然后使用特异性抗体通过western印迹检测cd146的长(lgcd146)和短(shcd146)同工型。结果代表了3次不同实验。d：将ecfc用靶向adam10或tace的sirna和对照sirna(c)转染。使用葡聚糖-fitc确定在半透性滤膜上生长的ecfc单层的通透性。结果是3次实验的平均值+/-sem。e：将ecfc用编码adam10(p-adam10)或tace(p-tace)的质粒载体和对照质粒载体(c)转染。使用葡聚糖-fitc确定在半透性滤膜上生长的ecfc单层的通透性。结果是3次实验的平均值+/-sem。*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，实验相比于对照。图23：在ecfc中tace参与cd146的短同工型的脱落a：将ecfc用靶向cd146的短(shcd146)或长(lgcd146)同工型的sirna和对照sirna(c)转染，并在基础条件下和用20ng/mltnf处理24h的细胞中确定可溶性cd146(scd146)分泌。结果是5次不同实验的平均值+/-sem。b：将用20ng/mltnf处理24h的ecfc用靶向tace、adam10、mt1-mmp的sirna和对照sirna(c)转染，并确定可溶性cd146(scd146)的分泌。结果是3次不同实验的平均值+/-sem。图24：i10-scd146和i5-13-scd146同工型的表征a：i10-scd146和i5-13-scd146同工型与脱落形式相比较的示意图。氨基酸的差异被注明。b：在ecfc和huvec中分析了i10-scd146和i5-13-scd146同工型的mrna表达，并与cd146的短和长同工型的mrna表达进行比较。结果是3次实验的平均值+/-sem。c：在ecfc中，在用重组的脱落可溶性cd14650ng/ml、vegf20ng/ml、tnf20ng/ml、tgfβ5ng/ml和纺锤蛋白50ng/ml处理所述细胞24h后，通过qpcr分析i10-scd146和i5-13-scd146同工型的mrna表达。细胞也用wnt5a200ng/ml处理15min和用wnt3a50ng/ml处理1h。结果是3次实验的平均值+/-sem。*：p<0.05，实验相比于对照。图25：i5-13-scd146和i10-scd146对血管生成的影响a：靶向i10-scd146和i5-13-scd146的sirna对ecfc增殖的影响。实验在10μmgm6001存在下进行。结果是4次不同实验的平均值，并给出了在一次实验中细胞的代表性图片。b：通过质粒转染实现的i10-scd146(p-i10-scd146)、i5-13-scd146(p-i5-13-scd146)和脱落的scd146(p-shedscd146)的过表达对ecfc增殖的影响。实验在10μmgm6001存在下进行。c：50ng/ml重组蛋白i10-scd146、i5-13-scd146和脱落的scd146对ecfc增殖的影响。实验在10μmgm6001存在下进行。结果是4次不同实验的平均值。d：卵黄囊膜测定法在25ng/ml或50ng/mli5-13-scd146和i10-scd146存在下进行48h，并与对照进行比较。给出了4次不同实验的代表性图片。e：在使用ecfc实现的球状体实验中50ng/ml重组蛋白i10-scd146、i5-13-scd146和脱落的scd146对芽数量、分枝点和累计芽长的影响。将结果与vegf20ng/ml和完全egm2-mv培养基进行比较。给出了实验的平均值和代表性图片。结果是4次不同实验的平均值。*：p<0.05，***：p<0,001，实验相比于对照。图26：在小鼠缺血性后肢模型中重组i5-13-scd146和i10-scd146的局部注射的效果a：将缺血小鼠用pbs或2μgrh-scd146/rh-i10-scd146/rh-i5-13-scd146或vegf治疗。通过激光多普勒监测血液灌注率。结果是每组6只不同动物的平均值，并表示为对照腿的％。*，**，***：p<0.05，p<0.01，p<0.001，i10-scd146相比于pbs；$$，$$$：p<0.01，p<0.001，i5-13-scd146相比于pbs；##，###：p<0.01，p<0.001，脱落的scd146相比于pbs；￡：p<0.05，vegf相比于pbs。b：在手术后28天，来自于对照(pbs)和脱落的rh-scd146/rh-i10-scd146/rh-i5-13-scd146治疗的动物的后肢肌肉切片中的血管检查。血管用同工凝集素b4标记。