基于鲎试剂（LAL／TAL）和非动物重组C因子（rFC）的内毒素检测：它们的特征

　　Glenn A. Gauvry, Thomas Uhlig, and Karolina Heed

　　G. A. Gauvry (*)：Ecological Research & Development Group Inc., Dover, DE, USA e-mail: erdg@horseshoecrab.org

　　T. Uhlig：Hyglos GmbH – a bioMérieux Company, Bernried, Germany e-mail: thomas.uhlig@biomerieux.com

　　K. Heed：TRIGA-S Scientific Solutions, Habach, Germany e-mail: karolina.heed@triga-s.de

　　?作者，根据斯Springer Nature Switzerland 2022 J.T.Tanacredi等人（编辑）的独家许可，《国际鲎保护和研究工作》：2007-2020年，https://doi.org/10.1007/978-3-030-82315-3_21

　　人体免疫系统能够抵御各种可能对人体有害的生物体。甚至其相对原始的先天免疫系统也可以检测许多微生物或病原体相关分子模式（MAMPs/PAMPs），而无需事先暴露，并可以启动适当的免疫反应，包括适应性免疫系统的招募（Mogensen 2009）。在这些MAMP中，细菌内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，是最有效的免疫兴奋剂之一（Raetz和Whitfield，2002）。即使是很小的剂量也会引起广泛的免疫反应，从发热——导致内毒素被归类为“热原”（发热诱导物质）——到进入血液循环的器官功能障碍和脓毒性休克（Wolff 1973）。由于对这种潜在污染物的严重生理反应和大量的革兰氏阴性细菌（Gorbet和Sefton，2005），胃肠外给药的药物，即注射到体内的药物，以及暴露于血液循环的医疗设备，需要测试内毒素（美国药典USP 2016a、欧洲药典Ph.Eur.2016a和日本药典JP 2016）。仅允许被认为无害的浓度，最常见的是每千克体重5个内毒素单位（EU）（USP 2016a，欧洲药典2016a和JP 2016）。

　　第一种测试内毒素和其他热原的授权方法是兔热原试验（RPT），建立于20世纪20年代（Seibert 1923），并于1942年引入美国药典（USP 1942）。作为该程序的一部分，将研究中的药物注射到几只兔子的耳静脉中。如果产品含有高水平的内毒素，则兔子的体温升高超过预定阈值。因此，所述产品将被拒收和处置。然而，该方法只是定性的，因为确切的热原浓度仍然未知。

　　20世纪50年代， Frederik Bang和Jack Levin发现，在暴露于革兰氏阴性细菌的成分后，美国鲎（Limulus polyphemus）的血淋巴凝结，后来被发现为内毒素（Bang 1953；Levin 1964）。具体而言，鲎的免疫细胞，称为阿米巴细胞，分泌凝固剂。这一发现对鲎试剂（LAL）细菌内毒素检查（BET）的发展具有决定性意义。在1970年代中期，鲎开始被采集用于生产LAL的血淋巴。在几年内，这种动物提取物被制药和医疗器械行业用于全球范围内，用于检测人和动物的肠外药物和植入式医疗器械中是否存在细菌内毒素。事实证明，LAL测试比它取代的RPT更简单、更可靠、更具体、更便宜、定量和更人性化（Cooper等人，1971年）。到20世纪70年代末，亚洲鲎（Tachypleus）物种开始为同样的目的收获，即生产等效鲎试剂（TAL）（厦门生物技术有限公司，2019年）。

　　在广泛使用LAL/TAL的同时，出现了重组脱氧核糖核酸（DNA）技术，即创建自然界中未发现的DNA序列（Cohen 1973；Hughes 2001；Cohen 2013）。这允许在生物体之间有意识地转移基因，并将其表达为易于培养的生物体中的蛋白质，如细菌、酵母或动物细胞（Brondyk 2009）。因此，从胰岛素（Goeddel等人，1979年）开始生产各种各样的生物产品，并扩展到许多不同的蛋白质和其他生物分子。

　　虽然上述生物分子可以加工成药品等产品，但重组DNA技术也允许对其进行彻底分析，极大地促进了生物化学研究。作为这一发展的一部分，在20世纪80年代末和90年代初探索和揭示了LAL/TAL的分子机制（Nakamura等人，1986年；Muta等人，1991年；Iwanaga和Lee，2005年）。基于这一知识，溶解产物的内毒素检测蛋白因子C在鲎以外的生物体中成功合成，即酵母，昆虫和哺乳动物细胞（Roopashree等人1996年、1997年、Ding和Ho 2003年、Dig等人1997年、Pui等人1997年）。由于这种重组鲎因子C（rFC）实现了与其天然等效物相同的功能，它被纳入了与LAL/TAL测试等效的细菌内毒素测试，即2003年的第一次rFC测试（Ding和Ho 2001，2003，2010，Lonza 2018）。

