一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803／DDP、其培养方法及应用
本申请实施例涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp、其培养方法及应用。
背景技术：
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，出现转移或周围侵犯的进展期胃癌首选以化疗为主的综合治疗，ddp是胃癌化疗中广泛应用的一线化疗药物，但胃癌细胞耐药是胃癌患者有效治疗的主要障碍，然而胃癌ddp耐药机制尚不清楚。
建立稳定可靠的肿瘤耐药细胞系是体外研究肿瘤细胞产生的耐药机制的基础和前提，可为深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制，以及寻找预防和逆转肿瘤耐药的策略提供实验基础，经检索，未见与本申请的相同报道。
微小rna(mirna)的异常表达与多种肿瘤的化疗敏感性有关，可用于预测化疗疗效，深入发掘胃癌发病机制相关的生物标志物mirna，对于指导胃癌评估预后和诊疗具有很重要的意义，经检索，未见与本申请的相同报道。
技术实现要素：
本发明实施例的一个目的在于提供一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp、其培养方法及应用，用于解决现有技术中无法深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制的技术问题。
本发明实施例的另外一个目的在于提供一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的应用，用于解决现有技术中在胃癌治疗前无法有效评估含顺铂化疗方案的预期疗效及其生存期的技术问题。
为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为：
第一方面，本发明实施例提供了一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
a)对人胃癌细胞系mgc803进行ddp浓度大剂量间歇冲击性诱导，直到在含ddp第一浓度的dmem培养基中稳定生长，建立人胃癌ddp中度耐药细胞系mgc803/ddp；
b)通过ddp浓度梯度递增诱导法对所述人胃癌ddp中度耐药细胞系mgc803/ddp持续诱导，直到在含ddp第二浓度的dmem培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp，其中，所述第二浓度大于所述第一浓度。
作为本发明第一方面的一个优选实施例，所述步骤b)具体包括以下步骤：
b1)向中度耐药细胞系mgc803/ddp处于对数生长期细胞中加入含梯度浓度ddp的dmem培养基，继续培养48h；
b2)弃除含ddp的dmem培养基，换用含维持浓度ddp的dmem培养基进行培养，并每天更换新鲜含维持浓度ddp的dmem培养基，直到传代后待细胞生长状态良好，存活细胞恢复生长并进入对数生长期再加入诱导浓度顺铂的dmem完全培养基；
重复上述步骤b1)-b2)，直到在含ddp第二浓度的dmem培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp。
作为本发明第一方面的一个优选实施例，所述步骤b1)中含梯度浓度ddp的dmem培养基以含2.5μg/mlddp浓度的dmem培养基为起始，每次递增0.5μg/mlddp浓度。
作为本发明的第一方面的一个优选实施例，所述步骤b2)中所述对进入对数生长期再加入诱导浓度ddp的dmem完全培养基的诱导浓度ddp根据存活细胞增殖情况变化而进行设置。
作为本发明第一方面的一个优选实施例，所述步骤b2)中含维持浓度ddp的dmem培养基为含1μg/mlddp浓度的dmem培养基。
作为本发明第一方面的一个优选实施例，所述含ddp第一浓度的dmem培养基为含2.5μg/ml的dmem培养基，所述含ddp第二浓度的dmem培养基为含5μg/ml的dmem培养基。
作为本发明第一方面的一个优选实施例，所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp在含2μg/mlddp浓度的dmem培养基中维持其耐药性，在用于实验前一周撤去含ddp的dmem培养基，并且在细胞传代一次稳定生长后使用。
与现有技术相比，本发明实施例第一方面提供的一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的培养方法并通过此培养方法建立了高度耐药人胃癌ddp耐药细胞系，为深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制提供基础。
第二方面，本发明实施例提供了一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp，利用本发明实施例第一方面提供的任一项技术方案所述的一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的培养方法得到，所述一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的保藏号为cctccno:c202074。
作为本发明第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞对ddp的半数抑止浓度ic50为7.59±0.22μg/ml，所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞对人胃癌细胞系mgc803细胞的ddp耐药系数ri为13.4±0.91。
作为本发明第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞对0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.2μg/ml三个ddp浓度的相对克隆形成率分别为98.83±1.19％、97.65±1.09％和96.48±1.99％，各组之间统计学差异p值大于0.05。
作为本发明第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞对人胃癌细胞系mgc803的细胞在0.25μg/mlddp浓度的相对细胞凋亡率分别为2.25±0.25％和20.11±0.39％，两组之间统计学差异p值小于0.0001；所述人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞对人胃癌细胞系mgc803的细胞在1μg/mlddp浓度的相对细胞凋亡率分别为5.20±0.53％和64.48±2.42％，两组之间统计学差异p值小于0.0001。
与现有技术相比，本发明实施例第二方面提供的人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp有益效果与本发明实施例第一方面提供任一技术方案所述的一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的培养方法有益效果相同，在此不再赘述。