**，***：p<0.01，p<0.001，实验相比于对照；$：p<0.05，i10-scd146相比于i5-13-scd146。c：在d28时对照(pbs)和脱落的scd146/i10-scd146/i5-13-scd146治疗的动物的血管造影照片。照片是每组中6只动物的代表。血管密度的平均值被表示为在腿的不同部分(小腿、大腿)和整个腿中右腿相比于左腿。*，**：p<0.01，p<0.001，小腿中实验相比于pbs；$：p<0.05，大腿中实验相比于pbs；#，##：p<0.05，p<0.01，整个腿中实验相比于pbs。图27：在系统性硬化中i5-13-scd146和i10-scd146同工型的表达和效果a：在患有系统性硬化的22位患者中确定脱落的scd146、i5-13-scd146和i10-scd146的浓度，并与匹配的对照进行比较。也比较了患有和未患肺纤维化的ssc患者中的i5-13-scd146(插图；分别为n＝10和n＝12)。b：在来自于cd146ko和wt小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)中估算了经典wnt信号传导的活化(b-连环蛋白/tcf转录活性；萤光素酶测定法)。将mef在存在或不存在脱落的scd146、i5-13-scd146或i10-scd146的情况下用或不用博来霉素处理。结果是5次独立实验的平均值+/-sem。c：在通过博来霉素的皮下注射诱导的系统性硬化的cd146ko小鼠模型中评估了真皮厚度。估算了脱落的scd146、i5-13-scd146和i10-scd146的影响，并给出了4-5只不同动物的平均值。还示出了代表性照片。d：示出了在用博来霉素处理并注射或未注射脱落的scd146、i10-scd146和i5-13-scd146的不同cd146ko小鼠中皮肤的外貌。e：在用或未用脱落的scd146/i10-scd146/i5-13-scd146处理的动物的皮肤中的血管检查。血管用同工凝集素b4标记。结果是在4-5只动物中的3次不同实验的代表。*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，实验相比于对照。图28：正常组织中i5-13-scd146和i10-scd146同工型的表达通过组织阵列检查了各种不同器官中i10-scd146和i5-13-scd146的mrna表达。结果作为淋巴结中的表达的函数进行归一化。图29：uuo对cd146表达和可溶性cd146分泌的影响a：cd146的表达在肾脏切片上被观察到，并在具有uuo的肾脏中进行定量。示出了定量。b：在假手术组和uuo动物中通过elisa对可溶性cd146进行定量。结果是7只动物的平均值。*：p<0.05；**：p<0.01，uuo相比于对侧。图30：抗体治疗对胶原蛋白和纤连蛋白表达的影响观察了uuo对胶原蛋白i、胶原蛋白iii和纤连蛋白的蛋白表达的影响。也观察了使用抗体的治疗的影响，并与使用对照igg的治疗进行比较。结果是每组中7只动物的平均值。****：p<0.001，介质相比于对侧§§§§：p<0.001，mab相比于介质***：p<0.01，介质或对照igg相比于对侧§§§：p<0.01，mab相比于介质图31：抗体治疗对a-sma表达的影响通过免疫组织化学观察了uuo对a-sma表达的影响。也观察了使用抗体的治疗的影响，并与使用对照igg的治疗进行比较。结果是每组中7只动物的平均值。***：p<0.01，介质相比于对侧§§§：p<0.01，mab相比于介质图32：在人类肾成纤维细胞的原代培养物中抗scd146mab对a-sma表达和波形蛋白mrna表达的影响检查了scd146(50ng/ml)对来自于人类成纤维细胞的原代培养物的影响。单独(ac)或与scd146一起给药的500ng/ml抗scd146mab的影响。结果是3次实验的平均值+/-se，并被表示为与未处理的对照条件相比的变化倍数。*：p<0.05；scd146相比于对照$：p<0.05；scd146+ac相比于scd146图33：腺嘌呤饮食对肾脏特征的影响a：将动物用(腺嘌呤)或不用腺嘌呤(对照)处理，并在腺嘌呤饮食结束后2周处死。在用天狼猩红着色后检测肾脏中的纤维化。示出了代表性照片。b：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析tgfb、胶原蛋白a1和αsma的mrna表达。结果被表示为与对照组相比的变动。c：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析αsma的蛋白质表达。