烟酰胺对卵泡发育和卵母细胞质量的影响

　　烟酰胺-nicotinamide（或niacinamide），是烟酸的酰胺衍生物。

　　也叫做“不潮红”烟酸。

　　烟酰胺是细胞能量传输链中重要的辅酶——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的前体 ，可调节细胞代谢、氧化还原、线粒体稳态和能量产生。

　　因为很容易被皮肤、血液和肠道吸收，并广泛分布于全身。

　　所以nicotinamide是比较理想的补充剂。

　　价格在iherb上比较适中，

　　那么烟酰胺的补充是否会对卵子有帮助呢？

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　　关于补充方式及剂量的问题，可以参考这篇文章。

　　生殖生物学贺医生：大剂量烟酰胺的安全性研究进展

　　烟酰胺（NAM）是一种重要的抗氧化剂，与女性生育能力密切相关，但其作用尚未明确。本研究的目的是探讨NAM对不同阶段卵泡发育和卵母细胞质量的影响。

　　采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定236例体外受精(IVF)女性卵泡液(FF)中NAM浓度，分析NAM与临床指标的相关性。在小鼠卵丘-卵母细胞复合物 (COCs) 的体外成熟 (IVM) 过程中，添加不同浓度的 NAM 以检查成熟率和受精率。评估了用不同过氧化氢 (H 2 O 2 ) 和 NAM处理的卵母细胞中的活性氧 (ROS) 水平。进行免疫荧光染色以测量异常纺锤体的比例。

　　大卵泡中NAM水平显着高于小卵泡。在成熟的FF中，NAM浓度与卵母细胞成熟和受精率呈正相关。IVM 期间 5 mM NAM 处理增加了氧化应激模型中的成熟率和受精率，并显着降低了 H 2 O 2诱导的小鼠卵母细胞中 ROS 水平的增加。

　　FF 中较高水平的 NAM 与较大的卵泡发育有关。IVM 期间补充 5 mM NAM 可改善小鼠卵母细胞质量，减少氧化应激造成的损伤。

　　卵泡液(FF)是卵母细胞微环境的重要组成部分，为卵泡和卵母细胞的正常生长发育提供所需的营养支持，维持细胞内各种信号通路的正常传导[ 1 , 2 ]。FF由颗粒和膜细胞的分泌物以及血浆渗出物组成。FF 中代谢物的测定通常被认为是评估暴露于影响生殖结果的因素的可靠方法 [ 3 , 4]。最近一项关于FF氧化脂质代谢组学的研究指出，卵巢储备功能下降的患者中与花生四烯酸代谢途径密切相关的15个氧化脂质代谢物明显低于卵巢储备正常组，说明氧化脂质代谢功能障碍是卵巢储备功能密切相关[ 5 ]。杨等人。使用液相色谱-串联质谱分析不同大小卵泡的 FF 代谢特征，发现各种代谢物（如脱氢表雄酮）与卵泡发育和大小、卵母细胞成熟和胚胎质量显着相关 [ 6 ]。

　　烟酰胺（NAM）是一种B族半必需维生素，可通过色氨酸在肝脏的代谢从头合成。NAM 是细胞能量传输链中重要的辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的前体 [ 7 ]，可调节细胞代谢、氧化还原、线粒体稳态和能量产生 [ 8 ]。NAM 很容易被皮肤、血液和肠道吸收，并广泛分布于全身。其主要代谢物包括主要通过尿路排泄的 N1-甲基烟酰胺和 N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺 [ 9]。补充 NAM 被认为与多种全身性疾病的消退有关，包括皮肤病 [ 10 ]、精神系统退行性疾病 [ 11 ] 和炎症性疾病 [ 12 , 13 ]]。近年来，人们发现 NAM 在女性生殖中发挥着多种重要的有益作用。内贾巴蒂等人。证明在大鼠来曲唑诱导的多囊卵巢综合征 (PCOS) 中，与对照组相比，补充 NAM 或 NAM 代谢物 N1-甲基烟酰胺导致异常发情逆转，限速酶基因表达水平降低CYP17A1 通过激活 AMPK 介导的通路来调节雄激素的产生和血清睾酮水平 [ 14]。据报道，在子宫内膜异位症患者口服含有 NAM 的新型膳食补充剂 3 个月后，使用视觉模拟量表 (VAS) 测量的盆腔疼痛症状显着降低，血清前列腺素 E2 和CA125 显着下降 [ 15 ]。

