2023广东版生物高考第二轮复习-专题28基因工程和生物技术的安全性与伦理问题

时间：2023-08-11

　　2023广东版生物高考第二轮复习简单情境1.细菌的防御机制（2022辽宁鞍山二模,15）（不定项）CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术，该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示，当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9蛋白切断目标DNA,从而起到防御作甩下列关于该机制的叙述错误的是（）A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核甘酸C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键D.高倍光学显微镜可观察到该现象答案ABD噬菌体DNA被细菌gRNA识别并被Cas9蛋白切割属于特定位点的切割不是基因突变，不能体现基因突变的不定向性,A错误;gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苗酸,B错误;Cas9蛋白可切断目标DNA,该过程破坏的是DNA分子的磷酸二酯键C正确:该现象属于分子水平的改变，光学显微镜下无法观察到,D错误。2.引物设计与定点诱变（2022山东济宁二模.14）通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点.有关叙述正确的是（）第1轮酶a1引物 1.第2轮PCR酶a1引物1J1：二—「引物2丁引物2的hiZ②—"引物2醉bA.限制酶—「引物2丁引物2的hiZ②—"引物2醉bB.PCR体系中需要加入脱氧核甘酸、耐高温的DNA聚合酶、ATPC.第2轮PCR中，引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4答案DDNA子链的延伸方向为据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5端,A错误;PCR体系中需要加入脱氧核苗酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲溶液等，但不需要加入ATP,B错误;第3轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链等长的突变基因,C错误;在第3轮PCR结束后，会产生23=8（个）DNA分子,其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有两个，因此含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4,D正确。复杂情境3.实时荧光RT-PCR（2022福建模拟预测,15）实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团.新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针.导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（）咽拭子痛引物,木忤病毒RNAcDNA凝精灵、基.基团，实时荧光RT-PCRA.做RT-PCR之前.需要先根据cDNA的核甘酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若有强烈荧光信号发出,说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒的蛋白类物质或病毒引发产生的抗体,其原理都是抗原一抗体杂交答案CRT-PCR需要根据cDNA的核苗酸序列合成引物和探针，且引物、探针要与待测样本cDNA混合,A正确;PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增,B正确;若有强烈荧光信号发出,说明被检测者极有可能感染了病毒C错误;RNA病毒的检测方法还有特异性抗原蛋白检测（可检测病毒表面的一种蛋白）和特异性抗体检测（检测感染者体内通过免疫反应产生的某种抗体），其原理均为抗原一抗体杂交,D正确。复杂陌生情境4.基因打靶（2022湖南师大附中一模,22）1985年,科学家利用同源重组将一段外源质粒插入人类染色体DNA0-珠蛋白位点，首次在哺乳动物中进行基因打靶并获得成功。目前，在胚胎干细胞中进行同源重组已经成为遗传修饰小鼠染色体组基因位点的常规技术。通过对这些基因敲除小鼠的表型分析.新发现了许多与人类疾病相关的基因。基因打靶的操作如图，在目的基因序列的第一个外显子中插入neo「基因（新霉素抗性基因），同时目的基因序列的两端加HSV-tk基因（该基因的表达产物能将DHPG转化为有毒物质而使细胞死亡）构建基因敲除载体;将基因敲除载体导入ES细胞，在ES细胞中基因敲除载体可以和染色体上目的基因所在区段发生同源重组,再通过添加新霉素和DHPG的培养基筛选，即可得到打靶成功的ES细胞。目的基因启动子1目的基因启动子14HSV-lkIneo'i23HSV-tk同源重组HSV-tkln?/l启动子2 3HSV-tk选择培养基HSV-tkln?/l启动子2 3HSV-tk选择培养基目的基因的第一个外显子被neo,基因插入(1)构建基因敲除载体时，需用酶对目的基因、neo「基因和HSV-tk基因进行处理。(2)ES细胞在功能上具有的特征是，常用技术将基因敲除载体导入ES细胞。(3)根据题图信息分析，通过同源重组插入染色体组基因中的neo「基因的作用是 (写出两点)。(4)将基因敲除载体导入ES细胞后，除了发生同源重组外,还会发生非同源重组，而非同源重组会将neor基因和HSV-tk基因同时插入染色体组基因中.据此分析.用加入新霉素和DHPG的培养基将同源重组细胞筛选出来的机理是答案⑴限制酶和DNA连接(2)发育的全能性显微注射⑶修饰小鼠染色体组中特定的基因将成功发生同源重组的ES细胞筛选出来(4)只有成功发生重组的ES细胞才会含有neo「基因，所以加入新霉素的培养基可以将发生同源重组和非同源重组的ES细胞筛选出来;同时，发生同源重组的ES细胞由于不含HSV-tk基因.不会将DHPG转化为有毒物质，从而在含有DHPG的培养基中生存下来;而发生非同源重组的ES细胞，由于含有HSV-tk基因，会将DHPG转化为有毒物质.从而无法在含DHPG的培养基中生存解析⑴构建基因敲除载体时需要用限制前处理后形成相同末端，再用DNA连接酶将片段连接起来。(2)ES细胞为胚胎干细胞,具有发育的全能性。