结果被表示为相对于对照组的变动。d：在对照肾上和在刚完成腺嘌呤饮食后(结束)、腺嘌呤饮食结束后1周(第1周)、腺嘌呤饮食结束后2周(第2周)和腺嘌呤饮食结束后3周(第3周)的肾中分析cd146的mrna表达。结果被表示为与对照组相比的变动。图34：在用腺嘌呤处理的小鼠的肾脏中抗scd146抗体对纤维化的影响a：将用腺嘌呤处理的动物用pbs、对照igg或抗scd146mab注射。在所述饮食结束后2周，在天狼猩红着色后检测肾脏中的纤维化。示出了代表性照片。b：纤维化面积的定量被表示为纤维化面积相对于总表面的％。结果被表示为来自于每个组中4只动物的至少5个切片的平均值+/-se。实验部分下文中描述的实验具体来说显示了：-在肾纤维化的严重诱导的两种模型(由肾小球基底膜抗血清诱导的模型和输尿管单侧梗阻模型)中，cd146在肾小球毛细血管的水平上明显增加，并且循环血中scd146的浓度大大提高；在使用cd146ko小鼠时对纤维化的影响极大降低，并且在用抗scd146抗体注射所述动物时，这种影响被阻止或逆转；-在小鼠中的心肌梗塞模型中，在纤维化区域附近cd146增加，并且scd146增加；-在cd146ko动物中，与对照动物相比在心肌梗塞后纤维化的量减少；-在老年小鼠中，与wt小鼠相比，在ko-cd146小鼠中心肌纤维化的发生减少；-scd146在体外增加肾和心脏成纤维细胞的增殖，并诱导它们向成肌纤维细胞的转变；-在肾和心脏内皮细胞中，scd146在体外诱导内皮-间质转化；和-scd146在体外显著诱导常常与纤维化相关的mir21。这些结果显示，scd146在各种不同的与纤维化相关的病症、通常为人类纤维化疾病中丰富地分泌，并通过靶向成纤维细胞和内皮细胞两者参与间质纤维化的发生。此外，当用抗scd146抗体治疗动物时，所述现象被阻止或逆转。实施例1–在小鼠中cd146的内皮特异性缺失针对实验性肾小球肾炎提供保护材料和方法小鼠株系cd146-floxed和cd146-ko小鼠如以前所述产生并回交超过10代，成为c57bl/6j背景(bardin,n,2009)。首先将cd146-floxed小鼠与表达荧光蛋白zsgreen1作为cre重组酶活性的报告物的b6.cg-gt(rosa)26sortm6(cag-zsgreen1)hze/j小鼠(jacksonlaboratories)杂交。然后，通过将cd146flox-zsgreen动物与作为来自于drralfadams的馈赠(wang,y2010)的cdh5(pac)-creert2小鼠株系进一步杂交，产生具有cd146基因的内皮细胞特异性缺失的小鼠。所述cd146基因的缺失通过腹腔注射在玉米油中稀释的他莫昔芬(10mg/ml溶液，1mg他莫昔芬/注射)并连续给药3天来诱导。用于cd146等位基因的基因分型的引物是seqidno：22：5’-tcacttgacagtgtgatggt-3'(用于检测cd146wt、floxed和ko等位基因的正向引物)、seqidno：23：5’-ccttagaaagcagggattca-3'(用于检测cd146wt和floxed等位基因的反向引物)和seqidno：24：5’-cccaaatcctctggaagaca-3'(用于检测cd146ko等位基因的反向引物)。多种人类肾小球疾病中的cd146分析人类肾脏活检组织在多中心研究(欧洲肾脏cdna库-freseniusbiopsybank，ercb)中收集，并在书面知情同意后和当地伦理委员会的批准下从患者获得。移植前同种异体移植物活检组织被用作对照肾脏。如以前所述从显微切割的肾小球分离总rna，反转录并线性扩增(djudjaj,s.,2012)。按照affymetrix表达分析技术手册(affymetrix,santaclara,ca,usa)进行片段化、杂交、染色和成像。将基于单一探针的分析工具chip-inspector(genomatixsoftwaregmbh,munich,germany)用于转录本注释、总强度归一化、微阵列的显著性分析(cohen,c.d2008)和基于显著变化的探针的转录本鉴定。将预先开发的taqman探针(appliedbiosystems)用于通过qpcr的人类cd146和gapdh检测。mrna表达通过标准曲线定量进行分析。肾毒性血清诱导的肾小球肾炎去补体的肾毒性血清(nts)如以前所述制备(mesnardl2009；kerrochm,2012)，并在连续两天(第1和2天)内静脉内注射每克体重17,5μl血清。对于时间过程方案来说，将2月龄雌性c57bl6/j用nts注射，并在第4、7和15天处死，用于组织收集(每个时间点n＝6只小鼠)。