　　由卵巢微环境成分变化引起的氧化应激会影响卵母细胞的质量和功能，并增加卵母细胞的衰老和不育[ 16 , 17 ]。氧化应激还会影响蛋白质、脂质和 DNA 的结构和功能，破坏细胞活性，甚至导致细胞死亡 [ 18 ]。相反，抗氧化剂能够降低活性氧（ROS）的水平并防止由氧化应激介导的生殖细胞凋亡。曹等人。报道称，在衰老的小鼠模型中，槲皮素被发现通过 sirtuin3 依赖性超氧化物歧化酶 2 去乙酰化途径消除卵母细胞中的氧化应激，减少细胞凋亡和自噬，并在体外促进卵母细胞成熟和囊胚形成。19 ]。庞等人。发现暴露于百草枯可显着增加牛卵母细胞的 ROS 水平和早期凋亡率，降低谷胱甘肽水平，并阻止卵母细胞核和细胞质的成熟。添加抗氧化剂褪黑激素有效地逆转了由百草枯引起的卵母细胞质量下降 [ 20 ]。因此，卵巢内活性氧和抗氧化剂的平衡对卵母细胞的质量有显着影响。

　　许多研究表明，NAM 的作用机制主要是通过抗氧化和抗炎途径，包括维持线粒体膜电位和预防氧化损伤和炎症 [ 21 – 24 ]。然而，NAM 在 FF 中的作用尚未见报道，NAM 是否通过调节氧化应激来提高卵母细胞质量仍不清楚。本研究旨在探讨 NAM 对卵泡发育、卵母细胞成熟和妊娠结局的影响。此外，我们在体外细胞水平上进一步证实了 NAM 的作用和可能的机制。研究结果将为改进辅助生殖诊断和治疗提供新策略并形成理论基础。

　　研究共纳入2019年4月至2020年11月在南京医科大学第二附属医院生殖医学中心接受IVF治疗的236名女性。受试者是整体健康状况良好的女性，她们由于输卵管因素或不明原因而无法生育。他们的男性配偶为体外受精提供了正常精子（表 S 1和表 S 2）。排除标准包括子宫内膜异位症、卵巢早衰、染色体异常、高血压、糖尿病等慢性病。本研究经南京医科大学第二附属医院伦理委员会批准。每个受试者都提供了书面知情同意书。

　　如前所述收集 FF 样品 [ 6]。肌内注射人绒毛膜促性腺激素后34-36小时，在经阴道超声引导下提取卵泡中的液体。在每个受试者中，使用未使用的针头吸出一个小卵泡（平均直径：8-13 mm，FF 体积：0.3-1.0 ml），然后将总 FF 体积放入无菌的 15 ml 试管中。在最初的卵巢穿刺后，冲洗穿刺针并反复吸入空气，直到穿刺针中的所有液体都被清除。然后从第二个卵巢进行大卵泡的初始抽吸（平均直径：17-22 mm；FF 体积：2.5-5 ml）。收集的 FF 体积被记录下来，并与相应卵泡的直径相关联。如果 FF 的体积与相应卵泡的大小不匹配，则样本不包括在研究中。25 ]，成熟FF的收集确保只有大卵泡中的液体被抽出。FF 样品以 10000×g 离心 10 分钟，然后收集上清液并储存在 - 80 °C 直至随后进行分析。

　　根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒（中国南京森贝嘉生物科技有限公司）测量 FF 中 NAM 的浓度。记录各个孔在 480 nm 处的吸光度并根据标准曲线进行量化。批次内和批次间的变异系数分别为 7.5% 和 9.5%。

　　实验动物研究经南京医科大学伦理委员会批准。除非另有说明，本研究中使用的所有化学品均购自 Sigma Aldrich 化学公司（美国密苏里州圣路易斯）。

　　将3-4周龄的雌性ICR小鼠和9-10周龄的雄性ICR小鼠分别置于室内通风笼中，12小时光照/12小时黑暗循环，恒温21-22℃。为动物提供足够的饮用水和饲料。主要有三个实验方案： 实验1：研究体外成熟（IVM）过程中卵母细胞中NAM的有效浓度。在加入 0.01、0.1、1、5 或 10 mM NAM 的 IVM 培养基中与未成熟卵母细胞共培养 16-18 小时 [26-29] 后，评估卵丘扩张、母细胞成熟率和受精率。与对照进行比较。实验二：建立小鼠氧化应激模型。用不同浓度的过氧化氢（H 2氧2 ; 0、20、50 或 100 μM) 1 小时，以评估卵母细胞的成熟率和受精率。实验3：研究NAM在氧化应激时是否能够提高卵母细胞的质量。基于前两个实验的结果，在用 100 μM H 2 O 2预处理卵母细胞 1 小时后，在补充有 0 mM 或 5 mM NAM 的培养基中进行 IVM 。研究了上述相同的实验条件，分析了卵母细胞中的 ROS 水平，并分析了异常纺锤体的比例。