基因工程中动物细胞作为受体细胞时，常采用显微注射技术将目的基因导入受体细胞。(3)由题干信息和图示可知.通过同源重组将neo,基因插入染色体组目的基因序列的第一个外显子中,对染色体组基因进行了修饰，同时.该基因是新霉素抗性基因，可以将成功发生同源重组的ES细胞筛选出来。（4）只有成功发生重组的ES细胞才会含有neo,基因，所以加入新霉素的培养基可以将发生同源重组和非同源重组的ES细胞筛选出来;同时，发生同源重组的ES细胞由于不含HSV-tk基因,不会将DHPG转化为有毒物质，从而在含有DHPG的培养基中生存下来，而发生非同源重组的ES细胞，由于含有HSV-tk基因，会将DHPG转化为有毒物质,从而无法在含DHPG的培养基中生存。知识拓展基因敲除技术是用外源片段整合到活体细胞DNA的同源序列中，使某个基因被取代或被破坏而失活，是在DNA水平对细胞遗传信息进行改造的技术。基因敲除技术可使细胞的基因定点改变的原理是基因重组.其可使某个基因被取代或被破坏而失活，故将来有可能用于癌症的治疗。B组简单情境.PCR技术改良植物（2022北京顺义二模,13）水稻根部一般没有根瘤菌,在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻”小型化肥厂"，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述错误的是（）A.用PCR技术可从根瘤菌DNA中获取固氮基因B.PCR扩增后的目的基因可直接导入水稻细胞中C.PCR技术可用于检测目的基因是否插入水稻基因组中D.实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选答案BPCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子的复制过程,特异性地快速扩增目的基因，故用PCR技术可从根瘤菌DNA中获取固氮基因,A正确。PCR扩增后的目的基因需要与载体结合，构建基因表达载体后再导入水稻细胞中,B错误。PCR技术可用于检测目的基因是否插入水稻基因组中，将PCR产物进行电泳，若出现杂交带,则证明目的基因成功插入水稻基因组中;反之则没有成功插入,C正确。具有固氮基因的水稻根系微生物能利用空气中的氮气，培养基中不需要加入氮源，故可用缺氮培养液对转基因水稻进行筛选,D正确。.基因修饰的异体器官移植(2022北京西城二模,14)科学家尝试将经过基因修饰的猪心脏移植到人体，下列叙述错误的是()A.器官移植中的免疫排斥主要是由细胞免疫引起的B.供体猪需敲除其参与免疫识别的相关基因C.猪心移植可缓解器官移植中的供体短缺问题D.由于种间差异，无需担心供体携带的病毒基因答案D器官移植中的免疫排斥主要是由细胞免疫引起的，在移植过程中应使用药物抑制T细胞增殖,A正确;供体猪的心脏属于异体器官，移植到人体会产生免疫排斥反应，需敲除供体猪参与免疫识别的相关基因以减少免疫排斥,B正确;猪的器官和人体有很好的免疫兼容性，可安全、成功地移植到人体内，减少免疫排斥反应的发生,可缓解器官移植中供体器官短缺的问题,C正确;供体携带的病毒基因可能在受体中表达并发挥作用，危害受体的健康，因此需要关注供体携带的病毒基因,D错误。复杂情境3.基因编辑(2022北京海淀一模,20)肠道微生物对宿主健康具有重要影响,但目前缺乏对特定菌株进行基因编辑的有效手段。科研人员尝试使用M13噬菌体作为载体,对大肠杆菌进行基因编辑。(DM13噬菌体与T2噬菌体相似，能够侵染大肠杆菌，在侵染过程中，其蛋白质外壳留在菌体外，头部的—注入菌体内，指导子代噬菌体的复制增殖。与T2噬菌体不同的是，被M13噬菌体侵染的大肠杆菌不发生裂解。(2)科研人员将绿色荧光蛋白基因特异性序列(sgfp)、Cas酶基因与利用特定方法得到的M13噬菌体的环状DNA进行重组，构建重组基因编辑质粒(pCG)、如图1.注：Ori一复制原点C"一段年青霉素抗性基因Car-基因编辑醐的基因茎加一绿色荧光蛋白基因特定序列图I①构建pCG需要用到的工具酶有.②以pCG的绿色荧光蛋白基因特异性序列(sgfp)经过程形成的RNA,会靶向结合绿色荧光蛋白基因，从而使Cas酶能够切割绿色荧光蛋白基因。(3)科研人员将绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因导入大肠杆菌，获得GS菌株。先用添加GS菌株的饲料喂养小鼠，一段时间后，将小鼠分为实验组和对照组。其中,实验组小鼠用添加含的M13噬菌体和的饲料喂养，以筛选获得肠道微生物被基因编辑的小鼠。本实验对照组使用的质粒应当包括图1中的—.a.Cmrb.sgfpc.Orid.Cas(4)为确认M13噬菌体作为载体对大肠杆菌进行基因编辑的可行性和特异性科研人员检测肠道微生物010,10,10'0101010,10,10'0101IO4IO5010”"10,绿色荧光强度图2实验组：第0天状态实验组：第14天状态图3-1 图3-2①图2中,标号为a、c的区域分别代表含有红色荧光的微生物和无荧光的微生物,b区域代表含有荧光的微生物。②图3-1为实验组第0天小鼠肠道微生物的荧光情况。请在图3-2中标注该组小鼠第14天时肠道微生物的荧光区域编号。③图2表明,实验中M13噬菌体能o答案（l）DNA（2）限制酶和DNA连接酶转录（3）pCG陵茉青霉素acd（4）①红、绿叠加色②实验组：第14大状态③成功地特异性敲除绿色荧光蛋白基因解析（1）T2噬菌体侵染大肠杆菌时,头部的DNA注入菌体内,而蛋白质外壳留在菌体外。（2）构建重组基因编辑质粒（pCG）需要DNA连接酶（连接目的基因和载体）和限制酶（切割目的基因和载体）这两种工具酶。pCG的绿色荧光蛋白基因特异性序列（sgfp）可经转录过程形成RNA。⑶由题图可知,pCG上的标记基因为浚莘青霉素抗性基因,因此实验组小鼠可用添加含pCG的M13噬菌体和竣节青霉素的饲料喂养，以筛选获得肠道微生物被基因编辑的小鼠。根据实验要遵循单一变量原则，结合pCG的绿色荧光蛋白基因的特异性序列为sgfp,可知本实验对照组使用的质粒应不含sgfp,即应包括图1中的Cm，、Ori、Cas。（4）①据图2可知，横轴表示绿色荧光强度，纵轴表示红色荧光强度，则b区域代表含有红、绿叠加色荧光的微生物。②根据图2可知，实验组第14天小鼠含有a荧光区域和c荧光区域,b荧光区域消失,且c荧光区域大〃环口第0天小鼠中的几乎一致，具体标注见答案。③根据图2,实验组小鼠出现a荧光区域,b荧光区域消失，而对照组小鼠没有a荧光区域,b荧光区域仍然存在,再结合a荧光区域代表含有红色荧光的微生物,b荧光区域表示含有红、绿叠加色荧光的微生物可知,Mu噬菌体能成功地特异性敲除绿色荧光蛋白基因。4.植原体与“僵尸植物"（2022北京西城二模,19）学习以下材料，回答（1）?