增强间充质前体细胞(mpc)的增生和／或存活的方法

　　专利名称：：增强间充质前体细胞(mpc)的增生和/或存活的方法

　　技术领域：

　　：本发明涉及包含间充质前体细胞(MPC)和/或其衍生的前体细胞的组合物，以及用于增强这些细胞在体外或体内增生和/或存活的方法。本发明还涉及用于哺乳动物体外或体内骨形成的方法。

　　背景技术：

　　：骨再造是发生在成熟骨骼(其中，骨吸收之后是新骨形成)中的持续生理过程，维持机械强度和结构。负责这种偶联过程的骨细10胞包括骨吸收细胞(破骨细胞，其来源于单核细胞/巨噬细胞系的造血细力包)和骨形成细力包(成骨细"包，其为间充质起源)。骨吸收过程在许多与风湿病学家的工作相关的临床表现中涉及到，如RA和的弥漫性骨质丢失。15石皮骨细胞激活对于病理性骨吸收如风湿性关节炎(RA)中的腐蚀或全身性骨丢失来说是一个关键的细胞过程。在诸多触发过度石皮骨细月包活性的因素中，诸如IL-1或肿瘤坏死因子(TNF)-a的细胞因子发挥主要作用。最近，已证实趋化因子-基质细胞衍生因子-1(SDF-1)促进人破骨细胞的趋化性补充、形成和存活(Wright"Bone36:840-853，2005;Zannettino"a/.，CancerRes65(5):1700-1709,2005;GrassiWo/"J.Cell.Physiol.199:244-251,2004)。趋化因子是调节各种生物反应的趋化蛋白超家族，它们促进多个种系的白细月包和、淋巴细月包补充到身体器官组织。趋4匕因子可以才艮5据该蛋白中最初两个半胱氨酸残基的相对位置分为两个家族。一个家族中，起始两个半胱氨酸由一个氨基酸残基分开，即CXC趋化因子；而另一个家族中，起始两个半胱氨酸是邻接的，即CC趋化因子。在人类，CXC趋化因子的基因群集于染色体4上(除了SDF-l基因，其已被定位于染色体10)而CC趋化因子的基因则群集于染10色体17上。趋化因子的分子靶向物是细胞表面受体。一个这样的受体是CXC趋化因子受体4(CXCR4)，其为7次跨膜蛋白，偶联于Gl并且先前^皮称为LESTR(Loetscher""/.，(1994)J.Biol.Chem,269:232-237，1994)、HUMSTR(Federsppieletal"Genomics16,707-712，151993)和融合素(FengW"/.，Science272:872-877,1996)。CXCR4在造血源细胞上广泛表达，并且是用于人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的CD4+的主要辅助受体(Fenge/"/.，Science272:872-877，1996)。目前唯一已知的用于CXCR4的天然配体是SDF-1。基质细胞衍生因子-la(SDF-la)和基质细胞衍生因子-lp(SDF-lp)是密切20相关的蛋白(在本文中，共称为SDF-1)。SDF-la和SDF-1(3的天然氨基酸序列是已知的，如同编码这些蛋白的基因组序列一样也是已知的(美国专利第5,563,048号和美国专利5,756,084号)。SDF-1的3-维晶体结构已#皮描述(Crump""/.，EMBOJ.16:6996-7007,1997)。SDF-1的结构-活性分析表明，尽管N-末端残基251-8或l-9在受体结合中涉及到，但是单独的1-8和l-9肽并没有表现出可指示受体结合的体外活性，支持所报道的结论，即，所述肽并不呈现对于结合至受体必要的构象。这个结果可以表明，蛋白质骨架的其余部分和/或蛋白质中其它位置的各种通用的受体结合位点对于介导结合至受体的N-末端的构象要求非常重要(Crump""/.:EMBOJ.16:6996-7007，1997)。基于这些结果，已经才是出了SDF-15结合至CXCR4的两位点模型，涉及残基1-17中的两个结合位点，N-末端位点和上游RFFESH位点(CrumpW"/.,EMBOJ.16:6996-7007,1997)。两个公认的结合位点通过CXC基序(其表征整个CXC趋化因子家族)接合。经鉴定，这两个公认的结合区域在其它CC和CXC趋化因子也4艮重要(CrumpWa/.，EMBOJ.16:106996-7007，1997)。这与以下发现一致尽管多种趋化因子的N-末端区域对于受体激活是关键的，但是已有报道表明除SDF-1以外的趋化因子的N-末端肽缺少受体结合活性并且不是受体激动剂(CrumpWa/"EMBOJ.16:6996-7007，1997)。当移植入免疫缺陷小鼠时，出生后的人骨髓间质干细胞15(BMSSC)或间充质前体细月包(MPC)具有再生支持造血的骨髓器官和相关骨小梁的負t力(Friedensteina/.ExpHematol.6:440-444,1978;Kuznetsova/.JBoneMinerRes.12:1335-1347，1997;Pittengera/.Science284:143-147,1999;Biancoa/"StemCells19:180-192,2001;GronthosWJCellSci.116:1827-1835,202003)。最近的研究也已报道借助于其可形成各种细胞系，如脊髓支持基质、成骨细力包、豸t骨细"包、脂肪细力包、成"几细力包、肝细月包、心肌细胞以及神经细胞的能力，BMSSC比最初认识的更具可塑性(LiechtyNatMed.6:1282-1286,2000;Zhao"ExpNeurol.174:11-20，2002;Verfailliea/.AnnNYAcadSci.996:231-234，252003)。这些进展已促进深入研究体外扩增的BMSSC种群在骨再生的中可能应用。然而，由于缺乏对调节人类多能BMSSC的生长和存活以及这些细胞最终发育成骨的关4定因子的理解，这些研究的进展受到很大程度的限制。发明内容现在，本发明人已将SDF-1鉴定为一种差异性表达的基因，其在培养之前由纯化的BMSSC高度表达。更具体地，本发明人已发现，当与代表成骨细胞和骨细胞/骨衬细胞的成熟细胞类型相比时，5体外培养的未成熟成骨细胞表达较高水平的SDF-1。此外，当BMSSC在骨诱导性条件下培养时，SDF-1的表达^皮快速下调。研究还表明，BMSSC表达功能性的细胞表面SDF-1受体(CXCR4)。相比于对照BMSSC系，转导的BMSSC系(分泌高水平SDF-1)表现为体内形成异位骨的能力增强。此外，高表达SDF-110的BMSSC表现为细胞生长和防止白介素-4诱导的凋亡的能力增强。类似地，在体外血小板源生长因子BB(PDGF-BB)和SDF-1的协同作用下，成纤维细月包集落形成单位(CFU-F)也表现出生长增强以及对a-干扰素-2a-诱导的凋亡的抗性。