　　为了获得完全发育到 GV 阶段的卵母细胞，小鼠腹腔注射 5 IU PMSG [ 30]。46-48小时后，将小鼠安乐死，卵巢完全剥离。用 1 ml 注射器反复穿刺窦卵泡，将卵丘-卵母细胞复合物 (COC) 形式的未成熟 GV 卵母细胞释放到补充有 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的 α-MEM 培养基中以维持 GV 阶段，并且只回收了具有完整卵丘细胞层的卵母细胞。为了实现 IVM，首先将收集的 COCs 转移到 2 ml α-MEM 中，辅以 20% 胎牛血清 (FBS)、50 U/ml 青霉素和 50 μg/ml 链霉素。通过抽吸从 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤中洗脱卵母细胞，然后置于 IVM 培养基（5% FBS、3 ng/ml EGF、50 mIU/ml rFSH、0.25 mmol/L 丙酮酸钠、0.5% 青霉素、0.5% α-MEM培养基中的链霉素；爱贝生物科技有限公司，南京，中国）含有不同浓度的 NAM（实验 1 中为 0、0.01、0.1、1、5 或 10 mM；实验 3 中为 0 或 5 mM）。将卵母细胞在 37°C、5% CO2 中培养 16-18 小时。所有培养基在使用前在 37 °C 和 5% CO2 下平衡过夜。IVM 后对卵母细胞的成熟度进行评分。GV 卵母细胞通过存在核膜和核仁来鉴定，而具有第一极体的卵母细胞代表 MII 卵母细胞。

　　如前所述进行体外受精 [ 31]。简而言之，雄性小鼠在体外成熟过程结束前通过颈椎脱位实施安乐死。在立体显微镜下使用注射器将精子从附睾尾部和输精管释放到含有 450 μl 人输卵管液（HTF，爱贝生物技术有限公司，南京，中国）的液滴培养皿中，然后在 37 ℃孵育°C 在 5% CO2 培养箱中 30 分钟至 1 小时，以使精子获能。将 COC 转移到含有 245 μl HTF 和大约 5 μl 精子的受精培养皿中。6-7小时后，将胚胎在洗涤盘中洗涤3次以去除多余的精子。通过原核形成的形态学评价确认并记录受精率。所有培养基在使用前在 37 °C 和 5% CO2 下平衡过夜。

　　根据先前公布的方法 [ 32-34 ] ， COC 用含有不同浓度 H 2 O 2（0、20、50 或 100 μM）的 α-MEM 处理 1 小时以诱导氧化应激。然后将卵母细胞转移到含有 NAM（0 或 5 mM）的 IVM 培养基中 16 小时。通过轻轻吹打 0.1% 透明质酸酶从周围的颗粒细胞中剥离 COC，然后收集成熟卵母细胞以额外测量 ROS 水平并进行免疫荧光染色。

　　根据制造商的程序评估卵母细胞中的 ROS 水平 [ 35 ]。将经受不同实验条件的 MII 卵母细胞在补充有 10 μM 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（Beyotime Institute of Biotechnology）的 α-MEM 中于 37°C 孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤至少 3 次。使用相同设置的荧光显微镜获取卵母细胞的图像。使用 ImageJ 软件计算荧光强度。

　　如前所述进行免疫荧光染色 [ 36]。没有颗粒细胞的卵母细胞在室温下用 2% 多聚甲醛固定 20 分钟。将卵母细胞在含有 0.5% Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中透化 20 分钟，然后转移到含有 3% BSA 的封闭溶液中 2 小时。将卵母细胞与一级单克隆抗体（1:500；抗α-微管蛋白）在 4°C 下在黑暗中孵育过夜。然后将卵母细胞用洗涤溶液（PBS + 0.5% Triton X-100 + 0.5% Tween-20）洗涤 3 次，然后与二抗（1:1000；兔抗小鼠）在室温下孵育 1 小时。再次洗涤卵母细胞，然后用 Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology) 将 DNA 染色 15 分钟。最后，将染色的卵母细胞用抗淬灭密封片固定在载玻片上，用盖玻片密封，避光保存。