（4）题。植原体与"僵尸植物"植原体是无细胞壁的原核生物，生活于植物韧皮部筛管细胞中,主要靠叶蝉、飞虱等从韧皮部取食的昆虫传播。植原体能危害上千种植物，枣疯病、泡桐丛枝病、水稻黄萎病等均是由植原体侵染所致。植原体病害的显著特征是被感染植物常出现花变叶（花芽异常发育成叶状体）、丛枝症（芽和枝条过度增殖）等典型形态改变，导致植物无法正常生长、繁殖而沦为植原体滋生和虫媒传播的温床。"僵尸植物"就是用以形容被植原体侵染的植物。SPL和GATA这两类蛋白是植物生长发育的重要调控因子,可抑制植株分枝形成，调节叶片和花的发育。研究发现植原体效应因子P05能特异识别SPL和GATA并使之降解,导致植物不断产生叶片和败育小枝但不衰老，呈现"僵尸"状态。通常情况下，细胞内的一些错误折叠蛋白、不再需要的蛋白与泛素（Ub）结合,这些被Ub标记的蛋白最终被蛋白酶体识别并降解（图1）,70%的蛋白降解依赖这种泛素化过程。有意思的是，植原体的P05通过"劫持"蛋白酶体上的泛素受体R10,形成P05-R10-SPL/GATA异源三聚体,直接介导目标蛋白在蛋白酶体降解（图2）,该过程并不需要Ub的参与。蛋白酶体蛋白的体图1 图2植原体也可以侵染叶蝉、飞虱等昆虫，但对昆虫宿主一般无害。科学家通过比对动、植物体内的R10序列，发现二者有2个氨基酸的差异，正是这种小小的差异造成P05并不结合昆虫的R10o植原体P05作用机理的研究为精细调控作物生长、靶向蛋白降解、防治虫媒病害提供了全新的思路。(1)植原体细胞生存与增殖必需的结构或物质包括(填选项前字母)，其与"僵尸植物"的种间关系为.A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核D.核糖体 E.核酸 F.酶(2)阐释植原体通过如何"操纵"植物细胞内的蛋白酶体实现利己不利宿主的机制。(3)下列哪些实验可为"僵尸植物"产生机制提供证据?A.将P05基因导入拟南芥,观察植株的形态变化B.用蛋白酶体抑制剂处理被植原体侵染的拟南芥，检测SPL和GATA的含量C.敲除拟南芥的R10基因，再用植原体侵染，检测SPL和GATA的含量D.用P05基因敲除的植原体侵染拟南芥，观察植株表型变化(4)综合本文信息，利用现代生物技术设计预防枣疯病发生的基本操作程序。答案(l)BDEF寄生(2)①P05识别并结合SPL和GATA,直接介导代谢所需正常蛋白在蛋白酶体的降解，导致花变叶、分枝的形成,植物不能繁殖，同时为植原体提供更多营养;②植物衰老延迟，增加昆虫取食的次数，有利于植原体通过昆虫传播;③P05"劫持"蛋白酶体上的R10,使得被泛素标记的、本该降解的蛋白依然存在，影响植物正常生长发育。(3)ABCD(4)定点突变或基因编辑植物R10基因，使其编码的两个特殊的氨基酸序列突变成动物R10上对应编码的氨基酸序列(获取动物的R10基因)—构建含突变R10基因的表达载体-导入枣树细胞，进行组织培养一检测和鉴定再生枣树中的突变R10基因(植原体侵染并观察枣树表型变化)解析Q)根据材料可知，植原体是无细胞壁的原核生物，则其也没有细胞核，故选BDEF;植原体生活于植物韧皮部筛管细胞中，与"僵尸植物"的种间关系属于寄生。(2)①由材料信息"植原体的P05通过‘劫持’……直接介导目标蛋白在蛋白酶体降解"和"植原体效应因子P05能特异识别SPL和GATA并使之降解，导致植物不断产生叶片和败育小枝但不衰老"可知,P05能特异性识别并结合SPL和GATA,直接介导目标蛋白在蛋白酶体降解，导致植物不断产生叶片和败育〃俵，不能分化成花,从而不能繁殖，这样就可为植原体提供更多营养。②植物延迟衰老，可以增加昆虫取食次数，有利于植原体通过昆虫的传播进行繁衍。③P05"劫持"蛋白酶体上的泛素受体R10,使得被泛素标记的需要降解的蛋白质依然存在，影响植物正常生长发育。⑶由材料可知，效应因子P05的作用与SPL和GATA有关，且能"劫持"蛋白酶体上的泛素受体R10,从而影响植物生长及叶片和花的发育，可知ABCD都合理。（4）植原体也可以侵染叶蝉、飞虱等昆虫，但对昆虫宿主一般无害，原因是动植物的R10序列有2个氨基酸的差异，这种差异造成P05并不结合昆虫的R10,因此可以利用现代生物技术改造植物的R10基因,具体方法为定点突变或基因编辑植物R10基因，使其编码的两个特殊的氨基酸序列突变成动物R10上对应编码的氨基酸序列（获取动物的R10基因）一构建含突变R10基因的表达载体-导入枣树细胞，进行组织培养一检测和鉴定再生枣树中的突变R10基因（植原体侵染并观察枣树表型变化）。C组简单情境1.靶向基因敲除技术（2022南京三模,13）如图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性内切核酸酶FoK1两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸（字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸）与四种碱基（A、G、C、T）有恒定的对应关系。FoK1是一种形成二聚体后具有内切核酸酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是（）TALE蛋白左臂TALE看白右臂A.单独使用FoKI对基因的切割敲除具有随机性B.TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程C.二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对D.TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列答案C根据题干信息分析,FoK1是一种非特异性内切核酸酶.若单独使用FoK1对基因的切割敲除具有随机性,A正确;分析题图可以看出TALE蛋白左右臂中间有FoKI结合的部位，因此完整的TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程,B正确;根据题干信息分析,TALE的二连氨基酸与四种碱基有恒定的对应关系，但不能说二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对,C错误;由于TALE的二连氨基酸与四种碱基有恒定的对应关系，因此TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计可依据靶基因碱基序列,D正确。2.甲醇酵母菌（2022扬州中学3月月考,13）甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌,它可以高效表达外源蛋白,但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是（）A.