这些发现表明，趋化因子SDF-1在未成熟BMSSC种群的增生、15存活以及成骨能力中发挥作用。因此，本发明提供了一种增强间充质前体细胞(MPC)或其衍生后代的增生和/或存活的方法，该方法包4舌将所述MPC或后4戈暴露于SDF-1或其类似物。本发明还提供了一种形成组织特异性定型细胞种群的方法，该20方法包4舌以下步骤将MPC或其衍生后代与SDF-1或其类似物相接触，以增强所述MPC或后4戈的增生和/或存活；以及使所述增生的种群处于使该MPC或其衍生后代的分化偏向于特异性组织类型的条件下。本发明还提供了一种已经过遗传修饰以过表达SDF-1或其类似物的MPC或其书亍生的前体细月包。本发明还提供了一种组合物，其包含根据本发明的转染MPC种群。5本发明还提供了一种组合物，其包含MPC或其衍生后代以及SDF-1或其类4以物。本发明还提供了一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将受治者中的MPC或其彩f生后4戈暴露于外源性SDF-1或其类似物。本发明还提供了一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将本10发明的组合物在预期的骨形成部位处给予该受治者。图1:来源于培养的MPC细胞JL^达STRO-lb"或STRO-ldim的细胞的基因表达镨。体外扩展的骨髓MPC单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理加以制备。细胞利用STRO-l抗体染色，随后通15过用羊抗鼠IgM-荧光素异石克氰酸盐(酯)孵育显示。在荧光激活的细胞分选之后，总细胞RNA制备自表达STRO-lbfi或STRO-ldim的细胞纯化种群(A)。利用RNAzolB提取方法和标准步骤，将总RNA分离自每个亚群并用作cDNA合成的模板。各种转录体的表达利用如前所述(GronthosWa/.JCellSci.116:1827-1835,2003)的标准20流程通过PCR扩增进行评估。用于本研究的引物对示于表2中。扩增之后，每种反应混合物通过1.5%琼脂凝胶电泳进行分析，并通过溴化乙锭染色使其可视化(B)。利用ImageQant软件，参照管家基因(GAPDH)的表达对每种细胞标记物的相对基因表达进行评估(C)。图2:来源于骨髓MPC的体外扩增细胞的免^A型表ii^式。来源于骨髓MPC的体外扩增细胞的单细力包悬浮液通过力夷蛋白酶/EDTA而制备，接着用STRO-l抗体以及鉴定广泛范围的细胞系相关标i己物的抗体孵育。STRO-l利用羊抗-鼠IgM荧光素异^危氰酸盐5(酯)加以鉴定而所有其它标记物利用羊抗-小鼠或抗-兔IgG-藻红蛋白加以鉴定。对于那些鉴定胞内抗原的抗体，细胞制备物首先用STRO-l抗体进行标记，用冷的70%乙醇固定以透过细胞膜，然后利用胞内抗原特异性的抗体进行孵育。在相同条件下使用匹配的同型对照抗体。利用COULTEREPICS流式细"包4义实施双色流式细月包10计数分析并收集列表模式数据。点图代表5,000个列表模式的表示用于每个种系细胞标记物(y-轴)和STRO-l(x-轴)的荧光素强度水平的情形。垂直和水平象限参照匹配的同型阴性对照抗体而建立。图3:体外成脂发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来15源于STRO-lbVCAM-l+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光素激活的细胞分选，将扩增的细胞根据其STRO-l表达进行分离，如图1A所示。然后，STRO-lb"和STRO-ldim分选的MPC衍生细胞在常规生长培养基中，以1x105个细胞/孔的密度铺于6孔板中过夜。第二天，将培20养基用如在方法中所述的成脂诱导性培养基替换。此后，将培养基每周补充两次，共计三周，此时固定该细胞并用油红O进行染色。本图示出了4氐(4x)和高(20x)功率》文大以描述含有遍布粘附性间质层中含有脂质的脂肪细胞的油红O染色。与STRO-l^培养物中7±2脂肪细胞(20x的每单位面积，n-9个视野)相比，在STRO-lbri25培养物中鉴定了平均22±5个油红O阳性脂肪细胞(20x的每单位面积，n-9个^L野)。图4:体外成骨发育。单细胞悬浮液通过乂人来源于STRO-lbri/VCAM-l+分选的骨髓细胞的细胞的物胰蛋白酶/EDTA消化来生成。然后利用单色荧光素激活的细胞分选(FAC)将的细胞根据其STRO-l的表达加以分离。然后将STRO-lbri和STRO-ldim5FACS分离的细胞在常生长、以0.3Xl()S细胞/孔的密度48孔板中过夜(每个条件重复4次)。天，将培养如在方法中所述的成骨"i秀导替。将培养物每周两次，三周，洗涤该细胞，然后用0.6NHCL处理以l是取矿化中的4丐。将样品与o-曱酚-酞-配位酮比色反应在570nm处读。绝对4丐浓度根据钙的标准曲线来确定。(A)钙测量值10表明，相比于STRO-ldim培养物，STRO-lbri培养物合成显著(*;p<0.05;t-才t验)多矿物。培养物并用茜素红染色加以染色以描述在STRO-lbri(B)和STRO-ldim(C)培养的粘附层中矿4b沉的典型水平。图5:体外软骨发育。单细胞悬浮液通过从来源于STRO-1bd/VCAM-1+分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的继代培养15物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光激活的细胞分选(FACS)，根据其STRO-l的表达分离该扩增的细胞，如图1A所示。然后将STRO-lbri和STRO-ldimFACS分离的细胞以2.5x105个细胞/管的密度成团于聚丙烯管中并在软骨形成诱导性培养基中培养。此后，将该培养物每周补充两次，共计三周。回收细胞团并20用于组织学检查或如方法中所述的总RNA制备。STRO-lbri(A)和STRO-ldim(B)细胞种群均能够形成含软骨细胞样细胞的细胞团。RT-PCR分析表明，相比于STRO-ldim(SD)细胞种群，STRO-lbri(SB)种群显示出较高水平的软骨相关基因X型胶原和聚集蛋白聚糖(来自软骨)(C)。25图6:STRO-lBri细胞诱导STRO-ldi""细胞增生。体外扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理加以制备。细胞用STRO-l抗体进行染色并分选为表达STRO-ldim或STRO-lbfi的培养细胞种群，如图1中所述。细月包用如方法中所述的CFSE加以标记。