　　LAL/TAL包含由阿米巴细胞产生和分泌的多种蛋白质。许多功能上值得注意的包括所谓的酶原或酶原。这些是在酶促活性之前需要激活的蛋白质。这里，这种活性反映在特定位点的其他蛋白质的切割，即其他酶原和其他功能性蛋白质的活化。

　　暴露于内毒素后，酶原因子C改变其结构构象并切除自身一部分。因此，活性因子C切割因子B，其将反过来切割促凝血酶，其活性形式的凝血酶将凝血原截短成凝血素。最终，几个凝血素分子彼此交联成固体网络：血淋巴或溶解产物凝固（图1a）。在酶级联的每个步骤中，反应被扩增。因此，微量的内毒素可以引起强烈的反应，反映在LAL/TAL的最重要敏感性上。另一方面，另外存在的酶原因子G可以被β-葡聚糖活化（Mikami等人1982；Roslansky和Novitsky 1991；Muta等人1995），例如来自由纤维素制成的真菌或水过滤器（Pearson等人1984）。因子G切割相当于因子B的促凝血酶。此外，LAL/TAL已被证明对凝血酶，凝血活酶，核酸（Elin和Wolff 1973），肽聚糖、来自革兰氏阳性细菌的外毒素等物质（Wildfeuer等人1974；Baek等人1985；Brunson和Watson 1976）和二硫苏糖醇（DTT；Platica等人1978）具有反应性。因此，LAL/TAL也可以在没有内毒素的情况下反应。

　　在其最简单和最经典的形式，即所谓的凝胶凝块测试中，LAL/TAL只需在玻璃瓶内进行样品测试。内毒素的量等于或大于溶解产物的灵敏度，将导致在37°C下1小时内凝固，倒置时可见混浊固体凝块，停留在小瓶底部。图1（a）LAL/TAL和（b）rFC中的酶生物化学。*表示活化酶。颜色和浊度形成可使用吸光度读取器测量，荧光显影可使用荧光读取器测量。

　　在凝固过程中，浊度逐渐增加，这一过程可以通过仪器读取吸光度来测量。内毒素越多，浊度上升越快。由于可以就添加LAL/TAL后的浊度发展对样品和定义的标准内毒素量进行比较，因此可以推断样品中的内毒素量（Urbascheck等人，1987年）。这种定量BET称为浊度法LAL/TAL测试。为了提高吸光度，可以在LAL/TAL中添加凝血酶的合成显色底物，这是所谓的显色测试（Berzofsky 1994）的测试原理，这是第二种定量BET。为了便于处理和测量以及节省溶解产物和样品，两种定量测试形式通常在微量滴定板中进行。这些是塑料容器，通常配备有96个孔，即在功能上等同于微型试管的小的独立反应空间。

　　与LAL/TAL相比，rFC测定仅依赖于因子C的酶功能。合成的荧光产生分子代替因子B在被内毒素激活后通过rFC处理（图1b）。根据显色LAL/TAL试验，将该rFC试剂添加微量滴定板内的样品和内毒素控制标准（CSE）中。通过相应仪器测量的荧光强度的增加与内毒素的量成比例。虽然缺少LAL/TAL的响应放大酶，但甚至可以测量人眼不可见的荧光。因此，这些荧光rFC检测对内毒素的敏感性与LAL/TAL检测相当。自2015年以来，因子C、因子B和促凝血酶的整个系列都已重组生产，并整合到市售的显色分析中（Mizumura等人，2017年）。由于缺乏因子G，所有这些基于rFC的分析都不会对β-葡聚糖产生反应（Bolden 2019）。因此，在测试这些多糖和潜在的其他LAR反应物质（见上文）时，它们不会显示假阳性信号，即不来自内毒素的信号。

　　比较不同形式的细菌内毒素检查，即LAL/TAL和rFC测试（Williams 2007），你不会发现“一刀切”，这意味着稳健性、速度、灵敏度、易操作性和低价格的完美结合。凝胶LAL/TAL测试非常简单，价格低廉，只需要适度的设备，即稀释和加热。此外，与样品相比，大量的溶解产物使测试具有相当高的抗干扰性（Hughes等人，2015）。然而，多种物质通常会干扰BET中的酶（Twohy等人，1984）。凝胶试验所需的溶解产物量相对较高，这意味着更多鲎需要在一定数量的凝胶试验中抽血。简单的缺点是，孵育时间需要手动控制，而凝胶的识别并不完全明确，尤其是机械冲击会阻碍凝结。此外，处理和结果解释的自动化几乎不可行。考虑到越来越严格的数据完整性法规，即努力防止数据操纵以保证患者安全，这些方面似乎特别不利（美国食品和药物管理局FDA 2018）。因此，凝胶测试主要由低预算和长期产品的制造商使用，其内毒素控制的改变将需要相当大的努力。虽然凝胶测试最多是定性或半定量的，它的结果是内毒素浓度范围（“之间”，“大于”，“低于”），所有其他测试形式产生准确的数值，因此被定义为定量BET程序。