用两种酶切割目的基因和质粒，可防止目的基因反向连接和质粒的自身环化B.常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中C.与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近D.与其他酵母菌相比,甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化答案B用两种酶切割目的基因和质粒，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化,A正确:常用制备感受态细胞的方法,将目的基因导入微生物细胞.B错误;与大肠杆菌作受体相比，甲醇酵母为真核生物.其表达出的胶原蛋白可经过内质网和高尔基体的加工，与人体产生的胶原蛋白结构更相近,C正确;与其他酵母菌相比，甲醇酵母可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少，便于目的蛋白的分离与纯化,D正确。复杂情境3.Cre/loxP重组酶系统（2022泰州泰兴中学4月考,24）Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术.请回答下列问题：5，一ATAA（TT（；（；TATA—ATGTATGC—TATACCAACITAT—3'3'—TATTCAACCATAT—TACATACCTTAll：CTTCAATA—5'图1图2（l）loxP具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是（填序号）。（2）Cre酶能催化如图2所示的反应，随机识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列,并在图1的②中特定位点切断DNA双链，切口被重新连接后.保留片段，从而实现目标基因的敲除。若经Cre酶作用使得两个loxP位点间的序列发生反转,其原因可能是。（3）Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因（填"上游"或"下游"）插入一个带有loxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下.目的基因（填"表达"或"不表达"）。（4）抗虫烟草的制备过程中.通常用法将重组质粒导入烟草细胞，导入成功后.标i己基因如抗除草剂基因可用Cre/loxP重组酶系统将其，其继续留在烟草体内可能会将抗除草剂基因转移到杂草中，造成基因污染。（5）GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物,GFP基因会产生绿色荧光蛋白，配合Cre/loxP重组酶系统来研究发育生物学的问题。图3①构建基因表达载体时，可用酶将IOXP序列、GUS基因及GFP基因连接力妾上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区(如图3所示)，这是由于基因自身无启动子而无法表达。②Cre基因经38°C热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区，据此分析绿色荧光区形成的原因是，采用等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。答案(1)②(2)2两个loxP序列方向相反(3)上游表达(4)农杆菌转化敲除⑸①限制酶和DNA连接GFP②Cre酶能(特异性识别并)切割loxP序列，使GFP基因得以表达延长热处理时间解析(1)由图1可知，决定方向的是序列②。(2)Cre酶识别两个相同的loxP序列，从而实现对目标基因的敲除.片段1自身环化且带有待敲除基因，因此应保留片段2。若两个loxP位点间的序列发生反转，则可能是两个loxP序列方向相反。(3)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因上游插入带有loxP位点的编码终止密码子的序列,Cre酶会切开loxP位点，使编码终止密码子的序列不发挥作用.因此目的基因表达。(4)将目的基因导入植物细胞通常采用农杆菌转化法，导入成功后，可用Cre/loxP重组酶系统将抗除草剂基因敲除,其继续留在烟草体内可能会转移到杂草中.造成基因污染。(5)①构建基因表达载体时,可用限制酶和DNA连接酶处理相关基因，使loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区，是因为GFP基因自身无启动子不能表达。②Cre基因经过热处理后被激活表达,Cre酶切割了loxP序列，使GFP基因得以表达,最终出现绿色荧光区，延长热处理的时间使Cre基因充分表达，可以扩大绿色荧光区面积。4.实时荧光RT-PCR技术(2022江苏新高考基地4月联考.6)实时荧光RT-PCR技术(RT-qPCR)利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪.再根据扩增曲线计算出起始模板量.即样本病毒载量。如图是利用RT-qPCR进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)载量测定的主要过程。请据图回答：样本采集及病毒灭活处理步骤1:病毒＜RNA提取荧学测/日酶K、RNA步骤1:病毒＜RNA提取荧学测/日酶K、RNA/岩■中节中

　　施抑制剂),R(皮曜光3病毒RNA步骤2:病毒；＜cDNA合成5：酣X、引物、②酶"d犒③'战为荧光步骤3：%PCR?3'延伸|如引物MRNA-DNA杂交分子TTTT⑴过程①中,RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是.采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理，其目的是.RNA酶抑制剂的作用日AIXo(2)过程②中.加入的酶N是 .根据图示，保证病毒核酸检测准确的关键是O(3)在进行新冠病毒核酸检测时.通常以病毒的ORFlab基因为检测的目标基因,是因为ORFlab基因具有的特点。检测试剂中还加有“阳性对照"和"阳性对照"阴性对照的主要作用是O(4)如表是SARS-CoV-2核酸检测时PCR仪参数设定要求：步骤温度时间循环a.病毒cDNA合成50c15min1b.预变性95C5min1C.变性95C5sd.?60C40s45①步骤a的反应时间要足够长，其目的是o②步骤d主要包括PCR过程的阶段。