未标记的细月包用来建立阴性对照(自体荧光)。利用Colcemid(100ng/ml)来抑制细胞分裂并4是供一个总标记指数(0代)。随后将未标记的STRO-lbri以(A)0STRO-lbri个细胞:lx1055STRO-ldim个细胞(0%);(B)0.05xl05STRO-lbri个细胞:0.95x105STRO-ldim个细胞(5%);(C)0.1xl05STRO-lbri个细胞:0.9xl05STRO-ldim个细胞(10%);(D)0.2xl05STRO-lbri个细胞:0.8x105STRO-ldim个细胞(20%);(E)0.5xl05STRO-lbri个细胞:0.5x105STRO-l紐个细胞(50%)的比率力口回到CFSE标记的STRO-ldim10细胞中。将该补加的混合物培养7天，收集，并通过如方法中所述的流式细胞仪进行分析。利用用于win32的ModFitLT(2.0版)来分析细胞增生，发现STRO-lb"细胞(Rl)以剂量依赖性方式刺激STRO-ldim细胞的增生。图7:细胞因子和成骨性试剂增加培养物中的STRO-lbfi细胞15的数量。将已建立的MPC培养物在补充了10%FCS(A)，或一系列因子(包括lxl0-8Mla,25-二羟维生素D3(1,25D)(B);10ng/ml血小4反源生长因子(PDGF)(C);10ng/ml瘤坏死因子-a(TNF-a)(D);10ng/ml白介素-1|3(IL-1卩)(E)以及30ng/ml间质细胞衍生因子l-a(SDF-la)(F))的基础培养基中培养5天，用STRO-1mAb20染色并如上所述进行分析，发现这些因子增加STRO-lbriMPC的数量。示出的结果是3次独立实-验的代表性实例。图8:将无胸腺净果大鼠进行冠状动脉左前降支(LAD)结扎并于48小时后注射盐水、lxlO6个人STRO-ldim细胞、lxlO6个人STRO-lb"细胞或lxl()S个人Stro-l-缺失的骨髓单核细胞。两周后，25杀死动物，固定心脏组织，同时用两种单克隆抗体加以染色第一种抗体与大鼠(而不是人类)Ki67抗原选择性反应，第二种抗体与心肌细胞标记物肌钙蛋白I反应。双重染色的细胞(表示增生的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或lx106个STRO-ldim人细胞的对照动物，接受lx106个STRO-lbri人细胞的动物表现为增生的大鼠心肌细胞呈2.5-5倍较高的f史量(p<0.05)。5图9:将无胸腺棵大鼠皮下注射大鼠成胶质细胞瘤细胞，其构成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、0.5x106个人STRO-ldim细胞或0.5x106个人STRO-ldim细胞。一周后，杀死动物，固定瘤症且织，同时用两种单克隆4元体加以染色第一种4元体与a-平滑肌肌动蛋白抗原(由平滑肌细胞表达)反应，而第二种抗体10与vWF抗原(由脉管内皮细胞表达)反应。双重染色的结构(表示含有内皮和平滑肌的小动脉和动脉)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或lxl06个STRO-lbri人细胞的对照动物，接受0.5x106STRO-lbri个人细胞的动物在瘤内细胞注射的部位表现为小动脉和动脉呈3.5-8倍的较高数量(p<0.05)。在注射了人细15力包的远端部位处未观察到差异。图10:IL-ip增加从MPC扩增的细胞的增生能力。如方法中所述，将细胞用CFSE进行标记，随后在10ng/mlIL-lp存在的情况下将细胞培养5天，用STRO-l和ALKPHOSmAb力。以染色并如上所述进行分析。(A)未处理的(NT)和(B)IL-lp处理的培养20物表现出STRO-lbri/ALP阳性细胞数量的增加。这种STRO-l表达的增加伴随着如(C)中所示的细胞增生的增加，其中未处理的培养物经历了四次细胞分裂，同时(D)IL-lp处理的培养物通过增加STRO-lbri骨原细胞的数量而表现出细胞分裂次数增加。示出的结果是3次独立实验的代表性实例。当1,25D、PDGF-BB、TNF-a、IL-1卩25以及SDF-1用来刺激MPC时，也可得到类似结果。图11:在成骨i秀导剂(地塞来忪，desamethasone)存在的'清况下，IL-ip刺激MPC增生并且增强其骨形成能力。将人(A)体外扩增的MPC后代以2,000个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板中并在a-MEM-10中培养。培养基补充了指定浓度的IL-1|3,并且如在方法中所述，利用WST-1对细胞数和生存力进行进量。浓度为0.01ng/ml的IL-lp显著将细胞数增至未处理对照培养物的5136.6±1.2%(D，P=0.000003，学生t-冲企-睑)。在大于0.1ng/ml的浓度下获得平台效应。数值表示每个浓度的三次重复培养物的平均值士SEM。(B&C)将体外扩增的MPC后代以5xl0V孔的细胞密度三份平行接种于24孔板中，并在成骨诱导性条件下(如方法中所述)进;f于培养。该细月包用浓度为10ng/ml的IL-1卩处理，并且;咅养物每10周补充含有IL-ip的新鲜培养基。从基质中释放的游离钙通过如方法中所述在酸性条件下处理粘附细胞而获得。将样品与邻曱酚-酞配位酮反应，并且该比色反应在570nm处读数。绝对钙浓度4艮据钙的标准曲线来确定。结果表明，相比于未处理的细月包(B)，矿物:沉积在用IL-1J3处理的细胞中增加(C)。在IL-1|3处理的细胞中，4丐水15平在第4周(**尸=0.00009，学生t-#r-验)和第6周(**尸=0.00004,学生t-4企验)均显著高于未处理的细胞(D)。示出的结果是3次独立实-验的代表性实例，其中利用来源于三个不同供体的基质细胞。图12:IL-ip刺激STRO-lb"MPC增生，而地塞iM^i秀导碱性磷酸酶(ALP)表达。将已建立的人MPC培养物以3xlOV孔的细20胞密度4妾种到(A)无补充物(NT)、补充了(B)10ng/mlIL-1卩或(C)lxl(r8]M地塞米+》以及(D)10ng/mlIL-ip和1x10'8M地塞米松的完全培养基的24孔板中。将细胞如方法中所述培养21天。结果表明，IL-ip的促有丝分裂作用用于增加STRO-lbriMPC的数量(B)，后者又刺激STRO-ldim细胞的增生(参考图6)。另夕卜，25MPC响应存在于生长培养基中的FCS和抗坏血酸盐-2-磷酸盐而获4寻ALP表达，ALP表达在响应于泮唐皮质5敫素(glucocorticosteroid)地塞米松(dex)时被增强(D)。