　　浊度测试是其最简单的变体，仅使用带有少量稳定剂的溶解产物，就像凝胶凝块测试一样。因此，它们相对便宜，特别适用于非挑战性样品，如纯化水，其可占所有细菌内毒素检测的70%。然而，由于浊度升高导致的吸光度增加滞后于相应底物存在下的颜色形成，因此显色测试往往比浊度测试更稳健。在这方面，rFC测试可与显色LAL/TAL测试相媲美，但在很大程度上不受样品颜色的影响。

　　以冻干固体形式提供LAL/TAL，并添加合适的溶液以重组和制备用于测试的试剂。复溶的LAL/TAL应立即使用，因为它即使未添加内毒素也会开始凝固。可能类似于人类血液（Hurley等人，2015），鲎血淋巴可能含有导致这种现象的低水平的固有内毒素。另一方面，rFC试剂以液体形式提供，并在测试的试剂制备（即rFC、其荧光底物和其活性促进缓冲液的混合）后保持钝性数小时。这种灵活性增强了测试的鲁棒性并促进了自动化，因为试剂可以使用移液机器提供，而对其动作速度的影响较小。因此，可以减少错误率和人工劳动。

　　特定制造商的每种测试形式都显示了对一系列物质干扰的独特容忍度或敏感性。更详细地说，虽然一种BET试剂可以在测试大量干扰另一种试剂的特定化合物时产生准确的结果，但在分析另一种混合物的内毒素时，这种关系也可能颠倒（McCullough和WeidnerLoeven 1992）。同样，几种试剂可以从单个样品系统地返回不同的结果（Kikuchi等人，2017年，2018年）。由于阿米巴细胞提取物和rFC制剂预计不会在制造商之间显示出巨大的质量差异（前者来自大量鲎，后者是结构高度相似的蛋白质，独立于提供因子C基因的物种）大多数这些特性可能与酶试剂和共同提供的对照标准内毒素的稳定剂选择有关（肠外药物协会，2019）。

　　自2003年首次商业化以来，rFC面临着一场艰苦的战斗，以获得LAL/TAL的监管和客户认可，独立于制造商和测试形式。当LAL作为细菌内毒素检测的替代试剂出现时，其优于兔热原检测（RPT）的优势显而易见（联邦公报，1977年）。LAL对主要发现的热原内毒素和β-葡聚糖具有特异性，这一点仅在后来才披露。在这方面，LAL试验更为敏感（van Noordwijk和de Jong，1976年；Wachtel和Tsuji，1977年；Mascoli和Weary，1979年），引入内毒素标准后，也更为定量（Rudbach等人，1976年）。

　　一般来说，LAL测试的便利性是惊人的，因为它可以简单地从试剂供应商处购买，而兔子通常需要在室内繁殖和饲养，导致相当大的维护费用。同样，测试程序从几个小时缩短到一个小时，从而获得更快的结果。因此，LAL测试大大节省了成本，并能够测试半衰期短、需要快速结果的放射性药物（Hartung，2015；Liebsch，1995）。同时，生物变异性的影响降低，因为从大量鲎中得到的溶解产物产生的结果比典型的RPT更可重复，RPT最多只能涉及8只兔子。在这种情况下，LAL试验很快获得了FDA的批准（1973年《联邦公报》），并作为药典方法被纳入USP第XX章＜85>（USP 1980）。欧洲药典（Ph.Eur.）和日本药典（JP）分别遵循其一致的章节2.6.14和4.01。

　　rFC分析引入后，通常在特异性、重现性和动物保护方面有所改进。rFC不被LAL活性β-葡聚糖激活（见上文），提供更特异的细菌内毒素检测。因为rFC总是具有非常相同的一级结构（蛋白质的氨基酸序列），由基因相同的细胞合成，并在严格控制的生化环境中纯化，生物变异性进一步降低（McKenzie等人，2011年）。相比之下，LAL来自基因不同的鲎种群，这些种群还可能受到季节性环境影响和不同健康状态的影响（Jorgensen和Smith，1973）。特别是与广泛的药物样品中发现的不同化学环境有关，因此，与动物提取物LAL的情况相比，rFC的酶活性更容易重现。因此，可以更可靠地应用为特定样品建立的制备程序。

　　rFC有助于减轻全球鲎种群的压力，这些鲎被收获用于制造LAL/TAL。即使因各自最佳实践处理而导致的美洲鲎（Limulus polyphemus）死亡率相对较低（ASMF 2018），任何能够避免取血的鲎都有较高的存活和繁殖机会。在单个30L生产运行中（图2），产生的rFC量相当于6000只鲎的平均取血量，不包括与LAL生产相关的收集、运输、取血、饲养和释放。图2 保持细胞培养的反应器，用于制造重组蛋白，如因子C