（5）临床上.将症状及影像学结果高度疑似、核酸多次检测为“阴性”的现象称为检测结果"假阳性"，导致"假阴性"结果可能是由于（填序号）①检测者处于感染初期②检测者感染时间较长③样本采集位置不规范④样品稀释度不足⑤病毒出现变异答案⑴蛋白酶K能催化病毒蛋白质水解提高样本转运和检测阶段的安全性防止样本RNA水解，影响检测结果的准确性⑵逆转录酶设计引物和探针的特异性（3）特异性强、基因结构相对稳定（变异小）排除因检测过程、试剂等因素引起的假阳性⑷①保证样本中病毒RNA均能逆转录形成cDNA②退火（或复性）、延伸（5）①②③⑤解析（1）分析题图，过程①中,RNA提取裂解液含有的蛋白酶K可水解病毒蛋白质，起到灭活病毒的作用。采样后迅速进行病毒灭活，可以防止样本在运输和检测阶段造成病毒泄漏，以提高样本转运和检测阶段的安全性。RNA酶能催化RNA水解,RNA提取裂解液中的RNA酶抑制剂可以防止病毒RNA被水解，进而影响检测结果的准确性。（2）过程②为逆转录.需要逆转录酶催化，说明加入的酶N是逆转录酶。采用实时荧光PCR技术检测病毒核酸，其关键是设计新冠病毒基因的特异性引物和依据检测的基因内部特异序列设计特异性探针。（3）在进行新冠病毒核酸检测时.选择检测的目标基因应具有特异性强、基因结构相对稳定（变异小）的特点。设置"阴性对照”的目的是排除因检测过程、检测试剂等因素引起的假阳性。（4）①表格中步骤a为逆转录，该步骤反应时间要足够长，其目的是使病毒RNA均能逆转录形成cDNA。②步骤d是实时荧光PCR中变性后的两个步骤:退火（或称复性）和延伸。（5）检测者处于感染初期其样本中病毒载量少，由于检测的灵敏度限制,可能使检测结果出现假阴性，①符合题意:检测者感染时间较长，由于自身免疫,可能使样本中病毒载量很低.进而导致检测结果出现假阴性,②符合题意;样本采集位置不规范、样品稀释度过高等可造成样品中病毒载量低，进而导致检测结果出现假阳性，③符合题意，④与题意不符;若病毒发生了变异,可能会使试剂中引物不能跟模板结合，不能获得PCR产物,也会使检测结果出现假阴性，⑤符合题意。D组复杂情境1.剔除标记基因（2022济宁二模,20）（不定项）如图是基因工程育种过程中剔除转基因植物标记基因的一种策略.下列叙述正确的是（）G01SMGSl（G01SMGSl（；G01A.图中的两个质粒,都带有T-DNA序列B.该方法可以将标记基因和目的基因转移到同源染色体上C.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异D.除去转化植株的标记基因必须经过有性繁殖阶段的基因重组答案ABD图中的两个质粒,均为农杆菌的Ti质粒,都带有T-DNA序列,A正确;T-DNA序列可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上，对Ti质粒进行改造，可以将标记基因和目的基因转移到同源染色体上.B正确:经过杂交过程，获得了无筛选标记的转基因植株，该过程中发生了基因重组（非同源染色体的自由组合）,C错误;结合图示可知，经过有性繁殖阶段的基因重组除去了转化植株的标记基因,D正确。知识归纳农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，可通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞，并将其插入植物细胞的染色体DNA上。2.用引物检测个体的基因组成（2022泰安二模,15）用农杆菌侵染水稻（二倍体）细胞，获得1条染色体上R基因被插入T-DNA的个体TO。T-DNA插入基因的位置如图1所示。T0自交得T1,同时用Pl、P2、P3为引物检测T1个体的基因组成情况，如图2所示。（图1箭头方向为引物所在子链的延伸方向;R基因被T-DNA插入后，用Pl、P2为引物无法完成PCR）。下列说法错误的是（）T-DNAP3图IP1+P2P2+P3MMHH”V1HWMHHHHHM图2A.该实验中所用的PI、P2、P3三种引物均为单链DNAB.R基因被T-DNA插入后可能会导致基因无法表达相应蛋白C.用Pl、P2引物进行PCR得到产物的个体均为R基因纯合子D.W、H、M个体的比例不为1：2：1,可能是因为调查的样本数量较小答案C引物一般为单链DNA分子,A正确;R基因被T-DNA插入后.R基因被破坏，所以可能无法表达相应蛋白,B正确:R基因被T-DNA插入后，用Pl、P2为引物无法完成PCR.用Pl、P2引物进行PCR得到产物的个体不可能是R基因纯合子,C错误;TO为杂合子启交后代W、H、M个体的比例理论上为1：2：1,图中W、H、M个体的比例不为1：2：I,可能是因为调查的样本数量较小，误差较大所致,D正确。.多基因表达载体（2022济宁二模,6）OsGLOl、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示）,利用农杆菌转化法转化棉花，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列叙述正确的是（）潮霉素抗卡那霉素性基因EcCATOsGLOI以以抗性基因 T-DNA J注：◎启动子|终止子%叶绿体转运肽A.四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译B.OsGLOkEcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞D.可用抗原一抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达情况答案D利用农杆菌转化法转化棉花.可使目的基因插入棉花细胞的染色体DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在棉花细胞核内进行转录，在核糖体上进行翻译,之后在叶绿体转运肽的引导下进入叶绿体,A错误;在同一个T-DNA中OsGLOl基因和EcCAT基因的启动子启动转录的方向不同，因此OsGLOl、EcCAT基因转录时不是以DNA的同一条单链为模板的.B错误;只有Ti质粒的T-DNA能转移到受体细胞的染色体DNA上，卡那霉素抗性基因不在T-DNA中,而潮霉素抗性基因在T-DNA中,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞,C错误;可用抗原一抗体杂交技术检测四种酶在转基因棉花中的表达量情况,D正确。名师点睛RNA聚合酶只能从启动子部位与基因结合，且只与基因（DNA）的3,端结合，因此转录形成mRNA时只能由51端向3'端延伸，且mRNA的延伸方向与模板链的方向相反。复杂陌生情境.亚洲棉光籽性状遗传机制（2022济宁二模,25）亚洲棉的光籽（突变体无短绒）和毛籽（野生型有短绒）是一对相对性状.