　　实验数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0和Image J软件进行统计分析。组间比较采用双尾配对 t 检验和单向方差分析，而组间使用 Spearman 相关分析进行相关。所有实验至少重复 3 次，每组检查至少 20 个卵母细胞。在P ?< 0.05时，组间差异被认为是显着的。

　　本实验共纳入 46 名患者。?测量了来自同一女性 ( n = 46) 的大 FF ( n ?= 46) 和小 FF ( n = 46)中的 NAM 浓度?。结果表明，大FF中的NAM浓度（45.72±1.85 μg/L）高于相应的小FF（41.40±2.29 μg/L），差异有统计学意义（P ?< 0.001，图1）。 1一个）。

　　图。1

　　a不同发育阶段卵泡液中的 NAM 浓度。b卵泡大小：NAM 的 ROC 曲线下面积为 0.685，p ?= 0.0023。c卵母细胞成熟率：NAM 的 ROC 曲线下面积为 0.610，p ?= 0.0099。d正常受精率：NAM 的 ROC 曲线下面积为 0.611，p ?= 0.0093

　　每对小 FF 和大 FF 样本均来自同一受试者。女性的平均年龄为 30.02 ± 0.52 岁，平均体重指数 (BMI) 为 21.74 ± 0.42 kg/m 2 (表 1）。按照以往的研究方法[ 6 ]，选取大FF与小FF的NAM比值（大卵泡为对照组，小卵泡为实验组）的相关性作为临床指标进行相关性分析。不同临床指标表现出不同的相关特征，相关系数及其对应的P值见表???

　　表格1。

　　1. 数据表明，大 FF 与小 FF 中 NAM 的比率与受精率呈正相关（r = 0.335，P ?= 0.023）。

　　大/小FF中NAM与临床流行病学信息的Spearman相关系数参数价值观r磷年龄（岁）30.02±0.520.0920.542体重指数（公斤/米2）21.74 ± 0.420.0070.966亚足联 (n)16.87 ± 0.97? 0.1500.321基础 LH (mIU/ml)4.85 ± 0.47? 0.0090.955基础 FSH (mIU/ml)7.90±0.440.1520.320AMH (纳克/毫升)3.66±0.420.0430.779基础 E2 (pg/ml)48.49 ± 3.060.0520.733Gn 持续时间（天）10.22±0.230.2910.050Gn 剂量 (IU)2375 ± 64.720.2300.125HCG 日 E2 (pmol/L)4228.61 ± 240.120.0120.937HCG 日孕酮 (nmol/L)1.12±0.110.1770.240HCG 日的 LH (IU/L)0.97 ± 0.090.0120.938取回的卵母细胞 (n)13.87 ± 0540.0430.776成熟卵母细胞 (n)10.46±0.630.1080.474卵母细胞成熟率（%）77.58 ± 2.410.1870.213受精率（%）73.60 ± 2.350.3350.023*解理率 (%)99.69 ± 1.230.0650.666优质胚胎率（%）31.70 ± 3.29-0.2510.092

　　*组间数值有显着差异（P ?< 0.05）

　　NAM烟酰胺、FF卵泡液、BMI体重指数、AMH抗苗勒管激素、AFC窦卵泡计数；GnRH促性腺激素释放激素，HCG人绒毛膜促性腺激素；卵母细胞成熟率=MII阶段的卵母细胞数/回收的卵母细胞总数；受精率=受精胚胎数/取卵总数

　　为了研究卵泡液NAM与卵母细胞质量和妊娠结局的关系，采集了190名接受IVF的妇女的成熟FF样本，并测定了NAM的浓度。收集相关临床流行病学资料进行分析。为了阐明FF中NAM与取卵周期中重要临床指标的直接关系，分析了NAM浓度与临床指标的相关性。结果表明，成熟FF中NAM浓度与卵母细胞成熟率（r = 0.173，P ?< 0.05）和受精率（r = 0.165，P ?< 0.05）呈正相关，差异有统计学意义（表 2）。这与不同发育阶段FF中NAM的第一阶段研究结果一致，表明FF中NAM浓度的增加可能表明卵母细胞质量良好。然而，NAM水平与优质胚胎率和临床妊娠率无关。