6只小鼠用pbs注射并用作对照。对于cd146-ko方案来说，使用2月龄cd146-ko雌性小鼠和它们的野生型同窝仔畜(每组n＝16)。将来自于每个组的10只小鼠用nts注射并且6只用pbs注射。在第0、4、8和15天获取体重和尿液样品。所有小鼠在第15天处死并获得血液和组织样品。对于cd146-floxed方案来说，将10只2月龄雌性小鼠用他莫昔芬处理。它们中的6只用nts注射，4只用pbs注射。将不带有cre重组酶转入基因的cd146-floxedzsgreen小鼠用他莫昔芬处理并用作对照(对于nts来说n＝6，对于pbs来说n＝4)。在第0、4、8、12和15天获取体重和尿液样品。在第15天，在获取血液样品后将小鼠处死。关于动物实验的所有程序遵照欧盟实验室动物的护理和使用准则，并得到法国国家健康与医学研究院(institutnationaldelasantéetdelarecherchemédicale)的当地伦理委员会批准。动物被饲养在恒定温度下，并自由取用水和食物。组织学和功能参数将来自于每只动物的半个肾脏固定在4％福尔马林溶液中并包埋在石蜡中。将4μm切片用梅森三色染色，用于肾损伤的组织学评估。肾小管扩张使用下述量表半定量评估：0，无肾小管损伤；1，所分析的肾小管中1–25％损伤；2，所分析的肾小管中26–50％损伤；3，所分析的肾小管中51–75％；4，所分析的肾小管中>76％损伤。肾小球新月体被测量，并表示为表现出新月体的肾小球的数目相比于肾小球总数的％。评分由两位不同的调查人员在编号载片上以不知情的方式进行。图像使用olympusix83光子显微镜在x200放大倍数下进行。间质纤维化在天狼猩红染色的石蜡切片上以x200放大倍数进行半定量评估。然后使用基于计算机的形态计量分析软件(analysis,olympus)对纤维化进行定量，所述软件允许形成二值图像，其中染色区域可以被自动计算为图像区域的百分率。bun和蛋白尿水平使用酶法(konelabautomater)测量，并分别以毫摩尔/升和克/毫摩尔肌酐为单位表示。免疫染色免疫组织化学在4μm厚的石蜡包埋组织切片上进行。将组织脱石蜡，并使用ph6的10mm柠檬酸在95℃下进行抗原修复。将切片用0.1％triton/pbs通透化。使用针对f4/80(abdserotec)和cd3(dako)的抗体。f4/80和cd3阳性区域在每只动物至少10张200x放大倍数的照片中使用可公开获得的图像处理软件(imagej；fiji)进行定量，并表示成总组织面积的百分率。免疫荧光在在甲醇中固定的4μm厚冷冻切片上进行。使用cd146(自制大鼠抗小鼠)、cd31(abcam)、紧密连接蛋白-1(thermoscientific)、巢蛋白(bdpharmingen)、肾素(abcam)抗兔和α-sma(sigmaaldrich)抗小鼠抗体。alexafluor(invitrogen)第二抗体被用于检测。图像使用olympusix83光子显微镜在x400放大倍数下获得。定量实时pcr使用tri试剂(mrc)从半个肾脏提取总rna。通过测量od260:280比率来验证rna质量，并通过在37℃下进行30分钟的dnasei处理(thermofisherscientific)来除去残留的基因组dna。使用来自于thermofisherscientific的maxima第一链cdna合成试剂盒，按照制造商的说明书将总共1mgrna转录成cdna。实时pcr利用rochelightcycler480检测系统，使用sybrgreenpcr主混合物(rochediagnostics,indianapolis,in)在下述程序下进行：95℃5分钟，95℃15秒和60℃15秒共45个循环，和72℃15秒。对于定量分析来说，使用ddct方法将实验基因归一化到hprt表达。分析解离曲线以确定扩增的是单一产物。引物序列在表1中列出。western印迹使用ripa裂解缓冲液(santacruzbiotechnology)从肾脏组织提取蛋白质。针对cd146(epitomics)的western印迹使用以前描述的标准技术来进行(bardin等，2009)。gapdh(sigma-aldrich)被用作载样对照。统计分析值被表示为平均值±sem。数据使用单向方差分析，然后使用statview软件包的受保护的最小显著差异fisher检验来分析。误差条对于体内数据来说表示平均值±sem，对于体外数据来说表示平均值±sd。具有p<0.05的结果被认为是统计显著的。表1：结果cd146在受损的肾小球中被诱导为了评估肾小球疾病进展期间cd146的表达，本发明人在野生型小鼠中诱导了被动的肾毒性血清肾小球肾炎(nts-gn)。