中国农业科学院棉花研究所对亚洲棉光籽性状遗传机制进行了研究，发现突变体光籽表型的出现与8号染色体上DNA片段发生突变有关，研究者提取突变体和野生型的8号染色体的DNA进行PCR,产物扩增后电泳结果如图：O□■■□O□■■□口■■□□■■□□■■□□■■□O■■O□■■□O■■880kb至903kb区间引物I引物2引物3引物4引物5引物6引物7引物8注：1代表扩增的区间.其左侧数字为引物为编号；口代表点样处，每对引物对应的电泳结果左为野生型，右为突变体；（1）据图分析，该PCR过程是根据野生型毛籽棉的DNA序列设计连续的重叠引物对。电泳结果表明相对分子质量较大的扩增产物与点样处的距离较（选填"大"或"小"）,并推测8号染色体上第对引物对应的区间（简称M）发生了碱基的（选填"增添""缺失"或"替换"）是突变体光籽出现的根本原因。（2）研究者从野生型和突变体中克隆出区间M后,运用基因工程技术分别导入棉花原生质体，检测其下游报告基因的基因表达水平,进而推测区间M的作用，结果如图。内参基因插入M 报告基因IAJC表达LHKEN装达最内参基因REN是为了排除转化效率不同对实验结果的干扰，因此图中LUC表达量/REN表达量可用来衡量报告基因的表达水平。实验结果说明:.（3）研究者发现基因GaFZ的表达会影响毛籽棉花短绒的发育.而且突变体GaFZ蛋白结构与野生型一致。综合上述研究推测突变体光籽表型出现的可能原因是.@答案（1）8号染色体的880kb至903kb区间小6增添（2）区间M促进下游报告基因的表达，且其作用的发挥与区间M的长度（或M的类型）和方向有关⑶突变体区间M突变后，促进了GaFZ基因的表达，进而抑制了棉花短绒的发育.导致出现了光籽性状解析（1）据图分析该PCR过程设计了8组连续的重叠引物对，这些引物扩增的片段都在野生型毛籽棉的880kb至903kb区间。电泳结果表明相对分子质量较大的扩增产物会更靠近点样处,与点样处的距离较小。观察电泳结果,8号染色体上的第6对引物扩增出来的片段不同.突变体比野生型更靠近点样处,说明突变体这个片段比野生型的相对分子质量大，应该是发生了碱基对的增添。（2）根据柱形图可知，空载体、野生型和突变体的LUC表达量/REN表达量不同，说明LUC表达量/REN表达量可以用来衡量M的表达水平。区间M的长度和方向不同,LUC表达量/REN表达量值不同，说明M可以促进下游基因的表达.其作用的发挥与区间M的长度和方向有关。（3）"基因GaFZ的表达会影响毛籽棉花短绒的发育，而且突变体GaFZ蛋白结构与野生型一致"，说明基因GaFZ可能不在区间M上，突变体区间M突变后，促进了下游基因.如GaFZ基因的表达,进而影响了棉花短绒的发育.导致出现了光籽性状。5.同源重组基因敲除技术（2022德州二模,25）同源重组基因敲除技术是将同源DNA片段导入受体细胞，利用同源DNA片段的互换,用其他DNA片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉3.042菌株中的msn2基因，获得高产的g-5菌株。其部分机理如图所示。注：m、，n2L、msn2、msn2R、pyrG为DNA相应片段⑴据图分析,欲实现msn2基因的敲除,需要在pyrG基因两侧分别插入片段，该过程中需要的工具酶有.（2）科研人员选取进行基因敲除操作后的3个菌落分别提取其DNA,利用引物进行PCR扩增.电泳结果如图所示。根据1号菌落电泳结果可得出的结论是.为进一步验证3号菌落为目的菌落，需要选择引物—重复上述操作.最终电泳结果应出现1条长度为bp的条带。标准1号2号3号3700bp一，■（3）米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关.tpsl基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。研究发现g-5菌落tpsl基因表达量明显降低。据此推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是O砥案（Dmsn2Umsn2R限制酶、DNA连接酶（2）A和B1号菌落没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042基因组原始序列C和D2602（3）msn2基因表达产物的缺乏抑制了tpsl基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸解析（1）从题图中可以看出在msn2两侧存在msn2L和msn2R基因，所以欲实现msn2基因的敲除需要在pyrG基因两侧分别插入msn2L和msn2R片段,在这个过程中.需要用限制酶将基因切割，再用DNA连接酶将三个基因片段连接起来。（2）从图中可以看出，引物C和引物D都不能将g-5基因组扩增完，所以为进行PCR扩增,需要选择引物A和B;1号菌落条带长度接近3000bp,米曲霉3.042基因组的碱基对数为1032+1024+909=2965bp,两者较为接近，所以推测1号菌落没有实现基因敲除;3号菌落条带长度约为3700bp,引物C和D可以扩增msn2L和pyrG,所以可以选择引物C和D重新扩增并电泳，从图中可以看出,这对引物扩增的片段长度是2602bp。（3）tpsl基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性85菌落tpsl基因表达量明显降低，所以可以推测msn2基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是msn2基因表达产物的缺乏.抑制了tpsl基因的表达.提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸。知识拓展基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的.由此可见,基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。简单情境.基因工程生产胰岛素(2022天津和平一模,16)我国是糖尿病患者第一大国，胰岛素市场广阔，目前我们国家已经成功通过基因工程生产出胰岛素，如图是进行基因工程生产胰岛素的部分示意图。据图回答下列问题：3'四引物5引物73'四引物5HinAIII氨年青霉素

　　抗性基因四环素、抗性基因BamH氨年青霉素