第三方面，本发明实施例提供了一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的应用，其特征在于，对人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞进行mirna高通量测序筛选出如权利要求8至11中任一项所述的人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞和人胃癌细胞系mgc803间的显著差异表达mirna；所述显著差异表达mirna包括：hsa-mir-124-3p、hsa-mir-9-5p、hsa-mir-204-5p、hsa-mir-146a-5p、hsa-mir-129-5p、hsa-mir-127-3p、hsa-mir-211-5p、hsa-mir-486-5p、hsa-mir-9-3p、hsa-mir-381-3p、hsa-mir-3180、hsa-mir-3180-3p、hsa-mir-370-3p、hsa-mir-135a-5p、hsa-mir-146b-5p、hsa-mir-522-5p、hsa-mir-519b-5p、hsa-mir-519a-5p、hsa-mir-518e-5p、hsa-mir-523-5p、hsa-mir-519c-5p、hsa-mir-7977、hsa-mir-543、hsa-mir-433-3p、hsa-mir-1244、hsa-mir-486-3p、hsa-mir-6724-5p、hsa-mir-663a、hsa-mir-124-5p、hsa-mir-382-5p、hsa-mir-1306-3p、hsa-mir-1-3p、hsa-mir-1285-5p、hsa-mir-3913-5p和hsa-mir-181a-2-3p。
作为本发明第三方面的一个优选实施例，通过数据库中kaplan-meier生存图使用kaplan-meier生存数据进行了大队列分析，对所述显著差异表达mirna进行筛选，获得在人胃癌中与总体生存有显著相关性的第一生物标记物mirna，所述显著相关性第一生物标记物mirna包括：mir-9-3p，mir-9-5p，mir-146a-5p，mir-370-3p，mir-433-3p，mir-519a-5p和mir-522-5p。
作为本发明第三方面的一个优选实施例，通过rt-qpcr检测人胃癌患者血清样本和人胃癌细胞，在所述第一生物标记物mirna中筛选出作为区分人胃癌ddp耐药患者和人胃癌ddp敏感患者的第二生物标志物mirna，其中，所述第二生物标志物mirna包括：mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p。
作为本发明第三方面的一个优选实施例，通过rt-qpcr检测人胃癌患者血清样本和人胃癌细胞，在所述第一生物标记物mirna中筛选出作为区分人胃癌ddp耐药患者和人胃癌ddp敏感患者的第二生物标志物mirna，所述第二生物标志物mirna为mir-9-5p。
作为本发明第三方面的一个优选实施例，通过roc曲线预测所述第二生物标志物对ddp化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物mirna，其中，所述第三生物标志物mirna包括：mir-9-5p+mir-9-3p联合模型、mir-9-5p+mir-433-3p联合模型、mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p联合模型和mir-9+mir-433联合模型。
作为本发明第三方面的一个优选实施例，通过roc曲线预测所述第二生物标志物对ddp化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物mirna，其中，所述第三生物标志物mirna为mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p联合模型。
与现有技术相比，本发明实施例第三方面通过对人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp细胞的mirna高通量测序发现与人胃癌ddp耐药相关的35个差异表达的mirna，其中11个表达上调，24个表达下调，通过公共数据库生存分析发现在人胃癌中与总体生存有显著相关性生物标记物为mir-9-3p，mir-9-5p，mir-146a-5p，mir-370-3p，mir-433-3p，mir-519a-5p和mir-522-5p，通过rt-qpcr检测人胃癌患者的血清样本和人胃癌细胞，筛选出mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p可作为区分人胃癌ddp耐药患者和人胃癌ddp敏感患者的生物标志物，再通过分析患者临床参数与mirna表达水平的关系并应用受试者工作特征(roc)曲线评价其诊断效能，从而筛选最合适的目的mirna，如mir-9-3p+mir-9-5p+mir-433-3p的联合模型和mir-9-5p均可作为确切的预测耐药和生存不良的有效生物标志物，本发明实施例发掘能够预测人胃癌ddp化疗疗效的mirna，为临床评估人胃癌化疗疗效开拓新的思路。
生物保藏说明：
分类命名：人胃癌顺铂耐药细胞系mgc803/ddp；于2020年05月06日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno:c202074。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本申请的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分，本领域技术人员应该理解的是，这些附图未必是按比例绘制的，在附图中：
图1为本发明公开的一个实施例mgc803(a)和mgc803/ddp(b)细胞镜下形态；
图2为本发明公开的一个实施例mgc803细胞str鉴定21个位点的定位图像；
图3为本发明公开的一个实施例mgc803/ddp细胞str鉴定21个位点的定位图像；
图4为本发明公开的一个实施例与mgc803细胞相比，mgc803/ddp细胞的细胞活力(a)和耐药性(b)；
图5为本发明公开的一个实施例与mgc803细胞相比，mgc803/ddp细胞的克隆形成能力(a)和耐药性(b)；
图6为本发明公开的一个实施例与mgc803细胞相比，mgc803/ddp细胞的抗凋亡能力(a)和耐药性(b)；
图7为本发明公开的另一个实施例总rna琼脂糖凝胶检测结果；
图8为本发明公开的另一个实施例mgc803agilent2200检测峰图；
图9为本发明公开的另一个实施例mgc803/ddpagilent2200检测峰图；
图10为本发明公开的另一个实施例mirna的qpcr扩增曲线(a)和熔解曲线(b)；
图11为本发明公开的另一个实施例样本间mirna差异表达分析火山图；
图12为本发明公开的另一个实施例样本间mirna差异表达分析热图；
图13为本发明公开的另一个实施例文库制备的具体实验流程；
图14为本发明公开的另一个实施例生物信息数据分析流程；
图15为本发明公开的另一个实施例在kaplan-meierplotter数据库中各个mirna与人胃低分化腺癌生存预后关系；
图16为本发明公开的另一个实施例与mgc803细胞相比，7个候选的mirna在mgc803/ddp细胞中的表达差异；