　　FF NAM与IVF周期特征的相关性分析参数价值观r磷纳米（微克/升）51.52 ± 2.23年龄（岁）32.16±0.400.0280.698体重指数（公斤/米2）22.54±0.24? 0.0770.295亚足联 (n)15.29±0.52? 0.0370.613基础 LH (mIU/ml)4.64±0.22? 0.0520.475基础 FSH (mIU/ml)9.13±0.37? 0.0210.776AMH (纳克/毫升)3.24±0.21? 0.0120.873基础 E2 (pg/ml)48.36 ± 3.270.0640.385Gn 持续时间（天）10.75±0.22? 0.0560.445Gn 剂量 (IU)2358.82 ± 58.14?0.0590.417HCG 日 E2 (pmol/L)3963.26 ± 271.000.0820.264HCG 日孕酮 (nmol/L)1.04 ± 0.060.0830.259HCG 日的 LH (IU/L)1.92±0.200.0420.570HCG 日 FSH (IU/L)15.54±0.320.0380.608取回的卵母细胞 (n)11.01 ± 0.620.0650.372成熟卵母细胞 (n)8.19 ± 0.490.1210.095卵母细胞成熟率（%）74.59 ± 1.750.1730.018*受精率（%）74.30 ± 1.750.1650.024*解理率 (%)95.44 ± 1.330.0130.861优质胚胎率（%）49.75 ± 2.31?0.0240.744临床妊娠率(%)49.18 ± 3.440.0600.429

　　*组间数值有显着差异（P ?< 0.05）

　　为进一步探讨影响患者体外受精重要临床指标的 NAM 浓度，根据 NAM 浓度的三分位数对患者进行分组，并比较三组间临床流行病学资料的差异（表 3）。NAM水平与Basal E2呈正相关（P ?= 0.001）。此外，随着NAM浓度的增加，卵母细胞的成熟和受精率增加。如表所示???

　　表3，

　　3, NAM 浓度最低组和最高组的卵母细胞成熟百分比分别为 67.90 ± 3.32% 和 78.56 ± 2.57% ( P ?< 0.05), 而 NAM 浓度第三百分位两端的卵母细胞受精百分比分别为 67.84 ± 3.33% 和 78.28 ± 2.57% ( P ?< 0.05)。因此，我们推测 NAM 在增强卵母细胞成熟和受精能力方面发挥着有益作用。

　　NAM浓度三分位数的患者临床特征参数第 1 组第 2 组第 3 组磷n ?= 63n ?= 64n ?= 63纳米（微克/升）中位数33.6143.8859.38范围8.57–38.7838.8–49.2949.39–251.15年龄（岁）32.29±0.7432.52±0.7531.67±0.590.674体重指数（公斤/米2）22.35 ± 0.4122.86 ± 0.3922.41 ± 0.460.649亚足联 (n)15.32±0.8515.84 ± 1.0514.71 ± 0.790.680基础 LH (mIU/ml)4.76±0.324.68±0.434.46±0.360.844基础 FSH (mIU/ml)10.07 ± 0.788.23±0.539.12±0.550.120AMH (纳克/毫升)3.11±0.333.53±0.423.07±0.320.610基础 E2 (pg/ml)37.37 ± 2.4065.29 ± 8.4042.05 ± 3.420.001*Gn 持续时间（天）10.94±0.4210.75±0.3710.57±0.340.793Gn 剂量 (IU)2386.91±102.022350.78±100.212338.89 ± 101.410.941HCG 日 E2 (pmol/L)3666.62 ± 393.254027.55±582.214198.32±407.980.719HCG 日孕酮 (nmol/L)1.05±0.101.05±0.141.02±0.070.975HCG 日的 LH (IU/L)1.95±0.341.81±0.342.00 ± 0.380.923HCG 日 FSH (IU/L)16.10 ± 0.6815.09 ± 0.5415.44±0.420.425取回的卵母细胞 (n)10.94 ± 1.1610.33 ± 1.0511.78 ± 1.000.633成熟卵母细胞 (n)7.46±0.858.33±0.918.79 ± 0.760.527卵母细胞成熟率（%）67.90 ± 3.3277.37 ± 2.9978.56 ± 2.570.023*受精率（%）67.84 ± 3.3376.84 ± 2.9978.28 ± 2.570.030*解理率 (%)92.82 ± 3.0995.93 ± 2.2897.61 ± 0.980.328优质胚胎率（%）49.06 ± 4.1751.86 ± 4.2748.31 ± 3.580.805临床妊娠率(%)47.84 ± 6.1246.33 ± 6.0353.19 ± 5.800.688

　　在单独的窗口中打开

　　*组间数值有显着差异（P ?< 0.05）

　　接受者操作特征 (ROC) 曲线用于预测 NAM 对增强卵泡发育大小、卵母细胞成熟率和正常受精率的值。分析ROC曲线后发现，卵泡发育大小（AUC = 0.685，P ?= 0.0023）、卵母细胞成熟率（AUC = 0.610，P ?= 0.0099）和正常受精率的曲线下面积（AUC）（ AUC = 0.611，P ?= 0.0093）显着大于参考线（0.5）。对于卵泡大小，对于 FF 为 39.75 μg/L 的 NAM 浓度截止点，ROC 曲线的最佳敏感性和特异性分别为 80.4% 和 56.5%（图 3）。???