　　抗性基因四环素、抗性基因BamHI-Z/indHIEcoRI图2质粒结构示意图(1)已知DNA链的合成方向是若要扩增出胰岛素基因并用于表达载体的构建，应该选择的引物是.选择这两种引物的原因是.(2)结合图1和图2,应该选择的限制酶最好是，原因是O(3)能够发挥作用的胰岛素是由两条链盘曲折叠形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌.只能从大肠杆菌中提取到两条单链肽链，不能得到有活性的胰岛素，原因是.答案⑴引物4和弓物5既能保证正常合成子链，又包含限制酶切割位点(2)BamHI和HindlH既能防止质粒自身环化，又可以保证目的基因正确连接在质粒上(3)大肠杆菌为原核生物.无内质网和高尔基体等细胞器.不能对多肽链进行加工解析(1)(2)在选择限制酶切割质粒和目的基因时需注意不能破坏目的基因、启动子等，且能切出相同的黏性末端。由图I、图2可知,选择的限制酶最好是BamHI和HindlH,因其既能防止目的基因和质粒自身环化，又可以保证目的基因正确连接在质粒上。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸.需要与模板链的3端结合。据图可知.引物3、引物4以及引物5、引物6都位于子链的3端,可以复制出目的基因，但是经引物3和引物6复制后的目的基因没有限制酶BamHI和HindlH的切割位点，不能与质粒连接,故应选择引物4和引物5用于表达载体的构建。(3)胰岛素的本质是分泌蛋白,其最终能发挥作用需要内质网和高尔基体等的加工，而大肠杆菌属于原核生物，只有核糖体这一种细胞器，故只能从大肠杆菌中提取到两条单链肽链,不能得到有活性的胰岛素。复杂情境.基因工程生产苯乳酸(2022天津十二校一模,17)乳酸菌无氧呼吸过程中,第一阶段产生的丙酮酸会在LDH的催化下产生乳酸,科学家通过改造乳酸脱氢酶(LDH),能够高效地生产高纯度的苯乳酸。(1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因，需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大,可用于生产苯乳酸。①先将LDH基因片段连入载体中，形成环状质粒,如图。、5,-TGACTGA(jGTAl(JACTCGGAC-3,

　　引物》'、，一 - 引物I ]' 质粒 1注：1.方框中"GTA"转录出的UAC是酪氨酸的密码子2.亮氨酸的密码子为CUX(X可为任意碱基)、UUA、UUG将突变后的序列设计在引物I中,以环状质粒为PCR的，再向体系中加入四种脱氧核甘酸（dNTP）、酶、以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因,PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有、。A.5'-TGACTGACTAACACTCGGAC-3'B.5-TGACTGACAACCACTCGGAC-3'C.5-TGACTGACGATCACTCGGAC-3'D.5'-TGACTGACGAGCACTCGGAC-3'②上述PCR产物为状DNA分子，改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧,需要用酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。（2）产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与，现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息，先用限制酶和切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物.再用限制酶切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。（3）上述科学实践属于生物工程中的工程.答案⑴①模板耐高温的DNA聚合（T叫DNA聚合）弓|物2AD②链DNA连接（2）NdeIXhoINeoI和BamHI（3）蛋白质解析（1）①分析题意可知,科学家拟改造LDH基因。将突变后的序列设计在引物1中,以环状质粒为PCR的模板，加入四种游离的脱氧核昔酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶（T叫DNA聚合酶）、引物2以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因。由于亮氨酸的密码子为CUX、UUA、UUG,根据碱基互补配对原则，引物中相同位点（对应题干方框中的"GTA"）能转录出含有相应密码子的只有A和D。②题干中扩增得到的PCR产物为链状DNA分子,需要用DNA连接酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。（2）分析题图可知，质粒1中的mLDH基因适合用限制酶NeoI和BamHI切割，质粒2中的FDH基因适合用限制酶XbaI和XhoI或NdeI和XhoI切割，而空载体中限制酶XbaI切割位点位于启动子中，故不宜选用限制酶XbaIo因此,应先用限制酶NdeI和XhoI切割质粒2和空载体,将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶Neo1和BamH1切割质粒1和上一步中的连接产物,连接获得基因表达载体。（3）由分析可知，题干的科学实践中，先设计需要的蛋白质再改造出相应的基因，属于生物工程中的蛋白质工程。简单情境1.引物的应用（2022北京朝阳一模,13）PCR弓|物的3端为结合模板DNA的关键碱基5端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（）A该图表示PCR循环中的变性环节B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到5,端C.T叫酶催化相邻的dNTP间形成磷酸二酯键D.用图中引物扩增两个循环后可获得目的产物答案C图示弓I物与模板链的配对过程，为PCR循环中的复性环节,A错误扩增时,dNTP添加到核酸链的3端，同时形成磷酸二酯键,B错误,C正确;两个引物均不在模板DNA的端点，需在第三轮循环产物中才出现两条脱氧核甘酸链等长的DNA片段（目的产物）,D错误。2.细菌的防御机制（2022辽宁鞍山二模』7）（多选）CRISPR-Cas9是近年来生物学科研的热门技术.该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示，当细菌感知到噬菌体侵入时.会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述错误的是（）噬菌体DNAA.