图17为本发明公开的另一个实施例mirnas在临床样本中的表达水平；
图18为本发明公开的单一mirna诊断区分人胃低分化腺癌化疗反应的roc曲线及曲线下面积；
图19为本发明公开的另一个实施例两个mirna诊断区分胃癌化疗反应的roc曲线及曲线下面积；
图20为本发明公开的另一个实施例多个mirna诊断区分人胃低分化腺癌化疗反应的roc曲线及曲线下面积；
图21为本发明公开的另一个实施例与mir-9-5p相比有差异的mirna联合模型的roc曲线；
图22为本发明公开的另一个实施例在oncolnc数据库和oncomir数据库中各个mirna与人胃低分化腺癌生存预后关系；
图23为本发明公开的另一个实施例在oncomir(a、b和c)和kaplan-meierplotter(d)数据库中不同mirna联合模型的表达水平与人胃低分化腺癌生存预后的关系。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明实施例中，ddp为顺铂简称。
实施例1大剂量间歇冲击性诱导联合浓度梯度递增持续性诱导法建立人胃癌ddp耐药细胞系
1、现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp的培养
1.1获取现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp和其亲本人胃癌细胞系mgc803，人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp为赠予获取，其亲本人胃癌细胞系mgc803来自国家细胞资源协和细胞库，现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp使用ddpddp浓度大剂量间歇冲击性诱导法，历经10个月将mgc803诱导成功，建立人胃癌耐ddp细胞系mgc803/ddp，现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞系可在含ddp2.5μg/ml的dmem完全培养基中稳定生长，其对ddp的半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，ic50)约为5.66μg/ml，因其亲本人胃癌细胞系mgc803对ddp的半数抑制浓度ic50约为0.59μg/ml，耐药指数(resistanceindex，ri)＝耐药细胞半数抑制浓度ic50/亲本细胞半数抑制浓度ic50，故现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp的ri约为9.6，ri的分级1～5为低度耐药；5～10为中度耐药；10以上为高度耐药。因此现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞系为中度耐药，接近高度耐药，仍需继续诱导培养。
1.2浓度梯度递增持续性诱导法持续诱导人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp
现有人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp持续诱导采用ddp浓度梯度递增持续性诱导法，对数生长期细胞加入含梯度浓度ddp(2.5μg/ml起始，每次递增0.5μg/ml)的dmem完全培养基，继续培养48h后弃含ddp的诱导浓度dmem完全培养基，换用维持浓度(1μg/ml)dmem培养基，继续培养，每天更换新鲜维持浓度(1μg/ml)dmem培养基，传代后待细胞生长状态良好，存活细胞恢复生长并进入对数生长期后再加入诱导浓度ddp(根据存活细胞增殖情况提高药物浓度)的dmem完全培养基，如此反复，共历时3个月，直到细胞能在含5μg/mlddp的dmem完全培养基中维持生长，并能稳定传代，即成为新人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp，耐药细胞在含2μg/mlddp的dmem完全培养基中维持其耐药性，新人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp在实验前1周撤去含ddp的dmem完全培养基，并且细胞传代1次稳定生长后使用。
2、新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp的鉴定
2.1细胞形态观察
采用普通光学倒置显微镜观察其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞并拍照。正常培养的其亲本人胃癌细胞系mgc803细胞呈三角形，大小一致，核呈圆形(见图1a)；新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞呈圆梭形，大小不一致，形态不规则，胞浆较丰富，细胞核不规则，且可见巨核现象(见图1b)
2.2新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddpstr鉴定
(1)从样本细胞中提取基因组dna。(2)使用geneprint系统(美国promega公司)阳性和阴性对照的样本进行扩增。(3)扩增产物使用abi3730xl基因分析仪进行处理。(4)使用genemapper4.0软件进行数据分析。(5)使用国家实验细胞资源共享服务平台(http://www.cellresource.cn/)在线str比对功能进行匹配推算出样品所属的细胞系名称。(6)根据ansi标准，100％匹配的细胞系被认为是“相同的”；80％以上但小于100％匹配的细胞系被认为是“相关的”。
3、其亲本人胃癌细胞系mgc803细胞str鉴定
其亲本人胃癌细胞系mgc803细胞str鉴定的21个位点如表1所示，各位点的定位图像如图2所示。在线str比对中9个位点匹配结果如表2所示，16个位点匹配结果如表3所示。mgc803细胞str结果表明：(1)9个主要位点上不存在4个等位基因，证实该细胞系中不存在交叉感染；(2)细胞样本和str数据库之间的匹配百分率为100％(21/21)，该细胞名称为mgc803。
表1mgc803细胞str鉴定位点
表2mgc803细胞str比对中9个位点匹配结果
表3mgc803细胞str比对中16个位点匹配结果
4、新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞str鉴定
新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞str鉴定的21个位点如表4所示，各位点的定位图像如图3所示。在线str比对中16个位点匹配结果如表5所示。mgc803/ddp细胞str结果表明：(1)16个主要位点上不存在4个等位基因，证实该细胞系中不存在交叉感染；(2)细胞样本和str数据库之间的匹配百分率为85.7％(30/35)，该细胞认为是与mgc803相关的细胞。
表4mgc803/ddp细胞str鉴定位点
表5mgc803/ddp细胞str比对中16个位点匹配结果
5、细胞增殖实验检测细胞耐药性