　　尽管环境保护，特别是野生动物保护在过去几十年中取得了势头，但制造业往往只是在监管机构、公众和政府激励的压力下才促成了这一趋势。因此，出于道德原因采用rFC主要是由诸如礼来（Eli Lilly）的Jay Bolden等敬业人士的努力，他于2013年开始带领公司摆脱传统的TAL/LAL BET，走向非动物的rFC。礼来和公司首席执行官David A. Ricks在提交给联合国全球契约（UNGC；礼来公司2018）的2018年进度报告中表示，到2020年，公司90%的内毒素检测将通过合成化合物进行。

　　自2003年引入以来，FDA花了9年时间才明确提及rFC测定作为BET的可接受试剂，随后在2016年《欧洲药典》（FDA 2012；欧洲药典2016b）。其制造商Lonza（Loverock等人，2009年）对第一次rFC分析进行了初步验证，制造商Hyglos（现为bioMérieux，Grallert等人，2011年）引入了rFC分析，为rFC用户提供了关键的验证支持和在试剂供应商之间切换的机会。因此，它们无疑有助于推动获得监管机构认可的第一步。尽管如此，至少在2021《欧洲药典》第2.6.32章使用重组因子C进行细菌内毒素检测生效（EDQM 2019）之前，rFC检测被正式规定为替代BET方法。这可能会促使本章被纳入USP和JP。

　　如果用户当前决定使用rFC分析来发布药品或医疗器械，他们需要遵循美国药典第<1225>章《药典程序验证》（USP 2016b）的验证，根据FDA（图3，FDA 2012）。也就是说，他们通过证明可接受的准确度、精密度、特异性、检测限、定量限、线性、范围和稳健性，表明该方法在实验室中按预期工作。虽然在干扰因素测试中为每种样品单独建立了特异性，但其他方面可以在一周内进行分析（Williams 2018）。使用rFC分析和几种LAL测试之间的比较数据，例如来自制造商发起的方法初步验证，用户甚至可以省略FDA要求的直接测试比较。尽管rFC制造商因此试图简化验证，但这仍然是一个障碍，不适用于药典LAL/TAL的使用；一些准备测试和干扰因素测试（的代价）足以建立常规LAL/TAL测试。鉴于高财务压力和监管审查，许多医疗保健公司因此一直选择LAL/TAL而非rFC。图3 使用LAL/TAL或rFC在药物或医疗器械中建立细菌内毒素检测的过程比较。彩色框表示需要在BET用户的场所内进行的活动，白色框表示用作参考的文档

　　就与LAL/TAL检测的等效性而言，rFC检测面临着特殊的挑战。它们具有同样的决定因子C的生物化学特征，处理与定量LAL测试非常相似，常规测试的监管要求相同（USP 2016a，欧洲药典2016a和JP 2016）。最终，即使是内毒素或国际单位（EU/IU）的读数也是相同的。虽然这些匹配在实验室实践中缓解了从LAL/TAL到rFC的转变，但LAL制造商已利用它们来比较这些试剂的结果，并质疑rFC的有效性（Dubczak 2018），特别是因为用户很少在含有内毒素的样品上比较不同的LAL/TA试剂。

　　如前所述，每种试剂都具有独特的酶组成、稳定剂、标准内毒素和其他实验室设备，如微量滴定板或玻璃瓶。因此，每个BET都会返回单个值，即每个LAL/TAL和rFC测试都会产生特定值（Wachtel和Tsuji 1977；Kikuchi等人，2017年和2018年）。至少对于独立于形式的所有LAL/TAL测试，它们被认为是真实内毒素浓度的可接受近似值。与此分类接受相反，任何rFC测定与任何LAL/TAL测试的差异已被一些LAL制造商和专用LAL用户强调为不可接受，特别是如果rFC测定返回较低的值（Bolden等人，2015；Dubczak，2018）。同样，后者也被发现，反之亦然（Kikuchi等人，2017年、2018年；Williams 2019年）。

　　理想情况下，在对异常值具有稳健性的大型多中心数据集上研究等价性。最值得注意的是，日本药品和医疗器械管理局（PMDA）在一项广泛的研究中比较了三种显色LAL测试和三种基于rFC的分析，该研究涉及多达5个实验室，并从18种不同的细菌菌株中提取纯化的内毒素样品、5种菌株的粗内毒素制剂和6种环境内毒素样品（Kikuchi等人，2017年，2018年）。他们得出结论，LAL和rFC在所有研究样品中检测到内毒素，没有显示出任何明确的原理特异性差异，因此可以认为是等效的（图4）。