IL-ip和dex的组合作用用来增强骨形成，如图11所示。实验进4亍三次并且在来源于三个不同供体的MPC中观察到相似的趋势。图13:PDGF对体内骨形成的作用。将来源于STRO-lbVCAM-l+分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的半铺满继代5培养物在PDGF-BB(10ng/ml)存在或不存在的情况下培养5天。单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA消化形成，然后如方法中所述利用用于植入的40mg羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)在免疫缺陷小鼠中进行孵育。8周后，将获得的植入物固定并加以处理用于组织学检查。新骨形成的分析利用Scion成像软件根据三个重复植10入物的每个表面积(20x)来确定(A)。相比于未处理的对照培养物，用PDGF-BB预处理的培养物显示出显著(*;pO.05;t-检验)较多的异位骨形成。示出的典型图片以横截面描述苏木精/伊红染色的异位骨，代表未处理的(B)和PDGF处理的(C)移植物。图14:BMSSC表达高7JC平的SDF-1。(A)将STRO-1+MACS15分离的BMMNC制备物利用FACS，根据区域STRO-l亮和STRO國l暗划分成不同的STRO-l亚群。总RNA从每一个STRO-l亚群制备并用来构建如在"材并牛和方法"中所述的STRO-l*差减杂交库(subtractionhybridizationlibrary)。(B-C)重复的硝。化纤维滤月莫，其已利用代表性PCR产物进行印迹(blot),该产物从STRO-l亮扣20除cDNA转化的细菌克隆体扩增。然后利用[32P]7三磷酸脱氧胞苷酸(dCTP)标记的STRO-l*(B)或STRO-l*(C)扣除cDNA对该滤膜进行探测。箭头表示含有对应于人SDF-1的cDNA片段的l个克隆体的差异表达。(D)逆转录斷RT)-PCR分析显示了SDF-1和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)转录体在总RNA中的相对表达，25该总RNA乂人i咅养前的MACS/FACS新鲜分离的BMMNCSTRO-l种群制备。bp表示碱基对。图15:未成熟的BMSSC比成熟的种^^达更高水平的SDF-1。(A)点图表示体外扩增BMSSC的单细胞悬浮液的双流式细胞计数分析，其考查在标准培养基中培养后细胞表面STRO-l和AP抗原表达。不同的分选STRO-1/AP亚群才艮据分选区域Rl、R2、R35和R4利用FACS加以分离。(B)该图描述了在总RNA中，相比于管家基因GAPDH,SDF-1相对表达的半定量RT-PCR分析，其中该总RNA从未分选的以及才艮据其STRO-l和AP的细胞表面表达而用FACS分离的培养BMSSC种群制备。最不成熟的成骨前体种群(STRO-l+/AP-)比前成骨细胞(STRO-1+/AP+)表达较高水平，依10次是4交成熟的成骨细月包(STRO-17AP+)和骨细"包(STRO-17AF)种群。数据表示利用从2个不同健康骨髓供体建立的继代BMSSC培养物的2次独立实-验的平均值士标准差。图16:骨i秀导后，SDF-1由BMSSC下调。(A)通过在骨i秀导性培养基长时间存在的情况下培养的BMSSC表达的SDF-1，相15对于GAPDH的半定量RT-PCR。平均值士标准差表示4次独立实验。成骨i秀导性条^f牛与只于应的只十照在每个时间点以p<0.05的显著性直(*)利用成对t检验进行分析。(B)点图表示根据STRO-l和碱性磷酸酶抗原的细胞表面表达，体外扩增BMSSC的单细胞悬浮液的双色流式细胞计数分析，其在成骨诱导培养基存在的情况下培养4820小时。图17:BMSSC表达功能性SDF-1受体。(A)RT-PCR分析表示总RNA中的CXCR4和GAPDH转录体的相对表达，该总RNA从原代BMSCC培养物或人骨肉瘤细胞系(MG63)分离。(B)培养BMSSC的单细胞悬浮液利用小鼠抗-人CXCR4抗体或匹配的同25型对照抗体1A6.11随后用羊抗-小鼠IgG,的FITC轭合抗体进行孵育。代表性的柱状图表示相对于对照样品(点线)，通过流式细胞计数分析评估BMSSC的CXCR4(实线)细胞表面表达水平。(C)该图表示在加入人重组SDF-la(30ng/mL)后，在长时间的原代BMSSC培养物中测得的胞内钩水平。图18:BMSSC的SDF-l加强表达增强其成骨能力。(A)逆砵争录病毒包装系PT67用来利用含人SDF-lcDNA或Y义含载体的5pLNCX2构建体转导来源于3种不同骨髓吸出物的继4戈BMSSC培养物，G418篩选后产生稳定的多克隆起源的高表达SDF-l的BMSSC和相应对照系。利用商业上可获得的ELISA试剂盒来评估组织培养物上清液的三次重复样品的SDF-la水平。数据表示从3个不同的高表达SDF-l的BMSSC细胞系相对其对应对照产生的平10均值士标准差。(B)每个转导的BMSSC系的单细^<悬浮液与羟石粦灰石(HA/TCP)颗粒混合，然后皮下植入NOD/SCID小鼠。图片表示8周龄收集的新骨移植物的横截面(b)，由经苏木精和伊红染色的高表达SDF-l的BMSSC(SDF-l)和对照细胞系(LNCX2)所形成(x200)。这些图片是利用装配有OlympusDll数码相机的15OlympusBX50光学显孩丈4竟(Olympus,Tokyo,Japan)4甫获的，i文大200倍。(C)每个图表示来源于3个不同骨髓供体的不同高表达SDF-l的BMSSC系和相应的只于照细月包系。新骨形成的水平表示为利用Scion成像軟件从12个代表性组织切片分析的总组织表面积的百分比。该^:据表示来自两次重复的移才直物的平均4直士标准差。高20表达SDF-l的BMSSC系和相应对照之间的p<0.05的统计学差异(*)利用非成对t才企-验来确定。图19:BMSSC的SDF-l表ii^强促进细lfe^活。(A)将高表达SDF-l的BMSSC和载体对照细胞系以5乂103个细胞/孔的密度铺于96孔板的三个重复孔中，在常规生长培养基中培养达5天，25而实施增生研究。然后通过胰蛋白酶/EDTA消化而制备单细胞悬浮液，并计数评估细胞总数。(B)在白介素4(IL-4;30ng/mL)存在的情况下建立平行培养物，凋亡细l包的百分凄t通过利用台盼蓝排除法测定。(c)该柱状图表示相比于匹配的同型对照抗体(点线)，在IL-4存在的情况下培养的对照细胞系的细月包表面膜联蛋白V(annexinV)染色的水平(实线)。示出的代表性图片是活细胞上原位荧光染色的强度(x100)。