(1)取对数生长期的其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp，0.25％胰酶消化后用完全培养基重悬制备成单细胞悬液。(2)采用细胞计数板计数后调整细胞浓度为1.5×105细胞/毫升，以每孔3×103个细胞把细胞悬液200μl接种于96孔培养板，注意接种时应不断吹打混匀细胞。(3)培养18h待细胞贴壁后，实验组设置7个ddp浓度梯度，各浓度依次倍比稀释，分别在其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp中加入200μl终浓度为16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml的含ddp完全培养基，常规培养48h；每个浓度设4个复孔，同时设置不含细胞仅含培养液的调零孔及不加药物干预的对照组。(4)48h后，取出96孔培养板，每孔加入20μl的浓度为5mg/ml的mtt(噻唑蓝)溶液。在37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养4h后弃去培养液，每孔加入150μldmso溶液，持续中速振荡10min，使形成的蓝色结晶甲臜完全溶解。(5)用酶标仪测量在490nm波长处测定吸光度od(光密度)值。(6)细胞抑制率(％)＝[1-(给药组平均od值-调零孔od值)/(对照组平均od值-调零孔od值)]×100％。细胞存活率(％)＝100％-细胞抑制率(％)。以各组细胞ddp浓度为横坐标，细胞存活率(％)为纵坐标，绘制细胞在ddp作用下的存活曲线(见图4a)。(7)应用spssversion23统计软件计算ic50(见图4b)，计算耐药系数(ri)＝耐药细胞ic50/亲代细胞ic50，上述实验重复3次。结果表明，新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞对ddp的ic50为7.59±0.22g/ml以及其亲本人胃癌细胞系mgc803细胞对ddp的ic50为0.55±0.02g/ml，两组差异有统计学意义(p<0.0001)。因此，细胞增殖实验证明新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp细胞对其亲本人胃癌细胞系mgc803细胞的ddp耐药系数(ri)为13.4±0.91，属于高度耐药。
6、单细胞克隆形成实验检测细胞耐药性
(1)取对数生长期的其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp，0.25％胰酶消化后用dmem完全培养基重悬制备成单细胞悬液。(2)采用细胞计数板计数后调整细胞浓度为1×102细胞/毫升，以每孔2×102个细胞把细胞悬液2ml接种于37℃预温的六孔培养板，并轻轻转动，使细胞均匀分散。(3)培养18h待细胞贴壁后，实验组设置3个ddp浓度梯度，各浓度依次倍比稀释，分别在其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp中加入2ml终浓度为0.2μg/ml、0.1μg/ml和0.05μg/ml的含ddp的dmem完全培养基，常规培养48h；每个浓度设3个复孔，同时设置不加药物干预的对照组。(4)48h后，取出六孔培养板，每孔加入3ml新鲜完全培养基。在37℃、5％co2饱和湿度培养箱中静置培养两周。每2～3天观察1次，当培养皿中出现的克隆大小达到肉眼可见时，终止培养。(5)弃去培养基，使用pbs浸洗2次。然后加入4℃预冷的4％多聚甲醛溶液固定细胞半小时。(6)吸干固定液，常温下加入2ml/皿的1％结晶紫染色液持续染色10分钟，然后吸干染色液，常温晾干。(7)显微镜(低倍镜)下随机找到6个视野，计数克隆(要求大于50个细胞)数并计算克隆形成率。实验重复3次，取平均值。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。相对克隆形成率(％)＝(给药组平均克隆形成率/对照组平均克隆形成率)×100％。(8)以各组细胞ddp浓度为横坐标，相对克隆形成率(％)为纵坐标，作图分析，利用单细胞克隆形成实验检测单细胞克隆形成情况(见图5a)，用相对克隆形成率评价细胞对ddp耐药性(见图5b)。结果表明，mgc803细胞对0.05g/ml、0.1g/ml和0.2g/ml三个ddp浓度的相对克隆形成率分别为92.87±0.61％、86.97±0.89％和71.89±1.43％，各组之间差异有统计学意义(p<0.01)。而mgc803/ddp细胞对0.05g/ml、0.1g/ml和0.2g/ml三个ddp浓度的相对克隆形成率分别为98.83±1.19％、97.65±1.09％和96.48±1.99％，各组之间差异没有统计学意义(p﹥0.05)。因此，单细胞克隆形成实验证明mgc803/ddp细胞相较mgc803细胞对ddp的抗性明显增加。
7、流式细胞术检测细胞耐药性
(1)取对数生长期的其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp，0.25％胰酶消化后用dmem完全培养基重悬制备成单细胞悬液。(2)采用细胞计数板计数后调整细胞浓度为1×105细胞/毫升，以每孔2×105个细胞把细胞悬液2ml接种于37℃预温的六孔培养板，并轻轻转动，使细胞均匀分散。(3)培养18h待细胞贴壁后，实验组设置2个ddp浓度梯度，各浓度依次倍比稀释，分别在其亲本人胃癌细胞系mgc803和新建立人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp中加入2ml终浓度为1μg/ml和0.25μg/ml的含ddp的dmem完全培养基，常规培养48h；每个浓度设3个复孔，同时设置不加药物干预的对照组。(4)细胞收集：48h后，取出六孔培养板，用不含edta(乙二胺四乙酸)的胰酶消化收集全部细胞(包括漂浮在培养基中和pbs冲洗下来的细胞)后(注：胰酶消化的时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与annexinv-fitc的结合)，在室温中，2000rpm离心5～10分钟，收集细胞。(5)细胞洗涤：用预冷1×pbs(4℃)重悬细胞1次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞。(6)用去离子水将10×bindingbuffer稀释成1×bindingbuffer，加入100μl的1×bindingbuffer悬浮细胞。(7)annexinv-fitc标记：加入5μl的annexinv-fitc混匀后，避光，室温孵育15分钟。(8)pi标记：上机前5分钟再加入5μl的pi染色。(9)上机前，补加200μl的1×bindingbuffer。置于冰上避光保存准备进行流式细胞仪检测。实验重复3次，取平均值。(10)结果分析：细胞凋亡率(％)＝早期凋亡率(％)+晚期凋亡率(％)。相对细胞凋亡率(％)＝(给药组平均细胞凋亡率/对照组平均细胞凋亡率)×100％。以各组细胞ddp浓度为横坐标，相对细胞凋亡率(％)为纵坐标，作图分析(见图6a)，用相对细胞凋亡率评价细胞对顺铂耐药性(见图6b)。结果表明：mgc803/ddp细胞对mgc803细胞在0.25g/ml顺铂浓度的相对细胞凋亡率分别为2.25±0.25％和20.11±0.39％，两组之间差异有统计学意义(p<0.0001)；mgc803/ddp细胞对mgc803细胞在1g/ml顺铂浓度的相对细胞凋亡率分别为5.20±0.53％和64.48±2.42％，两组之间差异有统计学意义(p<0.0001)。因此，流式细胞术证明mgc803/ddp细胞相较mgc803细胞对顺铂的耐药程度明显增加。