在nts给药后4、7和15天将动物处死。免疫荧光显示在健康动物的肾小球中cd146的表达弱(图1a)。在肾小管周毛细血管和受损的肾小球中，从第4天至第15天，cd146表达逐步提高。这种上调通过肾组织的western印迹得以确认(图1b和1c)。cd146敲除小鼠受到保护免于肾毒性血清诱导的肾小球肾炎。为了评估cd146在gn中的作用，我们在cd146wt和ko小鼠两者中注射nts。在nts给药后15天将小鼠处死。正如预期的，nts-gn在wt动物中诱导疾病后导致体重增加(图2a)。相应地，肾功能改变，因为蛋白尿和血尿素氮(bun)两者均大大增加(图2b和2c)。相反，在cd146ko小鼠中，体重和bun增加被减弱。此外，在这些小鼠中蛋白尿的升高明显更低。通过梅森三色染色进行的组织学病损的定量显示，在cd146ko小鼠中nts注射诱导更少的损伤(图2d)。事实上，通过与wt动物相比新月体形成和肾小管扩张两者的显著减少，证实了cd146ko动物中的显著结构保护(图2e和2f)。因此，cd146ko动物受到保护免于由nts-gn诱导的肾小球和肾小管病损，其保留肾功能并且蛋白尿减少。cd146ko小鼠在nts注射后显示出炎症和肾纤维化的减少通过qpcr进行的肾脏中的炎性标志物的评估显示，在cd146ko小鼠中，在nts注射后15天il-1β、tnf-α和icam-1mrna的诱导被减弱(图3a、3b和3c)。因此，f4/80免疫染色显示出在cd146ko小鼠的肾皮质中更少的巨噬细胞浸润(图3d和3e)。此外，这些动物在第15天表现出减少的cd3细胞浸润(图3f和3g)。因此，在缺少cd146的小鼠中肾纤维化受限。事实上，在cd146ko小鼠中纤维化标志物例如tgf-β和胶原蛋白iii的mrna表达被减弱(图3h和3i)。天狼猩红着色的定量确认了这些动物中肾间质纤维化的减少(图3j)。合在一起，这些数据证实在nts-gn中cd146的缺少显著限制了肾脏炎症和肾间质纤维化。在nts-gn进展期间肾小球内皮中的cd146增加为了鉴定在攻击后受损的肾小球中过表达cd146的细胞类型，本发明人在nts给药后第7天使用适合的肾小球组分的标记物进行了着色实验。cd146在基础条件下在血管簇中略微表达(图1a)。在诱导nts-gn后，cd146过表达主要与内皮标志物cd31/pecam共定位(图4a)。相反，在足细胞中没有检测到cd146，因为没有与巢蛋白共定位(图4b)。它既没有在壁细胞中检测到，因为他们没有检测到cd146与紧密连接蛋白-1的任何共定位(图4c)，也没有在系膜细胞中检测到(图4d)。因此，本发明人的数据确认了在疾病诱导后cd146主要在受损的肾小球内皮细胞中高度过表达。cd146的内皮特异性缺失保护小鼠抵抗nts-gn为了估计内皮cd146过表达在nts-gn进展中的影响，本发明人产生了cd146-ec-del小鼠株系。通过将带有他莫昔芬可诱导的ve-钙粘蛋白cre重组酶的小鼠(wang,y,2010)与cd146flox-zsgreen小鼠杂交育种，特异性缺失了血管内皮中的cd146(图5a)。内皮细胞中cd146缺失的特异性在他莫昔芬注射后和nts给药后15天通过免疫荧光得以验证(图5b)，并通过qpcr进一步确认(图5c)。cd146-ec-del小鼠显示出体重、蛋白尿和bun的有限增加(图6a-c)。这种功能保护通过肾脏结构的全面保留得以实现(图6d)，因为在诱导nts-gn后15天，与相应的对照相比新月体数量(图6e)和肾小管损伤(图6f)两者均急剧减少。此外，f4/80免疫染色显示出在cd146-ec-del小鼠的肾皮质中单核细胞浸润减少(图7a)。相应地，qpcr实验显示出vcam-1和mcp1两者的上调被完全消除(图7b和7c)。随后，与对照肾脏相比，在cd146-ec-del小鼠中tgf-β1和胶原蛋白imrna的增加的表达被减弱(图7d和7e)。这些数据证实了在小鼠中cd146的内皮过表达促进实验性gn的进展。在人类肾小球疾病中cd146转录本数目增加在来自于患有糖尿病性肾病(dn，n＝7)、微小病变肾病(mcd，n＝5)、iga肾病(iga，n＝27)、局灶性节段性肾小球硬化(fsgs，n＝10)、膜性肾小球肾炎(mgn，n＝21)、狼疮性肾炎(sle，n＝32)和快速进行性肾小球肾炎(rpgn，n＝23)的患者的肾活检组织的显微切割的肾小球中分析了cd146mrna表达。与对照活检组织(n＝6)相比，损伤的肾小球显示出cd146转录本的显著转录上调(图8)。讨论各种不同的慢性炎性