　　（图 1b）。

　　1乙）。FF 中 NAM 浓度的截止值为 46.62 μg/L，表示预测卵母细胞成熟率的敏感性为 48.6%，特异性为 71.6%（图 3）。???

　　（图 1c）。

　　1C）。NAM浓度预测卵母细胞受精率的敏感性和特异性分别为49.1和72.0%（图4）。???

　　（图1d），

　　1d)，分别。

　　由于发现NAM与人类卵母细胞成熟和受精呈正相关，因此使用体外实验进一步证实和探索NAM对生殖的作用。将不同浓度的 NAM（0、0.01、0.1、1、5 或 10 mM）添加到小鼠卵母细胞的 IVM 培养基中，并在 16-18 小时后评估卵丘细胞的扩张情况（图 2）。 2一个）。随后，测量NAM处理后卵母细胞的成熟和受精率。与对照组（62.82% ± 6.81%）相比，NAM 处理提高了卵母细胞成熟率（图 1）。???

　　（图2b），

　　2b)，特别是在 5 mM (81.22% ± 6.77%) 时，尽管不显着。用 NAM 处理后，卵母细胞的受精率同样增加（图 3）。???

　　（图 2c）。

　　2C）。因此，在后续实验中选择 5 mM NAM 作为救援浓度。然而，我们发现过量的 NAM 浓度会抑制卵母细胞的成熟和受精。用 10 mM NAM 处理后，MII 卵母细胞的形成显着减少（对照组为 12.63 ± 4.09% vs 62.82% ± 6.81%，P ?= 0.009），而受精率也显着下降（3.29% ± 1.73% vs 37.60% ±对照为 6.18%，P ?= 0.007）。

　　图 2

　　不同浓度NAM对卵母细胞成熟和受精的影响。使用光学显微镜观察 NAM 对积云膨胀的影响 ( a )。用 NAM 处理后，卵母细胞在体外成熟 ( b ) 和受精 ( c ) 的百分比。d、f成熟和未成熟卵母细胞的代表性图像。受精卵母细胞中的原核形成 ( e )。PB：极体；GV：生囊泡。各组之间的值有显着差异（* P ?< 0.05，** P ?< 0.01）。比例尺 = 200 μm

　　为了进一步证实我们的假设，即 NAM 可能通过其抗氧化特性在生殖系统中发挥有益作用，我们使用 H 2 O 2构建了体外氧化应激损伤模型。在IVM之前用0、20、50或100μM H 2 O 2预处理卵母细胞1小时，然后测量卵母细胞的成熟和受精率。如图所示。 3a，H 2 O 2处理后卵母细胞的成熟率（20、50和100 μM分别为67.25% ± 11.89、67.65% ± 12.19和52.80% ± 11.47%）低于对照组（88.89% ± 3.64%），在 100 μM 时达到显着水平（P ?= 0.04）。随着 H 2 O 2浓度的增加，卵母细胞受精率呈剂量依赖性下降（图 2）。???

　　（图 3b），

　　3b)，在 100 μM H 2 O 2治疗组中显着下降（20.60% ± 8.98% vs 61.33% ± 10.41% 对照组，P ?= 0.008）。H 2 O 2处理可能在体外损害卵母细胞的成熟和受精。100 μM的H 2 O 2处理满足了我们随后的实验要求。

　　图 3

　　不同浓度H 2 O 2对成熟和受精的影响。a体外不同浓度H 2 O 2处理的卵母细胞的成熟率。b体外不同浓度H 2 O 2处理的卵母细胞的受精率。NAM对暴露于H 2 O 2的卵母细胞成熟率（c）和受精率（d）的影响。组间值有显着差异（* P ?< 0.05，** P ?< 0.01）

　　为了探索 NAM 对 H 2 O 2诱导的卵母细胞抑制的保护作用，在另外的实验中使用 5 mM NAM 来共同处理卵母细胞。正如预期的那样，NAM 有效地防止了 H 2 O 2诱导的卵母细胞成熟和受精率的降低。虽然各实验组的卵母细胞成熟率和受精率仍低于对照组，但差异无统计学意义（P ?> 0.05）。结合H 2 O 2单独损伤的结果（图1）。???