与现有技术相比，本发明实施例第一方面通过大剂量间歇冲击性诱导联合浓度梯度递增持续性诱导法建立了人胃癌ddp耐药细胞系mgc803/ddp，并通过细胞增殖活性检测、单细胞克隆形成实验和流式细胞术证实了mgc803/ddp细胞对顺铂高度且稳定耐药，为深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制提供了基础。
实施例2一种人胃癌ddp高度耐药细胞系mgc803/ddp的应用
1、总rna的提取
1.1人胃癌血清样本总rna的提取
mirneasyserum/plasmaspike-incontrol是秀丽隐杆线虫的mir-39mirna类似物，将其作为血清mirna表达谱的外参等量地分别加入到每个血清样本中，以帮助监测rna回收率和反转效率。然后使用mirneasyserum/plasmakit试剂盒从血清中提取和纯化血清总rna。具体步骤如下：(1)血清样本溶于qiazollysisreagent后，向样本中加入mirneasyserum/plasmaspike-incontrol。(2)加入氯仿后，裂解液离心后分成水相和有机相。rna位于上层水相，dna位于中间相，蛋白位于下层有机相或中间相。(3)提取上层水相后，加入乙醇以提供rna结合的合适条件，rna分子大于18个核苷酸。(4)样品再加入rneasyminelute离心柱，总rna结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去。(5)高品质rna在小体积不含rnase水中洗脱。
1.2细胞总rna提取
采用trizol法提取细胞rna：(1)收集对数生长期的细胞，每1×106个细胞加入1mltrizol。反复吹打至液体澄清，使细胞充分裂解。将裂解液转移至无酶的1.5mlep(eppendorf)管中，室温静置5min。(2)加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，混匀后室温静置5min。然后4℃、12000rpm离心15min。(3)采集最上层澄清透明无色液体，将其移至新的无酶1.5mlep管中。(4)加入等体积异丙醇，缓慢颠倒混匀，室温静置10min。然后4℃、12000rpm离心10min。(5)弃去上清，加入1ml75％乙醇，振荡混匀。4℃、7500rpm离心5min后弃去上清。(6)重复一次(5)。(7)吸干残余液体，室温晾干。加入适量depc(焦碳酸二乙酯)水溶解rna，-30℃保存备用。
2、总rna质量检测
2.1总rna纯度和浓度检测(见表6)
取备用的rna溶液稀释、混匀后，使用nanodrop分光光度计测定rna在230nm、260nm和280nm的吸收值(od230、od260和od280)，以评估纯度。用od260/od280鉴定rna纯度，判断标准为：1.8<od260/od280<2.0。若比值太低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示rna有降解。用od260/od230鉴定rna纯度，判断标准为：od260/od230≥2.0。若比值太低，说明有乙醇残余。
根据od260值计算总rna浓度：rna(μg/ml)＝40×od260读数×稀释倍数(n)/1000，计算rna总量大于2μg，满足建库及后续实验需要。
表6总rna浓度和纯度检测检测结果
2.2总rna完整性检测
2.2.1琼脂糖凝胶电泳检测
1％的琼脂糖凝胶电泳检测rna样品是否有降解以及杂质，判定标准：目的条带明亮清晰，泳道无弥散区，无蛋白和dna污染的样品质量较好(见图7，m，marker(2μl)；1，mgc803(225ng)；2，mgc803/ddp(225ng))，方法步骤：(1)1.0g琼脂糖加热融于90ml无酶ddh2o(双蒸水)中，冷却至60℃。先加入5.4ml37％甲醛和10ml10×mops电泳缓冲液，再加入6μleb(10μg/ml)后混匀，最后将上述溶液注入电泳槽(预先经3％h2o2和0.1％depc-ddh2o处理过)中，制成1％琼脂糖凝胶。(2)5μl甲醛上样缓冲液与10μlrna溶液混匀后加到上样孔，100v恒压电泳5min。
2.2.2总rna完整性评估
rna样本总量及完整性是评判样品质量的关键点，其中，rna完整性评估依靠rin值、28s/18s以及agilent2200检测峰图基线是否平整来综合评判，经鉴定合格的标本才能用于后续建库测序实验，具体为评估过程为：(1)rnaintegritynumber(rin，rna完整性数)数值大小即反应样品完整性情况，通过agilent2200仪器分析总rna的rin值来判定其完整性，其完整性标准为：rin≥7.0。数值越接近10表明样品完整性越高，反之rin值越小完整性越差。(2)28s和18s比值(28s/18s)是评估样品完整性的另一项指标，真核生物的比值大于等于1.5表示rna完整性较好，如比值逆转，则表明rna降解。(3)在2200峰图中查看基线是否平整，有无降解杂峰，28s与18s峰形及比值。
如表7所示rin值接近10表明样品完整性很高，28s/18s大于1.5表示rna完整性很好；如图8、9所示agilent2200检测峰图基线平整，28s与18s峰形良好，无降解杂峰。综上所述，总rna标本经评估鉴定完整性很好，可以用于后续建库测序实验。
表7agilent2200检测结果
2、逆转录pcr
mirna逆转录反应合成cdna使用all-in-onetmmirnaqrt-pcrdetectionkit试剂盒逆转录细胞总rna，具体步骤如下：(1)将模板rna置于冰上融解，5×pap/rtbuffer和ddh2o室温融解，解冻过程中轻柔振荡混匀。(2)轻柔混匀试剂盒中各种组分，短暂离心后置于冰上保存。(3)准备反转录反应液，将表8中试剂加入预冷的rnase-free反应管至终体积为25μl。(4)逆转录反应：动作轻柔地混匀已准备好的反应混合物，短暂离心后置于37℃孵育60分钟，接着置于85℃温育5分钟以终止逆转录反应，得到的cdna溶液可置于-20℃保存数周。
表8逆转录反应体系
3、实时荧光定量pcr
qpcr定量检测mirna使用all-in-onetmmirnaqrt-pcrdetectionkit试剂盒定量检测细胞mirna，具体步骤如下：(1)进行qpcr反应前先用灭菌蒸馏水稀释逆转录产物5～20倍，对于反应体系20μl的qpcr反应，使用2μl稀释的cdna。(2)解冻并轻柔混匀试剂盒中的all-in-onetmqpcrmix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。采用abi7500real-timefastpcr系统，选择使用50×roxreferencedye。(3)mirna检测引物购于广州复能基因公司，具体引物序列见表9(u6和let-7g-5p为内参基因)。(4)使用ddh2o将试剂盒中的50μm通用下游引物(universaladaptorpcrprimer)稀释至2μm。(5)按照表10内容，在冰上准备qpcr反应液。(6)轻柔混匀qpcr预混液并短暂离心，按照反应体系说明将预混液加入pcr反应管中，短暂离心确保预混反应液处于pcr反应管底部。(7)根据表11设置三步法pcr程序开始qpcr反应。(8)根据表12设置qpcr反应产物的熔解曲线。(8)所有样本均按照总rna提取的初始量进行归一化处理，使用u6或let-7g-5p作为内参使目的mirna的相对数量标准化，所有血清样本均通过外参mirneasyserum/plasmaspike-incontrol校准，以消除样品间因rna提取效率和反转效率不同而造成的微小偏差。采用abi7500real-timefastpcr系统实时检测目的mirna表达量的相对定量及反应质量，反应过程中的扩增曲线(见图10a)和熔解曲线(见图10b)如下图所示，并使用系统配套软件进行数据分析。