(D)该柱状图表示相比于在IL-4存5在的情况下培养的匹配的同型对照(点线)，高表达SDF-1的BMSSC系的细胞表面膜联蛋白V染色的水平(实线)。示出的代表性图片是活细月包上原位焚光染色的强度(x100)。数据表示三次重复实-验的平均j直土标准差。在高表达SDF-1的BMSSC系和相应对照之间的p<0.05的统计学差异(*)利用非成对"企-验来确定。10图20:SDF-1促进CFU-F的生长和存活。对来源于MACS/FACS分离的STRO-l*BMMNC(铺于在不同细胞因子组合存在的情况下的无血清培养基中)的CFU-F集落的总^t进行计凄t。重组人PDGF-BB、SDF-la和ot-干扰素2a的最佳使用浓度分别为5ng/mL、30OOOIU/mL和30ng/mL。数据表示三个重复孔的平均值士15标准差。利用3种不同骨髓吸出物可获得类似结果。所有处理的统计学显著性(pO.l)通过利用单向ANOVA而确定。然后利用Fisher试马全来确定所有组之间的差异。相比于单独的PDGF-BB(*)，所有处理均发现显著性差异(P<0.05)，并且在PDGF+的IFN(干拔^素)与PDGF+SDF-1+的IFN(**)之间也发现P<0.05的显著性。20图21:SDF-1以剂量依赖性方式保护CFU-F形成免于IFN-oc的凋亡作用。将STRO-lMACS选4奪的人骨髓单核细胞的铺入仅存在PDGF(5ng/ml)或PDGF和IFN-a(30,000i.uhttps://www.xjishu.com/zhuanli/02/ml)或者存在PDGF和IFN-a以及SDF-1(0.1-100ng/ml)的无血清培养基中。培养14天后，将该板固定并如方法中所述进行染色用于CFU-F集落计数。25具体实施例方式本发明的发明人得到了惊人的发现，即趋化因子SDF-1在未成熟BMSSC种群的增生、存活以及成骨能力中发挥作用。因此，本发明提供一种增强间充质前体细月包(MPC)或其彩亍生后^的增生和/或存活的方法，该方法包4^1寻该MPC或后^暴露于5SDF-1或其类^以物。如本文所使用的，MPC是能够形成大量多能细胞集落的非造血祖纟田胞。在本发明的一个优选实施例中，该MPC只于选自由STRO-l亮、VCAM-1亮、THY-1亮、CD146亮和STRO-2亮组成的组中的至少一种10标记物呈阳性。当在本文中使用时，术语"亮(bright)"指的是在细胞表面上的标记物，在可检测地标记时其可产生相对较高的信号。同时不希望受限于理论，提出了"亮"细胞比样品中的其它细胞表达更多的靶标记蛋白(例如,由STRO-l识别的抗原)。例如，当用FITC轭合的15STRO-l4元体标i己(々口通过FACS分才斤所确定的)时，STRO國l亮细胞相比非亮细胞(STRO-l^es)产生较高的荧光信号。优选地，"亮"细胞构成含于起始样品中最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%。在其它具体实施方式中，"亮"细胞构成含于起始样品中最亮标记的骨髓单核细月包的至少约0.1%、至少约0.5%、至少约1%、至少约201.5%或至少约2%。优选地，该"亮"细胞是STRO-l亮、VCAM-1亮、THY-1亮、STRO-2亮和/或CD146亮纟田月包。如在WO01/04268中讨i仑的，基于标记强度选择的细胞亚群如STRO-l亮细胞比单独基于细胞标记物的阳性/阴性鉴定所选择的亚群具有较大比例的MPC。在本发明进一步的优选实施例中，MPC携带至少两个标记物，25该标i己物选自由只寸间充质前体细月包特异的STRO-lb"、LFA-3、THY-1、VCAM画1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、p-l整合素、6-19、血栓调节素、CDIO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF國R、IGF1-R、NGF画R、FGF陽R、瘦素-R(STRO-2=瘦素陽R)、5RANKL和CD146等表面标记物或这些标记物的任意组合组成的组。在本发明的进一步优选实施例中，该MPC对选自由CD34、CD14、CD45、CBFA-1、II型胶原、PPARy2以及血型糖蛋白A组成的组中的至少一种标i己物呈阴性。10用于制备富含MPC种群的方法在WO01/04268和WO2004/085630中有描述。在体外环境中，MPC4艮少以绝对纯的制品存在，通常与作为组织特异性定型细胞(TSCC)的其它细胞一起出现。WO01/04268提及以约0.1%至90%的纯度水平从骨髓收集这样的细胞。可替换15的》]欠集方法可能导致MPC比例以4交〗氐7K平存在。包含MPC的种群(本发明的方法适用于此)可以直接从组织源收集，或可替换地其可以是已在体外扩增的种群。例如，本发明的方法可以被适用于已收集而未扩增的基本上纯化的MPC种群，构成它们存在于其中的种群总细胞的至少约0.1、201、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95%。这个JC平可通过例如选才奪对选自由STRO-l亮、VCAM-1亮、THY-1亮、CD146亮和STRO-2亮组成的组中的至少一种标记物是阳性的细胞来实现。MPC可以来源于在WO01/04268或WO2004/085630中才是出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、月旨肪组织和皮肤，或可能更广泛地来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛嚢、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱以及骨骼肌。这样的细胞的优选来源是人，然而，期望本发明也可适用于动5物，包括家用动物如奶牛、羊、猪等，家畜如狗和猫，实-睑动物如小鼠、大鼠、仓鼠和兔，或用于运动的动物如马。如本文所使用的，术语"后代"用于指起源于MPC的细胞。该后代可以是前体细胞或完全分化的细胞(如骨细胞)。在一个优选具体实施方式中，所述后代是一种前体细胞。10如本文所使用的，起源于MPC的"前体细胞"是一种部分专化或组织特异的定型细力包，其分裂并获得分化的细力包。尽管前体细月包定型于一种分化途径，但是其通常不表达成熟而完全分化细胞的标记物或充当成熟的完全分化的细月包。因此，前体细胞产生相关类型的细胞，^f旦是在其常^见状态并不产生多种细胞类型。前体细胞趋于15定型至一种细月包或症且织系类型，然而它们可以是双能的(bi-potential)，即能够进一步分化成两种不同细胞或组织类型中的一种。