　　（图3a，

　　3a、b），体外补充NAM在一定程度上抵抗了H 2 O 2对卵母细胞的损伤，部分恢复了H 2 O 2暴露的卵母细胞的成熟和受精能力（图1）。???

　　（图3c，

　　3c、d)。

　　为了确定 NAM 在改善 H 2 O 2诱导的氧化应激方面的功效，使用 ROS 检测试剂盒测量 MII 卵母细胞中的 ROS 水平。如图所示。 4c、与对照组相比，100 μM H 2 O 2处理显着提高了卵母细胞中的ROS水平（P ?< 0.01）（图1中的标记）。???

　　图4

　　4总是正确的。），而添加 5 mM NAM 显着降低了由 100 μM H 2 O 2引起的高水平氧化应激（P ?< 0.05）。这表明外源性 NAM 补充剂降低了卵母细胞暴露于压力时的氧化应激程度，从而减少了对卵母细胞质量的损害。

　　图 4

　　NAM 治疗影响 IVM 期间受氧化应激损伤的卵母细胞的 ROS 水平和纺锤体异常。各组 MII 卵母细胞ROS ( a ) 和相对荧光强度 ( c ) 的荧光染色（比例尺 = 200 μm）。b不同组纺锤体形态和染色体排列的典型图像。d每组的主轴畸形率（比例尺 = 5 μm）。星号表示有统计学意义 ( P ?< 0.05)

　　此外，为了阐明 NAM 在减少 H 2 O 2诱导的卵母细胞纺锤体损伤中的功效，使用免疫荧光染色来研究卵母细胞中的纺锤体形态。尽管没有显着影响，但暴露于 H 2 O 2的卵母细胞中纺锤体形成的异常率增加，而额外的 NAM 补充剂降低了暴露于 H 2 O 2的卵母细胞的异常率（图 1）。???

　　（图4b，

　　4b、d)，说明NAM可以在一定程度上防止暴露于H 2 O 2的卵母细胞纺锤体异常。讨论

　　在本研究中，FF 中 NAM 的浓度范围为 8.57 μg/L 至 251.15 μg/L，平均值为 51.52 μg/L。NAM在大小卵泡中的分布不同，大FF中NAM的浓度明显高于小FF。此外，成熟FF中的NAM水平与卵母细胞成熟度和??受精率呈正相关。这些观察结果随后在氧化应激模型中得到验证，结果表明补充 NAM 可促进卵母细胞成熟和受精，下调小鼠卵母细胞的氧化应激程度。先前的研究表明，哺乳动物组织中的 NAM 浓度非常低，约为 11-400 μM [ 37]。然而，迄今为止尚未测量人类女性生殖系统中的 NAM 浓度。据我们所知，本研究首次量化了人类 FF 中的 NAM，并探讨了 NAM 与辅助生殖相关临床参数之间的关系。

　　FF 代谢物组成的变化会影响卵泡发育和卵母细胞质量。先前对牛排卵前卵泡 FF 代谢组学的研究表明，参与葡萄糖和氨基酸代谢的 18 种差异代谢物与卵泡直径呈显着正相关，并影响卵母细胞的发育能力 [ 38 ]。中西等人。发现 FF 中的皮质醇积累导致颗粒细胞和卵丘细胞凋亡，导致滤泡闭锁 [ 39 ]。此外，据报道，超生理剂量的维生素 D3 治疗通过显着增加正常小鼠卵巢中大卵泡和新形成和退化的黄体的数量来促进卵泡发育。40 ]。因此，我们选择FF作为我们研究的研究样本，试图寻找与卵泡发育和卵母细胞质量相关的潜在生物标志物。