表9引物序列
表10qpcr反应体系
表11qpcr反应条件
表12熔解曲线设定条件
4、mirna表达差异分析
通过差异倍数(|log2(foldchange)|>1)和显著水平(p-value<0.05)两个水平挑选出mgc803和mgc803/ddp间的差异表达mirna，具体的显著差异表达的mirna统计如表13所示。通过火山图(volcanoplot，图11)统计差异mirna的整体分布情况，注：横坐标log2(foldchange)代表mirna在两个样本中的表达倍数变化；纵坐标-log10(p-value)代表mirna表达量变化的统计学显著程度；图中散点代表各个mirna，其中灰色圆点表示无显著性差异的mirna，红色圆点表示显著上调的差异mirna，绿色圆点表示显著下调的差异mirna；差异表达mirna的热图见图12。
表13显著差异表达的mirna统计
4.1mirna测序分析
1)建立文库及测序：(1)提取样品的总rna，先后连接3′端和5′端的接头，反转录成cdna(互补dna)，再进行pcr扩增。(2)随后切胶回收目的片段文库，质检合格的文库上机测序。(3)文库制备的具体实验流程如图13所示。
4.1.1测序信息分析
分析流程：(1)illuminahiseqtm2500测序所得的原始数据进行过滤，去掉reads两端的接头，去除片段长度<17nt的reads和低质量的reads，完成数据的初步过滤并获得高质量数据。(2)将cleanreads与参考基因组比对获得全基因组reads分布图谱，并对cleanreads进行ncrna分类注释。(3)对鉴定出来的mirna进行表达量计算、mirna表达聚类和样品间差异表达mirna分析。(4)对于差异显著的mirna，会进一步预测mirna的靶基因，并对靶基因进行go和kegg生物通路富集分析。(5)生物信息数据分析的具体流程如图14所示。
4.1.2mirna表达及差异分析
mirna表达差异分析使用edger软件，具体有：(1)聚类分析用于判断差异mirna在不同实验条件下的表达模式。(2)以不同实验条件下的差mirna的rpm值为表达水平，使用层次聚类分析能够将表达模式相近或相同的mirna聚集成类，并使用不同的颜色的区域代表不同的聚类分组信息，从而判断不同实验条件下调控模式或不同样品的聚类模式。(3)由于同类mirna可能共同参与
同一细胞通路或代谢过程，或是具有相似的功能，因此有助于筛选潜在的受同样调控或协同作用的mirna，因此有助于发掘已知mirna的未知功能或识别未知mirna的功能。
5、公共数据库筛选验证mirna
选择三个权威的关于mirna在胃癌中预后生存的公共数据库来筛选候选mirna。这三个公共数据库分别是：kaplan-meierplotter数据库(http://kmplot.com)、oncolnc数据库(http://www.oncolnc.org/)和oncomir数据库(http://www.oncomir.org/)，这三个公共数据库均能通过不同的mirna表达水平来预测人胃癌十年总生存期(overallsurvial，os)。
为了进一步分析这35个差异表达mirna作为潜在预后因素的作用，根据各个差异表达mirna的各种分位数表达，将患者样本分为两组。通过数据库中kaplan-meier生存图使用kaplan-meier生存数据进行了大队列分析，对这两个患者队列进行比较，并计算出具有95％置信区间和logrankp值的危险比(hr)(见表14)。我们观察到共有7个差异表达的mirna在10年总生存期方面存在统计学差异(p<0.05)，它们是mir-9-3p，mir-9-5p，mir-146a-5p，mir-370-3p，mir-433-3p，mir-519a-5p和mir-522-5p。它们的表达高低与胃癌患者十年生存预后密切相关，在kaplan-meierplotter中的作图具体为图15。由于在kaplan-meierplotter中mirna查询不能显示3p或5p，故只出现mir-9的生存曲线。同时我们发现：mir-9高表达(n＝146)的患者十年总体生存时间比mir-9低表达(n＝285)的患者短(hr＝1.56，log-rankp＝0.0047，图15a)；mir-146a低表达(n＝231)的患者十年总体生存时间比mir-146a高表达(n＝200)的患者短(hr＝0.70，log-rankp＝0.023，图15b)；mir-370高表达(n＝237)的患者十年总体生存时间比mir-370低表达(n＝194)的患者短(hr＝1.56，log-rankp＝0.0053，图15c)；mir-433高表达(n＝176)的患者十年总体生存时间比mir-433低表达(n＝255)的患者短(hr＝1.62，log-rankp＝0.0017，图15d)；mir-519a高表达(n＝119)的患者十年总体生存时间比mir-519a低表达(n＝312)的患者短(hr＝1.39，log-rankp＝0.036，图15e)；mir-522高表达(n＝118)的患者十年总体生存时间比mir-522低表达(n＝313)的患者短(hr＝1.38，log-rankp＝0.04，图15f)。这些结果表明，mir-146a-5p的低表达以及mir-9-3p，mir-9-5p，mir-370-3p，mir-433-3p，mir-519a-5p和mir-522-5p的高表达可能是耐药和生存期差的有效生物标志物。
6、收集病例资料及临床标本
1)入组标准
收集符合下列标准的74例胃癌新辅助化疗或姑息治疗前患者的血清标本及相关临床资料：(1)2015年1月1日至2018年1月1日期间接受新辅助化疗或姑息治疗胃癌患者化疗前血清样本；(2)血清标本严格按照标准操作流程采集和处理；(3)接受ddp为基础的化疗作为一线治疗；(4)接受过至少2周期新辅助化疗；(5)2～3个周期后，能通过腹盆部增强ct评价化疗疗效。(6)早晨取静脉全血5ml，离心机分离血清，取血清分装于去rna酶的试管内置于-80℃冰箱储藏备用。所有入组患者化疗原则严格按照美国临床肿瘤学会(asco)的指导方针执行。化疗方案为ddp联合卡培他滨(xp)方案：ddp60～80mg/m2，静脉滴注，第1天；卡培他滨1000～1250mg/m2，口服，一日2次，第1～14天，间歇7天；21天/周期。
表14人胃癌细胞mirna测序中的差异表达mirna及其生存分析
****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
2)临床参数及分组