前体细胞可以;波定型至其的直系后代的非限制性实例包括骨前体细胞；肝祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神20经元限制性细力包，其可产生发展为少突爿交质细胞和星形^交质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，其发展为神经元；用于心月几和心肌细胞的前体、分泌血糖感应胰岛素的胰腺p细胞系。其它定型前体细胞包括但不限于软骨细胞、成牙质细胞、产生牙质和软骨细胞以及下列细胞的前体细胞4见网膜色素上皮细胞，成纤维细胞、皮肤细25胞如角化细胞，树突细胞，毛嚢细胞，肾管上皮细胞，平滑肌和骨骼肌细胞，睾丸前体，脉管内皮细胞，肌腱、韧带、软骨、月旨肪细胞，成纤维细胞，髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、脉管、上皮、神经月交质、4中经元、星形月交质和少突月交质细月包。前体细月包还包括那些特异导致产生结締组织包括脂肪、蜂窝(areolar)、骨质、5寿欠骨、弹性和纤维结締组织的细;9包。在本发明的一个优选实施例中，该前体细月包是骨前体细月包。如本文所使用的，"骨前体细胞"是能够分化或扩增为成骨细胞的4壬<可细力包。优选的骨前体细力包包i舌骨3且细力包和前成骨细月包。通过本发明的方法实现的增生增强可以引起MPC凄t量相对于10未受刺激的对照增加超过10、20、30、40或50o/d。可替换地，该增加可以达l倍、2倍或更多倍。在本发明的一个优选实施例中，SDF-1类似物是一种激活CXCR4信号转导的配体。该SDF-1类似物可以是例如天然存在的SDF-1的生物学活性片l殳、变异体或书于生物。15在本发明的一个进一步优选实施例中，该SDF-1类似物选自由HIV-1夕卜壳蛋白gpl20、AMD3100(AnorMEDInc,BritishColumbia,Canada)和ALX40-4C(AllelixBiopharmaceuticalsInc，Canada)组成的组。在本发明的一个进一步优选实施例中，该MPC或其书f生后代20也被暴露于一种刺激因子，其选自由外源性血小板源生长因子(PDGF)、干细月包因子(SCF)、Fit3配体(FL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、la,25-二羟维生素D3(1，25D)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)以及白介素-lp(IL-l卩)组成的组。通常考虑的是，本发明的方法具有对细胞的体外培养(例如，对于新鲜收集或体外扩增的培养物)的适用性，然而，当MPC或其书f生后代位于人体组织部位的原位且外源性SDF-1或其类似物被递送至该部位时，本发明也具有适用性。一次这才羊的递送可能是5足够的，然而，短暂而间隔的递送提供的益处可能会加速或更大。-该外源性SDF-1或其类合乂物可以以多肽的形式或以可表达产生多肽的核酸形式给予受治者。例如，该外源性SDF-1或其类似物SDF-1或其类似物的宿主细胞的形式给予。10在体外递送的教导中，递送(与SDF-1或其类似物同时)包含MPC或其衍生后代的组合物也可能是理想的。例如，在骨、心肌、脉管组织或内皮细胞损伤的情况下，被递送的后代优选至少部分定型至一种相关细月包型(例力口，成骨细月包、心月几细月包或内皮细月包)。这些可以作为一种混合前体细月包培养物的部分或以更纯的形式(例15如，已才艮据在组织特异性定型细月包型上存在的已知标记物进4亍分选的)而提供。可替换地或另外，被递送的组合物可以包括一种或多种分化刺激因子以使存在于该组合物中或原位存在于一种或多种感兴趣组织类型的靶位点处的MPC分化。本发明还4是供一种使组织特异性定型细胞种群分化的方法，该20方法包括「将MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物，以增强该MPC或后的增生和/或存活，以及4吏该增生的种群处于4吏该MPC或其4汙生后的分^*偏向于一种特异性组织类型的条件下。该纟且织类型可以选自由心月几、^脉管《且织、成骨细月包、成牙质细月包、骨细月包、骨^H"细J包和内皮细月包《且成的《且。用于体外i咅育这些ia织类型以及用于这些组织类型体外发育的示例性条件对于本领域的熟练4支术人员是已知的。5上述方法可适用于骨骼力几、心"几、骨、牙或力永管组织的生成或修复。尤其是，该方法可以适用于选自由心肌、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、^s皮骨细胞、成牙质细胞、成牙專t骨细胞、骨细胞、骨冲于细月包、骨駱月几细月包、月永管内皮细J包、骨骨逸基质、石皮骨和造血支持基质、心肌、骨骼肌、内皮细胞和脉管细胞组成的组的细胞或组io织的形成或Y奮复。在一种具体实施例中，本发明提供了一种用于体外成骨的方法，i亥方法包4舌将MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物，以增强该MPC或后^C的增生和/或存活，以及15-使该增生的种群处于〗吏所述MPC的分化偏向骨前体细力包的条件，或处于骨前体细胞的分化偏向骨的条件下。使MPC或其衍生的骨前体细胞的分化偏向骨的条件可涉及例如在补充了10%FCS、lOOpML-抗坏血酸盐-2^粦酸盐、地塞米+>1(T7M和3mM无才几磷酸盐的aMEM中的培养。这些条件已^皮证实20"i秀导人BM间质细月包在体外发育成一种矿化的骨基质(Gronthoswa/.，S4:4164-73,1994)。在一个可替4灸的实施例中，该方法可以涉及骨前体细月包通过在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙蛋白或骨粘连蛋白存在的情况下培养骨前体细胞而分化成成骨细胞。在25一个具体实施例中，骨前体细胞在I型月交原、纤维蛋白原以及纤維蛋白存在的情况下进行培养。在一个可替换实施例中，骨前体细胞在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、骨钙蛋白以及骨粘连蛋白存在的情况下进行培养。在该方法中，I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钧蛋白或骨粘连蛋白可以单独使用或5在生长因子存在的情况下使用。应当理解，本段以上列出的化合物的任意组合也属于本发明的构思范围。本发明还提供一种组合物，包含分离的MPC或其衍生后代以及SDF-1或其类々以物。