　　对卵巢反应不佳的女性的代谢组学研究表明，血清中烟酸和 NAM 的代谢途径似乎与卵巢储备有关，可能是评估育龄女性卵巢功能的潜在策略 [ 41 ]。在本研究中，FF 中 NAM 的水平与 IVF 女性诱导排卵后的卵泡发育显着相关，较高浓度的 NAM 倾向于导致更大的卵泡发育。卵母细胞的成熟和质量对女性生育能力至关重要，其中调节因素，例如一些基因 [ 42 ]、蛋白质 [ 43 ] 和代谢物 [ 44 ]]，一直是辅助生殖领域的研究热点。尽管先前的一些研究指出 NAM 可以抑制卵母细胞成熟和胚胎发育 [ 26 , 45 ]，但越来越多的研究证实，适当浓度的 NAM 可以提高卵母细胞质量，甚至提高妊娠结局。埃尔谢赫等人。表明在牛卵母细胞 IVM 期间，补充 0.1 mM NAM 可增强卵丘细胞扩增，增加 MII 卵母细胞的百分比，显着降低 ROS，并通过激活 sirtuin1/苏氨酸特异性蛋白激酶 B (AKT) 信号通路改善随后的胚胎发育，尽管高浓度（> 10 mM）的 NAM 具有相反的效果 [ 46]。研究发现，在牛受精胚胎的体外受精培养基中，10 mM NAM 处理 3 h 可降低胚胎细胞中的 ROS，显着增加 sirtuin1 的表达和囊胚形成率，表明 NAM 通过抗氧化增强了体外牛胚胎的发育能力活动 [ 47 ]。然而，一项研究表明，20 mM NAM 会导致牛卵母细胞中 ROS 积累和线粒体功能障碍，损害卵母细胞成熟和胚胎发育潜力 [ 48 ] 此外，在回顾中，研究人员指出，5 mM NAM 对生存能力有积极影响和细胞复制，但超过 20 mM 的 NAM 会导致细胞凋亡 [ 49]。我们的研究结果表明，5 mM 可能是体外补充 NAM 的合适浓度，这可以改善小鼠卵母细胞的成熟和受精。

　　由细胞内 ROS 积累引起的氧化应激是影响卵母细胞质量的主要因素之一，导致卵母细胞老化和生育力下降 [ 50 – 52 ]。拉帕斯等人。发现 NAM 通过激活人胎盘中的 FoxO3 增强了抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的基因表达，并减少了脂多糖介导的炎性细胞因子产生和氧化应激 [ 53 ]。此外，在大鼠脂肪肝细胞中，发现 NAM 通过减少 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的过度表达来减少肝细胞中的氧化应激和脂质积累，从而减缓肝脂肪变性 [ 54 ]。敏等人。发现NAM补充老年人秀丽隐杆线虫导致 ROS 积累减少，增加卵母细胞的线粒体功能并保护后续后代的生长和运动能力 [ 55 ]。同样，本研究表明，体外补充 5 mM NAM 通过降低氧化应激模型中卵母细胞中的 ROS 水平来保护卵母细胞质量。

　　NAM通过核苷酸拯救途径转化为NAD+[ 56 ]，被认为是哺乳动物中NAD+的主要来源[ 57 ]。以前的研究提出，NAM 主要通过增加 NAD + [ 58 ]的水平来发挥有益作用。NAD + 水平的升高可以通过调节 NAD + 消耗酶 sirtuin1 的活性来减少线粒体 ROS 的产生 [ 59 ]。随着 NAD+ 和 sirtuin1 活性水平随着年龄的增长而下降 [ 8]，靶向增加NAD+水平已成为改善衰老相关疾病和延长人类寿命的潜在治疗方法。因此，我们推测 NAM 可以通过增加内源性 NAD + 水平来保护卵泡发育和卵母细胞质量。然而，NAM和NAD+之间相互转化的动态过程极其复杂。体外补充NAM如何调节卵母细胞中NAD+及其相关酶通路的机制仍有待进一步研究，这将是我们后续研究的重点。

　　先前的研究指出，虽然 NAM 的推荐剂量远高于其他维生素 [ 49 ]，但 NAM 补充剂是安全且耐受性良好的 [ 60 , 61 ]。然而，在这项研究中，这里的临床样本量仍然太小，并且在动物模型中仅确认了近似的 NAM 活性浓度。仍需要进一步的大样本实验来确认 NAM 的安全性和有效性。结论

　　总之，我们的研究表明，FF 中较高水平的 NAM 与较大的卵泡发育有关。成熟FF中NAM水平与卵母细胞成熟率和受精率呈正相关。IVM 期间补充 5 mM NAM 可促进卵母细胞成熟和受精，减少小鼠氧化应激引起的卵母细胞质量损伤。本研究为NAM作为临床不孕症患者的潜在生物标志物和有效营养支持提供了初步的理论依据。

　　原文参考：

　　Effects of nicotinamide on follicular development and the quality of oocytes