所有入组患者新辅助化疗或姑息治疗开始前、新辅助化疗或姑息治疗2～3周期后分别进行疗效评价：血常规、肝肾功能、肿瘤标志物(afp、cea、ca19-9、ca724、ca125)、腹部b超、胸部平扫ct、腹盆部増强ct及胃重建、超声胃镜检查及穿刺病理检查。两名放射科医师根据实体瘤的疗效评价标准和choi原则进行独立测量肿瘤原发灶及淋巴结的直径和密度，综合评价肿瘤化疗反应。化疗反应效果分为完全缓解(cr)、部分缓解(pr)、疾病稳定(sd)和疾病进展(pd)。本研究将化疗反应敏感组定义为cr和pr患者，化疗反应耐药组定义为sd和pd患者。收集的病例资料包含的临床参数有：性别、年龄和ddp化疗反应。具体分组如下：(1)年龄按大于等于60岁和小于60岁分为两组。(2)ddp化疗反应按照治疗效果(cr，完全缓解；pr，部分缓解；sd，疾病稳定；pd，疾病进展)分为ddp敏感(cr和pr)和ddp耐药(sd和pd)两组。
3)伦理审批
本研究获得了首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会的审查批准，伦理审查批件号为2018-p2-045-01。我们的研究根据《赫尔辛基宣言》的原则进行，收集的所有病例资料及临床标本均经过每个患者书面的知情同意。
7、数据处理与统计学检验
通过外参mirneasyserum/plasmaspike-incontrol和两个内参u6和let-7g-5p，对每个血清或细胞样本中各个目的mirna的ct衰减值进行校正。通过rt-qpcr将血清mirna的表达水平分为高、低两组，取中位值作为截断值。体外和体内实验均采用学生非配对t检验进行统计学差异分析。采用mann-whitney检验分析患者的临床参数与mirna表达水平的相关性。roc曲线中的曲线下面积(auc)用于评估目的mirna预测的诊断准确性。建立逻辑回归方程评估多个生物标记联合后预测胃癌ddp化疗反应的准确性。当需要比较多个实验组和单个对照组之间的差异时采用单因素方差分析，对所有数据进行适当的事后多重比较检验(tukey’s多重比较检验)。所有数据均以均数±标准差表示。每个实验至少独立重复三次。定量数据采用spss23.0和graphpadprism7软件进行分析和绘制。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01和*p<0.05显示为差异有统计学意义。
7.1目的mirna通过人胃癌细胞标本验证
将与胃癌患者预后密切相关的7个mirna挑选出来，用rt-qpcr在人胃癌细胞标本mgc803和mgc803/ddp中进行验证(表15)。结果显示，在mgc803/ddp细胞中mir-146a-5p、mir-519a-5p和mir-522-5p表达水平显著下调，而mir-9-3p、mir-9-5p、mir-370-3p和mir-433-3p表达水平显著上调(图16)。其中，mir-519a-5p和mir-522-5p与小rna测序数据的结果趋势一致，但其他的相反。此外，由于mir-519a-5p和mir-522-5p具有相同的引物，因此用rt-qpcr验证时表现出相同的结果。
表15人胃癌细胞mirna测序中的7个筛选的差异表达mirna及其在rt-qpcr中验证
****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
7.2目的mirna通过人胃癌血清标本验证
对74例胃癌患者的血清样本进行rt-qpcr检测，以u6、let-7g-5p和cel-39-3p作为参考基因检测了34例化疗敏感(包括完全缓解和部分缓解)患者和40例化疗敏感(包括疾病稳定和疾病进展)患者的7个候选mirna的表达水平。以中位比值作为血清中7个候选mirna相对表达(foldchange＝0)的截止值，将患者分为低表达组和高表达组。这74例新辅助化疗或姑息治疗患者的临床参数结果见表16。结果见图17所示(注：a，mir-9-3p；b，mir-9-5p；c，mir-146a-5p；d，mir-433-3p)，表明：化疗耐药胃癌患者血清样本中mir-9-3p的表达水平明显升高，即67.5％(27/40)的mir-9-3p高表达样本表现出ddp耐药(p<0.0001，图17a)；化疗耐药胃癌患者血清样本中mir-9-5p的表达水平明显升高，即72.5％(29/40)的mir-9-5p高表达样本表现出ddp耐药(p<0.0001，图17b)；化疗耐药胃癌患者血清样本中mir-146a-5p的表达水平明显降低，即62.5％(25/40)的mir-146a-5p低表达样本表现出ddp耐药(p<0.0001，图17c)；化疗耐药胃癌患者血清样本中mir-433-3p的表达水平明显升高，即67.5％(27/40)的mir-433-3p高表达样本表现出ddp耐药(p<0.0001，图17d)。因此mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p可能成为预测ddp化疗反应潜在新的生物标志物，然而mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p的表达水平与性别和年龄无关。
表16筛选的mirna表达水平与74例胃癌新辅助化疗患者各项临床参数之间的相关性
****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
7.3目的mirna通过roc曲线预测ddp化疗反应
由于mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p可能成为ddp化疗反应潜在新的生物标志物，利用roc曲线预测其对ddp化疗反应的诊断效能。这4个单一候选mirna诊断鉴别胃癌ddp化疗耐药和敏感的曲线下面积(auc)、标准差(sd)、95％可信区间(ci)、p值、敏感性(se)和特异性(sp)如下(见表17和图18)：mir-9-3p(auc＝0.824，sd＝0.047，95％ci：0.731-0.916，p<0.0001，se70.6％，sp67.5％；图18a)；mir-9-5p(auc＝0.856，sd＝0.042，95％ci：0.773-0.939，p<0.0001，se76.5％，sp72.4％，图18b)；mir-146a-5p(auc＝0.799，sd＝0.052，95％ci：0.697-0.900，p<0.0001，se64.7％，sp62.5％，图18c)；mir-433-3p(auc＝0.838，sd＝0.045，95％ci：0.750-0.925，p<0.0001，se70.6％，sp67.5％，图18d)。
利用回归模型，这4个候选mirna中两两组合的联合模型诊断鉴别胃癌ddp化疗耐药和敏感的曲线下面积(auc)和风险评分因素公式(rsf)如下(见表17和图19)：mir-9-3p+mir-9-5p(auc＝0.889，图19a)，rsf＝0.731×mir-9-3p+0.586×mir-9-5p+0.192；mir-9-3p+mir-146a-5p(auc＝0.903，图19b)，rsf＝0.800×mir-9-3p-0.772×mir-146a-5p+0.392；mir-9-3p+mir-433-3p(auc＝0.865，图19c)，rsf＝0.574×mir-9-3p+0.684×mir-433-3p+0.173；mir-9-5p+mir-146a-5p(auc＝0.901，图19d)，rsf＝0.575×mir-9-5p-0.746×mir-146a-5p+0.345；mir-9-5p+mir-433-3p(auc＝0.898，图19e)，rsf＝0.551×mir-9-5p+0.847×mir-433-3p+0.264；mir-146a-5p+mir-433-3p(auc＝0.885，图19f)，rsf＝-0.637×mir-146a-5p+0.802×mir-433-3p+0.327。