　　图4 合作研究的数据比较，以比较（a）来自定义的细菌菌株的纯化脂多糖和（b）来自定义细菌菌株的粗纯化内毒素和来自环境水样的天然内毒素的动力学显色LAL试验和基于rFC的测定。（摘自Kikuchi等人，2017年）

　　尽管PMDA（Kikuchi等人，2017年、2018年）、制药商（Chen和Mozier，2013年；Bolden，2019年）、学术机构和rFC制造商（Loverock等人，2009年）以及合同研究组织进行了研究，但对rFC分析的常见批评集中在表面上缺乏证明与LAL测试等效的数据。为了进行比较，引用了Baxter-Travenol的一项研究，其中包括数千项平行的RPT和LAL测试（Mascoli等人，1979；Dubczak，2018）。同样，当时只有37个LAL测试和4个RPT返回阳性结果。该研究确实表明，内毒素是最常见的热原，没有内毒素可能等同于没有热原。然而，未研究两种测试对不同细菌菌株内毒素的等效性（见上文PMDA研究）。此外，尽管进行了其他LAL-RPT比较研究（Wachtel和Tsuji 1977），但尚不清楚该数据是否可以从凝胶法外推到其他LAL测试形式。最后，作者的公正性可能会受到质疑，因为Baxter-Travenol生产自己的LAL，因此在推广LAL方面具有重要的商业利益。

　　另一个反对rFC的论点是，自1977年以来，每种LAL试剂的生产都获得了FDA许可证（联邦公报，1977年）。当第一个rFC分析被商业化时，制造商提交了一份指定请求，以了解负责授予此类上市前批准的FDA中心。由于rFC是人工合成的，既不是一种具有固有变异性的动物产品，也不是用于诊断人类或动物疾病的产品，FDA得出结论，不需要上市前批准（Berzofsky 2004）。在这一点上，应注意，FDA许可证不是LAL测试质量及其检测内毒素能力的一般指标；它只是为了规范和控制LAL的制造过程（Burgenson 2019）。尽管rFC制造商缺乏各自的FDA监督，但他们仍然遵守严格的指南，如良好生产规范（GMP）和国际标准化组织（ISO）要求（Burgenson 2019）。因此，必须披露影响分析结果的试剂变化，rFC用户可以审核这些制造商，从而鼓励遵守严格的质量体系。

　　由于试剂来源不同，LAL/TAL和rFC的制造工艺实际上有很大差异（Jorgensen和Smith，1973；Armstrong和Conrad，2008）。对于LAL/TAL，血淋巴取自鲎心脏，合并并补充抗凝剂。通过离心，阿米巴细胞与其余血淋巴分离。加入水以诱导细胞破裂（渗透压），从而释放与试剂相关的酶。另一次离心将其从细胞碎片中剥离，在加入稳定物质后，将酶冷冻干燥以产生固体和稳定的LAL/TAL。相反，rFC是在将酶分泌到其生长培养基中的细胞中产生的，随后通过离心或过滤去除。为了纯化rFC，介质流经选择性结合rFC或其杂质的色谱树脂。与LAL/TAL类似，添加了稳定物质，以保证多年的保质期。另一方面，冷冻干燥（冻干）是不必要的，因为在不存在内毒素的情况下，rFC不会显示LAL/TAL之前提到的非特异性活性。

　　分布在美国大西洋沿岸和墨西哥湾东南部以及整个南亚和东南亚沿海地区（图5），世界上现存的四种鲎在其整个产卵范围内都表现出遗传变异，并面临局部灭绝的风险，这主要是由于它们居住的国家之间的人为活动不同。主要的压力源是由于填海、基础设施开发、海岸线防护、侵蚀和污染、副渔获物和不可持续的诱饵捕捞、人类消费、由鲎和鲎类动物血淋巴产生的阿米巴细胞溶解物以及几丁质、肥料，以及中药生产（Smith等人，2017年；Akbar等人，2018年；IUCN 2019年）。四种鲎的未来生存将最终取决于产卵和育儿栖息地的保护，以及克服社会、文化和企业对不可持续的捕捞做法的冷漠。鉴于鲎赖以繁殖和生长的海滩和近岸地区的人口密度不断增加，这个前景很具有挑战性（Gauvry，2015年）。图5 圆尾鲎Carcinoscorpius rotundicauda（绿色）、中国鲎Tachypleus tridentatus（橙色）、巨鲎Tachypleus gigas（蓝色）和美洲鲎Limulus polyphemus（红色）的地理分布范围