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核甘酸C.Cas9可破坏DNA分子的磷酸二酯键D.高倍光学显微镜可观察到该现象答案ABD噬菌体DNA被细菌gRNA识别并被Cas9切割过程属于特定位点的切割，不能体现基因突变的不定向性（不一定是基因突变）,A错误:gRNA为RNA.最多由4种核糖核甘酸组成.结合的目标DNA最多由4种脱氧核甘酸组成故gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核吉酸,B错误;Cas9切断目标DNA属于分子水平的改变，光学显微镜下观察不到,D错误。复杂情境3.双脱氧终止法核酸测序（2022天津一模,12）20世纪70年代,Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4个试管中分别加入4种脱氧核甘三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苗三磷酸（ddNTP）;ddNTP可以与dNTP竞争核昔酸链延长位点,并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正确的是（）引物5'i—ir+ddATP4-ddCTP+d(iCTP+ddTTPdATP,dCTP,d(；TP.d'ITP3AGTCGACCTTAG531=n|未知序列+ddATP4-ddCTP+d(iCTP+ddTTPdATP,dCTP,d(；TP.d'ITP3AGTCGACCTTAG5121110987654321A.这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶B.电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟瞟吟结尾C.测得未知DNA的序歹I」为5'-GATTCGAGCTG-A-3'D.ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核昔酸链的5,末端答案B双脱氧终止法对DNA进行测序是利用了PCR的技术原理.PCR扩增DNA需要引物和耐高温的DNA聚合酶,A错误:电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟瞟吟结尾（依据右侧的碱基判断）.B正确:以未知序列为模板,合成的子链与未知序列互补，因此未知DNA的序列为5'-TCAGCTCGAATC-3',C错误;ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核甘酸链的3,末端,D错误。复杂陌生情境4.TALEN靶向基因敲除技术（2022河南孟津一中月考一,23）TALEN技术是一种靶向基因敲除技术（原理如图1）.TALEN技术使用的基因敲除工具是由DNA识别域和核酸内切酶两个部分组成的蛋白质。科学家发现了一种细菌蛋白质（TALE）,它的二连氨基酸（NI、NG、HD、NN,其中字母N、I、G、H、D分别代表了一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系:NI识别A,NG识别T,HD识别C,NN识别G。FokI是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。因此，可以利用TALE作为DNA识别域用Fok1二聚体定点切断DNA。1)11(；3,_1)11(；3,_liaTALE蛋白左臂TALE蛋白右臂图1科学家发现水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因p,在短日照条件下均表现为雄性可育。在长日照条件下,具有光周期敏感蛋白的水稻才表现为雄性可育。基因p只在单倍体花粉细胞中表达，使其能够合成淀粉。科研人员使用TALEN技术对水稻基因P进行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品种。(1)在TALEN技术的设计中，选择使用FokI单体而不直接使用FokI二聚体，这样能减少对DNA的—切割,保证了基因敲除的靶向性。为了让TALEN技术能用于各种不同生物、不同基因的敲除.没有与TALE蛋白结合的FokI二聚体对DNA的切割应(选填"具有"或"不具有")类似于限制酶的"限制性".⑵若TALE蛋白左臂所识别的基因P的序列为"一TGACC—",则TALE蛋白左臂对应的二连氨基酸序列应为.用这种方法，可以确定TALE蛋白的氨基酸序列,进而人工合成TALE蛋白基因。然后将TALE蛋白基因与基因进行融合，得到融合基因。(3)科研人员用图2所示的质粒为载体，其中的潮霉素抗性作为标记基因，作用是.应选用酶将该质粒与融合基因构建为重组质粒，并将融合基因设法导入水稻愈伤组织中.再利用技术获得T。植株。(4)由于基因靶向敲除成功的概率比较低,因此科研人员培育To植株时应保证日照条件,待其自花受粉得到*.再将T,植株，并在开花期随机选择TB分植株的花粉进行鉴定，鉴定方法是，若观察到某植株的花粉全部未被染成蓝色，则该植株为所需的纯合光敏雄性不育新品种。(5)与传统的雄性不育水稻品种相比，光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖并保留雄性不育特性，这是因为?答案⑴三配向(或"随机")不具有NNNHH⑵一GNIDD—FokI单体（3）筛选转化成功的受体细胞BamHl及DNA连接植物组织培养（4）短在长日照下种植将花粉用碘液染色后，在显微镜下观察（5）光敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育，可实现自交繁殖;自交后代能保持基因P敲除的纯合性，使其在长日照条件下雄性不育解析（1）若使用FokI二聚体，则可在靶基因的左侧或右侧序列进行随机切割，使用FokI单体可保证基因敲除的靶向性。限制酶只在特定的核苛酸序列进行切割，为让TALEN技术能用于不同基因的敲除，没有与TALE蛋白结合的FokI二聚体需不具有类似于限制酶的"限制性"。⑵NI识别A,NG识别T,HDNNNHH识别C,NN识别G,故对应的二连氨基酸序列应GN1D为一D一.融合基因由TALE蛋白基因和Fok1单体基因融合而成，如果表达后就可以获得具有特异性识别并且切割的工具。（3）在基因工程中，标记基因用于筛选转化成功的受体细胞。选用限制酶时，不能破坏标记基因，目位于启动子和终止子之间.故需选用BamHI酶处理目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒。融合基因导入水稻愈伤组织中后,再利用植物组织培养技术获得T。植株。（4）由于在短日照条件下水稻植株有无光周