利用回归模型，这4个候选mirna中多个组合的联合模型诊断鉴别胃癌ddp化疗耐药和敏感的曲线下面积(auc)和风险评分因素公式(rsf)如下(见表17和图20)：mir-9-3p+mir-9-5p+mir-146a-5p(auc＝0.930，图20a)，rsf＝0.690×mir-9-3p+0.515×mir-9-5p-0.738×mir-146a-5p+0.386；mir-9-3p+mir-9-5p+mir-433-3p(auc＝0.915，图20b)，rsf＝0.514×mir-9-3p+0.526×mir-9-5p+0.614×mir-433-3p+0.240；mir-9-3p+mir-146a-5p+mir-433-3p(auc＝0.918，图20c)，rsf＝0.646×mir-9-3p-0.700×mir-146a-5p+0.504×mir-433-3p+0.388；mir-9-5p+mir-146a-5p+mir-433-5p(auc＝0.926，图20d)，rsf＝0.521×mir-9-5p-0.650×mir-146a-5p+0.655×mir-433-3p+0.376；mir-9-3p+mir-9-5p+mir-146a-5p+mir-433-3p(auc＝0.937，图20e)，rsf＝0.540×mir-9-3p+0.480×mir-9-5p-0.681×mir-146a-5p+0.393×mir-433-3p+0.398。
表17候选mirna及其联合模型预测其对顺铂化疗反应的诊断效能
****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
7.4roc曲线比较
由于单一mir-9-5p在区分胃癌ddp化疗反应耐药组和敏感组方面auc值最大，诊断效能最高，故以mir-9-5p为参照，探讨其余3个mirna以及包含mir-9-5p的联合模型在诊断效能方面与mir-9-5p相比有无差异。利用medcalc软件显示不同roc曲线的数据，然后将所有roc曲线两两比较，结果显示为：区域差异(dba)、标准误差(se)、差异95％置信区间(ci)和p值(见表18)。结果表明：与mir-9-5p相比有差异的mirna联合模型有mir-9-5p+mir-9-3p+mir-146a-5p(p＝0.026，图21a)、mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p(p＝0.045，图20b)、mir-9-5p+mir-146a-5p+mir-433-3p(p＝0.034，图21c)和mir-9-5p+mir-9-3p+mir-146a-5p+mir-433-3p(p＝0.016，图21d)。而其他的mirna联合模型与mir-9-5p相比没有统计学差异(p﹥0.05)。
表18roc曲线两两比较结果
7.5候选的mirna在公共数据库中验证
为了确定单一mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p或mir-433-3p作为潜在预后因素的作用，根据oncolnc数据库和oncomir数据库，使用kaplan-meier生存数据进行大队列分析(见表19)。结果如图22所示(注：a，mir-9-3p在oncolnc数据库；b，mir-9-3p在oncomir数据库；c，mir-9-5p在oncolnc数据库；d，mir-9-5p在oncomir数据库；e，mir-433-3p在oncolnc数据库；f，mir-433-3p在oncomir数据库)，分析如下：分别在oncolnc数据库(p＝0.00836，图22a)和oncomir数据库(p＝0.06643，图22b)中，mir-9-3p高表达的胃癌患者总体生存时间更短；分别在oncolnc数据库(p＝0.00181，图22c)和oncomir数据库(p＝0.0044，图22d)中，mir-9-5p高表达的胃癌患者总体生存时间均更短；分别在oncolnc数据库(p＝0.0311，图22e)和oncomir数据库(p＝0.05651，图22f)中，mir-433-3p高表达的胃癌患者总体生存时间均更短。以上结果表明：mir-9-3p、mir-9-5p或mir-433-3p的高表达水平可作为耐药和生存不良的有效生物标志物，尤其是mir-9-5p。
为了确定候选mirna的联合模型作为潜在预后因素的作用，根据oncomir数据库和kaplan-meierplotter数据库，使用kaplan-meier生存数据进行大队列分析(见表19)。结果见图23所示，分析如下：在oncomir数据库(p＝0.003421，图23a)中，mir-9-5p+mir-9-3p的联合模型高表达的胃癌患者总体生存时间均更短；在oncomir数据库(p＝0.01428，图23b)中，mir-9-5p+mir-433-3p的联合模型高表达的胃癌患者总体生存时间均更短；在oncomir数据库(p＝0.008066，图23c)中，mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p的联合模型高表达的胃癌患者总体生存时间均更短；在kaplan-meierplotter数据库(p＝0.0047，图23d)中，mir-9+mir-433的联合模型高表达的胃癌患者总体生存时间均更短。以上结果表明mir-9-5p+mir-9-3p、mir-9-5p+mir-433-3p、mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p和mir-9+mir-433的联合模型的高表达水平可作为一个确切的耐药和生存不良的有效生物标志物，尤其是mir-9-5p+mir-9-3p+mir-433-3p。
表19候选的mirna在公共数据库中验证
(3)对胃癌细胞小rna高通量测序发现了与胃癌顺铂耐药相关的35个差异表达的mirna，其中11个表达上调，24个表达下调。(4)公共数据库生存分析发现mir-9-3p，mir-9-5p，mir-146a-5p，mir-370-3p，mir-433-3p，mir-519a-5p和mir-522-5p在胃癌中与总体生存有显著的相关性，可作为预测预后的生物标志物。(5)血清mir-9-3p、mir-9-5p、mir-146a-5p和mir-433-3p可作为区分胃癌顺铂耐药患者和胃癌顺铂敏感患者的生物标志物。(6)mir-9-3p+mir-9-5p+mir-433-3p的联合模型和mir-9-5p均可作为确切的预测耐药和生存不良的有效生物标志物，在细胞、血清和公共数据库中均能良好区分胃癌顺铂化疗反应耐药组和敏感组且诊断效能最高。
本发明实施例发现并鉴定mir-9-3p+mir-9-5p+mir-433-3p的联合模型和mir-9-5p均可作为确切的预测胃癌顺铂耐药和生存不良的有效生物标志物，从而为病人就医提供更便利的条件。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。