　　在美国，从19世纪末到20世纪初，美国鲎以不可持续的方式收获用作肥料和牲畜饲料，到20世纪40年代耗尽了资源（ASMFC 1998）。随着肥料和牲畜饲料用户群体从鲎转向替代品和合成产品，种群开始恢复。到20世纪60年代，所有鲎的商业捕捞活动都已停止，到1970年代末，鲎的数量已大幅恢复（Shuster 1996；ASMFC 1998）。虽然鲎在医学研究中的应用始于20世纪初（Shuster 1962），但直到LAL的商业化和1970年代中期这个新的用户群体的出现，鲎才再次大量收获。20世纪90年代中期，又出现了另一个商业用户群体，他们开始在美洲鳗鲡（Angulla rostrata）和青螺（Busycon spp.）渔业中采集鲎资源作为诱饵。

　　虽然大部分为LAL收获的美国鲎返回大海，死亡率相对较低，为15%（ASMFC 2018），但这两个用户群体的无管制捕捞再次导致种群数量下降（ASMFC 2018）。1997年，特拉华州和新泽西州以及观鸟组织、鲎倡导团体和科学界的大力支持，敦促拥有广泛渔业管理权的美国联邦政府机构大西洋州海洋渔业委员会，制定鲎渔业管理计划（FMP），以监测和管理全海岸的美国鲎捕捞（ASMFC 1997）。

　　鲎FMP的目的是确保其整个产卵范围内的可持续种群，以确保鲎资源在沿海生态系统生态、候鸟和其他依赖性野生动物的食物资源以及渔业和非渔业公众中的持续作用（ASMFC 2018）。2001年3月，为了保护大西洋中部地区美国鲎数量最多的重要海洋栖息地，国家海洋渔业局（NMFS）根据ASMFC的建议，建立了Carl N. Shuster，Jr. 鲎保护区。它禁止在特拉华湾河口30海里半径范围内的联邦水域捕捞和转移鲎（ASMFC 2001）。

　　目前，美国鲎物种美洲鲎（Limulus polyphemus）在其整个美国范围内仅略微稳定，东北地区（缅因州至罗得岛）的数量有所增加，纽约地区（康涅狄格州至新泽西州）的数量仍在下降，特拉华州湾地区（新泽西州至弗吉尼亚州）保持稳定，东南部地区（北卡罗来纳州至佛罗里达州；ASMFC 2019）的数量越来越多。

　　墨西哥鲎物种的种群在最南端的分布尚不清楚，不属于ASMFC的管辖范围。没有足够的数据证实种群稳定性（Zaldivar-Rae等人，2009年；Smith等人，2017年）。虽然根据墨西哥法律，鲎的收获、销售和购买是非法的，但对该物种没有积极的管理。因此，章鱼渔业中越来越多的非法捕捞鲎作为诱饵，并且偏爱与传统漂流捕鱼技术最适合的雄性（Smith等人，2017年）。

　　虽然在美洲鳗鲡（Angulla rostrata）和青螺（Busycon spp.）渔业中用作诱饵的美国鲎的监管捕捞量继续从1999年的260万只高水平下降到2004年至2017年的平均753000只（ASMFC 2019），下降了245%，LAL生产的收获量继续增加，从1989年的130000只鲎（FDA 1998；ASMFC 1998）增加到2004年至2017年的平均485197只（ASMFC 2019），增加了273%。尽管最近的一项研究表明，目前的LAL产量收获水平不会对美国鲎种群产生不利影响（Smith和Newhard，2019；ASMFC，2019），但不确定预计到2024年将翻一番的LAL生产（图6）（锡安市场研究，2019）是否能够继续增加，以满足其预期增长，随着亚洲TAL市场因不可持续的捕捞方式而开始下滑，承担亚洲TAL的市场要少得多。为了不超过其当前的捕捞量，一些LAL生产商与美国鳗鱼（Angulla rostrata）和青螺（Busycon spp.）渔业合作，在将其用作诱饵之前将其放血（ASMF 2018）。随着这两个用户群体寻求在不断增长的市场中共享有限的资源以实现可持续性管理，这种做法可能会扩大。只要美国鲎的收获能够得到可持续性管理，并且可以获得可行的非动物BET，美国鳗鱼和青螺养殖场就不太可能被要求减少其收获，以利于生物医学用途。虽然LAL生产者和自然资源保护主义者经常被视为这场辩论中的反派，他们来自不同的社会经济阶层，但重要的是要记住，商业捕鱼是美国最古老的职业之一，并帮助提供了发动美国革命的财政手段，从而为传承活动提供了持久的地位（Kurlansky 1997）。图6 按类型划分的热原和内毒素检测预测量（百万美元）。（摘自2019年锡安市场研究）