在一个优选实施例中，该组合物包含基本上纯的MPC或后代，10其构成该组合物总细月包的至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95%。在一个进一步优选实施例中，该SDF-1或其类似物以约O.lnM-O.lM、0.1nM-0.05M、0.05nM陽15(xM或O.OlnM-lO(xM的浓度存在于所述组合物中。15本发明还提供一种已经过遗传修饰以过表达SDF-1的MPC或其衍生后代。在一个实施例中，该MPC或其书f生的前体细胞用编码SDF-1的多核苷酸加以4争染。在另一个实施例中，该MPC或其衍生的前体细胞的基因组被20修饰，以实现所述SDF-1蛋白的过表达。在一个实施例中，该MPC或其书f生的前体细胞的SDF-1基因的一个调节区#:>修饰以实现SDF-1蛋白的过表达。本发明还提供了一种组合物，包含根据本发明的转染的MPC种群。本发明的该组合物可以进一步包含一种或多种其它刺激因子。例如，所述其它刺激因子可以选自由PDGF、SCF、FL、G-CSF、5IL-3、IL-6、1，25D、TNF-a和IL-lp组成的组。本发明涵盖的递送系统，其中本发明的组合物(例如包含遗传1奮饰的MPC的组合物)^皮系统纟合予或局部给予以定^f立于选定的组织类型，例如损伤的组织。例如，本发明组合物可以直接注入靶组织。注射部位优选在损伤部位或该损伤组织附近。可替换i也，表达10SDF-1以及特异性重组配体或受体的遗传修饰的MPC可以;故引入受治者，然后该细月包通过i秀导輩巴组织中的同源结合4半侣表达而革巴向于希望的^i且织。应当理解，本发明的组合物对于增强用于^奮复或再生组织(例如，由于缺血或在再灌注相关损伤而凋亡的心;i几细^^;在骨、韧带、15肌腱或软骨的创伤性损伤后的软骨细胞；或在醇诱导性肝硬化中的肝细胞)的移植MPC或其衍生细胞的存活很有用。在一个具体实施例中，本发明的组合物对于增强用于》f复或再生骨的移植MPC或其衍生细胞的存活很有用。因此，本发明的组合物可以进一步包含一种基质，如可吸收的明胶、纤维素或胶原。20该组合物可以以海绵状、条状、粉末、凝胶或网状物的形式加以利用。本发明还提供一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将所述受治者中的MPC或其彩f生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。本发明还提供一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将本发明的一种组合物在需要骨形成的部位给予所述受治者。该方法可以用于例如骨的》务复，并且同才羊i也，本发明的一种纟且合物以及可选的，一种合适载体(support)可以-故引入到一个需要5骨形成的部位。因此，例如，由骨损伤或患肿瘤的骨的部分去除引起的骨骼缺损可以通过将本发明的组合物植入该缺损部位而进行修复。这样的缺损包括例如节段性骨缺损、不愈合、骨连接不正或愈合延迟、嚢肿、胂瘤、坏死或发育异常。需要骨增加(如关节重建、创面重建或者骨融合例如脊骨融合或关节融合)的其它病症，10可以通过将本发明的一种组合物给予至需要增加的骨部位内部而在个体中进行治疗。该组合物可以与例如可再吸收的生物聚合物如明胶、纤维素或胶原基的介质联合应用，或存在于磷酸钙陶瓷载体中，达到足以增加其骨形成的程度。可再吸收的生物聚合物可以为粉末或海绵状形式，并且优选为一种源于猪皮的明胶。陶瓷载体可15以为特朱形式或可以为结构稳、定的三维纟直入物形式。该结构稳、定的三维才直入物可以是例如立方体、圆柱形、块状或一种恰当的解剖形式。该组合物也可包含一种或多种以接近新组织形成的速率降解、再吸收或重建的其它组分。合适的方法和技术参见Caplan等的美国专利5,226,914和美国专利5,837,539。20该方法还可以用来辅助固定，i体装置。因此，^f艮体装置(如用于髋关节、膝关节和肩关节置换的那些装置)的表面可以在植入前》余覆本发明的一种《且合物。然后该组合物中的MPC或其书于生后代4可以分化为成骨细胞，从而加速骨向内生长的过程以及布i体装置的整合(参见Caplan等的美国专利5,226,914和美国专利5,837,539)。25上述方法可以进一步包括给予个体至少一种生物活性因子，其诱导或加速MPC或其衍生后代分化成骨种系。该生物活性因子可以是例如一种合成的糖皮质激素如地塞米^K或一种骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP画3、BMP-4、BMP-6或BMP陽7。该骨形态发生蛋白可以存在于一种适合于肌内、静脉内、髓内或关节内注射的液体或半固体载体中。本发明还提供一种在受治者中形成脉管组织的方法，该方法包5括将所述受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。本发明还提供一种在受治者中形成脉管组织的方法，该方法包括将本发明的一种组合物在需要脉管组织形成的部位处给予该受治者。本发明还提供一种在受治者中形成心月几或平滑月几的方法，该方10法包括将该受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。本发明还提供一种在受治者中形成心月几或平滑肌的方法，该方法包括将本发明的一种組合物在心"几或平滑"几形成部位给予给受治者。15在整个说明书中，词语"包括"或变形如"包含"应当理解为表示包括所述元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，但不排除任何其它元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。基质细胞书f生因子-l及其类似物基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在本领域中也被称为趋化因子20CXC基序配体12(CXCL12)和前B细胞生长刺激因子(PBSF)。基质细胞衍生因子l-a和l-P是较小的细胞因子，属于间分泌素(intercrine)家;^矣，该家;J臭的成员激活白细胞并且经常由促炎刺激物如脂多糖、TNF或IL-1所诱导。间分泌素的特征在于存在4个保守半胱氨酸，可形成2个二石危键。它们可^皮分成两个亚家族。在cc亚家族中，半胱氨酸残基相互邻4妄。在cxc亚家族中，它们由插入的氨基酸所分隔。SDF-1蛋白属于后一组。如上所述，至少存在两种已知的SDF-1异构体，称为SDF-la和SDF画1J3。