　　在全世界四种鲎物种中的三种（中国鲎Tachypleus tridentatus、巨鲎Tachypleus gigas、圆尾鲎Carcinoscorpius rotundicauda）的发源地南亚和东南亚，鲎的保护倡导在几个世纪以来主要为人类消费而开发这种海洋生物，以及自1970年代末以来生产细菌内毒素测试TAL后才开始扎根。当人类的考虑掩盖了环境问题时，无知和冷漠往往是物种衰退的核心。2019年，国际自然保护联盟鲎专家组与南亚和东南亚的成员合作，发布了国际自然保护组织对中国鲎（Tachypleus tridentatus）的红色名单评估。评估将该物种划分为整个产卵范围内的濒危物种，并面临局部灭绝的风险（IUCN 2019）。据信，一旦对另外两个亚洲鲎物种的红色名单评估完成，它们也将被列入危险名单。尽管整个亚洲有一种不断增长的趋势，即在人口减少的地区繁殖和释放鲎幼虫，目前还没有矩阵来评估这些方案的有效性。

　　许多南亚和东南亚国家都食用鲎，中国是TAL的最大消费者和主要供应商（Akbar等人，2018年；IUCN 2019年；锡安市场研究2019年）。这些用户群体的副产品为二级市场提供甲壳素、肥料和中药（Novitsky 2017，pers.comm）。整个南亚和东南亚的鲎消费受贫困、生计和社会地位的驱动，与广泛的历史和文化趋势交织在一起，与经济增长和社会分层有关（Fabinyi 2011）。如果不在商品贸易的消费端采取行动，无论是通过提高公众认识的运动和/或超出市场生存能力的成本，再加上政府干预，鲎贸易不太可能减少。尽管有一些迹象表明，中国人类对野生动物的消费正在下降，但高收入和教育背景的消费者对野生动物消费的比率更高（张和尹，2014年），而且没有迹象表明中国鲎的消费有所下降（Fu等人，2019年）。

　　一些红树林种（中国鲎Carcinoscorpius rotundicauda）含有河豚毒素，如果食用会致命（Kanchanapongkul，2008；Suleiman等人，2017）。因此，供人类食用的该物种的收获仍然是地方性的。它体积小，难以大量收获，在制备阿米巴细胞溶解物中具有价值。因此，该物种面临的最大威胁和其数量减少的主要原因是整个范围内栖息地的丧失（Akbar等人，2018年）。南亚、东南亚和亚太地区约占世界红树林生态系统的46%，包括生物多样性最强的红树林。另一方面，该地区的红树林损失率和替代土地用途的毁林率也是全球最高的。

　　目前，只有少数南亚和东南亚国家制定了保护其鲎资源及其栖息地的法律，执行法律的国家更少，这鼓励了大量非法贸易（Akbar等人，2018年；IUCN，2019年）。世界上四种鲎不受濒危物种国际贸易公约（CITES）的保护。因此，从禁止和/或限制鲎出口的国家进口马蹄蟹的国家之间的合作监管和执行不力（Akbar等人，2018；IUCN，2019）。只有在科学界的支持下，非政府组织才能扭转根深蒂固的社会、文化和企业对这些物种衰落的漠不关心，如果没有政府协调的保护和管理努力，加上鲎生活和产卵的国家内部和国家之间强有力的执法机制。

　　中国的TAL生产商（其中一些是美国的LAL生产商）通过暗示他们受制于执行不力或不存在的政府捕捞法规以及普遍存在的社会、文化、经济和环境因素，规避了美国用于鲎的可持续捕捞实践的应用，企业对亚洲鲎物种的可持续性漠不关心（Dubczak，2019a，b）。然而，正是捕捞者为保护鲎资源而花费的不断增加的距离，以及收回相关成本的需要，使得美国使用的采血模式在亚洲无法维持。这反过来加强了人类消费和TAL生产的捕捞者和进口商之间的共生关系。TAL生产商从捕捞者或进口商处租用鲎的时间仅足以排出其血淋巴，然后将其送回屠宰，供人类消费和二级市场，即几丁质、肥料和中药（Novitsky 2017，pers.comm）。这些二级市场随着人类消费和TAL的需求而起伏。由于亚洲是最大和增长最快的医疗保健市场之一（IMS 2017），预计到2024年，对TAL的需求将翻一番（锡安市场研究2019），可能通过公众宣传活动抵消人类消费的下降。

　　由于中国鲎的数量曾经很庞大，但现在已经不适合这种规模的企业，因此，来自执行不力或不存在捕捞和/或出口法律的国家的动物将继续受到剥削。关于TAL仅占世界BET市场20%的报告（Dubczak，2019a，b）不应被视为一个微不足道的数字，因为受影响的物种已经被列为濒危物种并濒临灭绝（IUCN，2019）。对于为什么TAL的生产商应该继续利用这些日益减少的资源，或者为什么制药、医疗器械和医疗保健提供商应该在存在其他同样可行的BET的情况下继续使用TAL，是否可以提出伦理论据？

　　1959年由Russell和Burch首次提出，替换、减少和精炼（Replace、Reduce、和Refine，3R）的概念旨在促进科学程序中使用的动物的人道待遇（Russell and Burch，1959）。尽管3R现在已被西方社会广泛接受和实践为道德标准（Orlans等人，1998；NHMRC 2013；CCAC指南2017），但3R的范围和规模仍有待澄清。例如，大多数无脊椎动物物种（包括四种现存的鲎物种）被排除在动物科学研究法规之外，头足类动物除外（Berry等人，2015年）。然而，正如头足类四个亚目的情况一样，全球对鲎物种保护的支持越来越多，这开始加深我们对人类活动导致其他生物痛苦的理解。欧洲出现了越来越多的非动物内毒素检测趋势（欧洲委员会，2010年）。这一点已经在第《欧洲药典》的2.6.30章（2010）中引入了单核细胞活化试验（MAT），这是一种基于人类免疫细胞的完整热原测定法，取代了兔热原试验（RPT）。关于BET，《欧洲药典》第5.1.10章（2016b）和第2.6.32章（EDQM 2019）继续推进3R。前者已经包括rFC分析作为替代BET，后者将使其成为药典标准。这将消除额外方法验证的必要性，从而将其作为LAL/TAL的完全接受的BET替代品（图3）。

　　在缺乏明确的伦理指示的情况下，需要领导。只有一类用户群体有能力超越地理边界、政府的不安、语言学以及社会、文化和企业的冷漠，这阻碍了三种亚洲鲎物种中的两种（中国鲎Tachypleus tridentatus、巨鲎Tachypleus gigas）的保护，这就是全世界的制药、医疗器械行业和医疗机构都依赖TAL进行细菌内毒素检查。大多数人都不知道他们的TAL供应链将无法满足未来的需求，并且由于他们继续使用TAL，他们参与了鲎物种的衰退。通过实施供应链管理政策，以LAL替代TAL的使用，并在适用情况下通过rFC分析增加内毒素检测要求，他们可以降低两种亚洲鲎物种的捕捞压力，同时降低用于生产LAL的美国鲎物种（美洲鲎Limulus polyphemus）的转移捕捞压力，预计到2024年，这一数字将翻一番（锡安市场研究2019）。

　　通过排除药品和医疗器械中有害数量的内毒素，LAL和TAL几十年来一直帮助保障患者安全。尽管如此，这些动物提取物在可预见的未来可能会继续使用。尽管如此，大量证据表明，基于rFC的分析相当于实现了LAL/TAL的功能，并具有提供可行的非动物BET的额外优势。目前，用rFC替代LAL/TAL溶解物可能需要额外的验证程序。然而，这一相对较小的努力可以提供一种现代、可靠的分析方法，也可以为鲎物种的保护做出重大贡献。

　　在美州鳗鲡（Angulla rostrata）和青螺（Busycon spp.）渔业找到可行的替代诱饵并转向rFC检测或其他无动物细菌内毒素检测之前，美州鲎（Limulus polyphemus）将继续为迁徙的滨鸟、其他依赖性野生动物、捕鱼和非捕鱼公众进行管理，无论细菌内毒素检查行业对该物种的依赖程度如何。美国细菌内毒素检测生产商目前对鲎诱饵渔业表现出的社会精英主义和蔑视需要调和，因为两个用户群体必须找到合作的方式，在不断增长的市场中共享这一有限且可持续管理的资源。

　　在亚洲，三种鲎物种（中国鲎Tachypleus tridentatus、巨鲎Tachypleus gigas、圆尾鲎Carcinoscorpius rotundicauda）将继续减少，直到这些动物生活和产卵地的政府采取协调一致的保护措施，改变社会、文化和企业对不可持续的捕捞做法的冷漠态度。在那之前，这些动物将继续失去基本的栖息地和遗传多样性，并以不可持续的方式收获，用于人类消费、TAL生产和二级市场。制药、医疗器械行业和医疗设施有能力通过消除从供应链中购买TAL，为亚洲鲎物种的保护做出重大贡献。此外，他们明智的做法是，根据IUCN和ASMFC的集体知识以及世界各地致力于这些古代水手的生物学和保护的非政府组织和科学家的庞大全球网络，做出BET供应链管理决策。这些组织独立于市场和利益相关者，致力于了解和保护世界上现存的四种鲎物种，并已证明自己是诚实的经纪人，而不是一些收获和/或利用鲎的用户群体的偏见。

　　作者感谢大西洋国家海洋渔业委员会（ASMFC）通信主任Tina Berger，感谢她协助收集了ASMFC管理美州鲎（Limulus polyphemus）的历史数据，并感谢Kevin Williams和Brendan Tindall对该手稿的批判性阅读。