Shirozu等(Genomics,28:495，1995)鉴定了人SDF-15染色体组的克隆体，并且i正实该a和p异构体是单个基因可替换剪接的结果。a形式来源于外显子1-3而(3形式包含来自外显子4的其它序列。全长人基因大约10kb，位于染色体lOqll.l处。除非有相反声明，如本文所使用的，术语"SDF-1"指至少该a和/或(3异构体。该术语还包括天然存在分子的生物学活性片^殳、变10异体和衍生物，其保持至少一部分活性使其对本发明的方法有用。在一个优选具体实施方式中，本发明涉及该a异构体的应用。多种不同天然哺乳动物的SDF-la和/或(3蛋白的氨基酸序列是已知的，包4舌人、大鼠、小鼠和猫(参见，例如Shirozu""/.,Genomics,28:495,1995;Tashiroefa/.，Science261:600,1993;Nishimurad15Eur.J.Immunogenet.25:303，1998;和GenBank登记号AF189724)。人a异构体的氨基酸序列作为SEQIDNO:l提供，而人|3异构体的氨基酸序列作为SEQIDNO:2才是供。SDF-1蛋白的一种优选形式是纯化的天然SDF-1蛋白，其具有的氨基酸序列与前述哺乳动物SDF-1蛋白中的一种或获自其它物种的其直系同源物相同。20对应于一种或多种特定基序和/或结构域或对应于长度为任意大小(例如，至少5、10、25、50或75个氨基酸)的SDF-1生物学活性片段也属于本发明的范围。该片段可被产生(重组或通过化学合成)和检测以鉴定那些可充当天然SDF-1蛋白的类似物的肽基片段。SDF-1变异体具有的肽序列在一个或多个氨基酸上不同于天然SDF-1蛋白。这些变异体的肽序列可能的特征是天然SDF-1蛋白的一个或多个氨基酸缺失、插入或替换。氨基酸插入优选为约1至4个邻4妾氨基酸，而缺失优选为约1至10个邻4妾氨基酸。5SDF-1变异体可通过各种本领域已知的才支术来形成。例如，SDF-1变异体可通过引起突变来形成，如通过引入分散的点突变或通过截短来形成。突变可产生一种具有与天然SDF-1蛋白基本上相同的功能活性的SDF-1变异体。特别地，可生成该蛋白的激动形式，其组成性地表达天然SDF-1蛋白的一种或多种功能活性。可产生的10其它SDF-1蛋白变异体包括抵抗蛋白水解切割的那些变异体，例如由于改变蛋白酶耙序列的突变作用。肽的氨基酸序列改变是否得到具有天然SDF-1蛋白的一种或多种功能活性的变异体，可通过测试该变异体的天然SDF-1蛋白功能活性而很容易确定，例如，如本文所述的测试该变异体刺激MPC增生的能力。15在本领域中已知多种^支术可用来筛选由点突变或截短形成的组合文库的基因产物，并用来筛选cDNA文库中具有某种性能的基因产物。这样的I支术通常可适用于通过SDF-1基因变异体的组合突变产生的基因文库的快速筛选。最广泛使用的用于筛选较大基因文库的技术通常包括将该基因文库克隆到可复制的表达载体中，利用20所得到的载体文库转化合适的细胞，并且在一定条件下表达该组合基因，而在该条件下检测预期活性有利于相对容易分离编码其产物被检测的基因的载体。SDF-1是G-偶联的7次跨膜CXCR4受体(在本领域也称为融合蛋白或LESTR)目前唯一为人们所知天然存在的激动剂。而且，25已证实MPC表达CXCR4受体(人类分子，作为SEQIDNO:3提供)。因此，本文所述的SDF-1的生物学作用最可能是通过趋化因子受体CXCR4介导的。因而，对本发明的方法很有用的SDF-1类似物也可以是CRCX4激动剂。然而，本发明不排除MPC表达一种不同于CXCR4的受体，本文描述的生物学活性由其完全介导，或连同另一受体如CRCX4来介导。如本文所使用的，术语"SDF-1类似物"指的是结构上或功能5上与SDF-1相关并且适合用于本发明方法的任何分子。优选地，SDF-1类似物是SDF-1结合于CXCR4的拮抗剂。SDF-1类似物包括如上所述的天然存在的SDF-1的生物学活性片段、变异体和衍生物。SDF-1类似物的实例包括描述于US20050065064、US1020050059584和Pelus"a/"Exp.Hematol.33:295,2005中的分子。另夕卜，有i正据表明HIV-1外壳蛋白gpl20作为SDF-1类似物起作用(TranefJ.Neuroimmunol.160,682005)。it匕夕卜，研究已"i正实，AMD3画(AnorMEDInc,BritishColumbia,Canada)和ALX40-4C(AllelixBiopharmaceuticalsInc，Canada)可作为CXCR4受体的S敫15动剂(Zhang""/.,J.Biol.Chem.277,245152002)起作用。多种肽或模拟(包括肽模拟物)SDF-1蛋白类似物可利用传统技术生成。例如，抗体或抗体片^:可针对结合SDF-1的受体(如CXCR4)生成，然后进行筛选以鉴定那些作为天然SDF-1蛋白的类似物起作用的抗体或抗体片^:。而且，SDF-1类似物可通过鉴定结20合SDF-1蛋白受体如CXCR4的那些分子而筛选其它分子(如小有机或无机分子)的文库进行鉴定。那些经鉴定的分子可进一步根据其在细月包中i秀导或阻止的4言号类型而表4正为;敫动剂。对于本发明方法;^艮有用的SDF-1类似物还可利用CXCR4受体;敫动剂再分布TM分冲斤(CXCR4ReceptorAgonistRedistributionTM25assay)力口以鉴定和/或4全i正(BiolmageA/S，Soeberg,Denmark)。SDF-1类似物的其它实例是含有对应于SDF-1各个区域或部分的结构的化合物。在一个具体实施方式中，该类似物包含N-末端区和C-末端区，借助于一个连接物(接头，linker)结合在一起。在其它具体实施方式中，SDF-1的氨基酸残基通过例如赖氨酸和丝氨5酸残基的醚4b或通过本4页;或已知的其它方式而环^匕。在又一个具体实施方式中，该SDF-1类似物包含的氨基酸序列来源于野生型趋化因子序列，但一个或多个半胱氨酸被另一种氨基酸替换。其它具体实施方式包括趋化因子类似物，其包含一个N-末端区、一个含有达3个反平行P折叠的内部区、一个含有a-螺旋结构的C-末端区、一10个直4妻连4妄在一起的该N-和C-末端区的组合、一个N-末端区和内部区的组合或一个内部区和C-末端区的组合或最后地一个N-末端区、内部区和C-末端区的组合。选自该N-末端区、内部区和C-末端区的区i或的长度可以为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25、30、35、40、41或45个氨基酸。15对本发明的方法4艮有用的SDF-1类似物可以包括衍生物，如C-末端羟甲基衍生物、O-修饰的衍生物(例如，C-末端羟曱基苄基醚)、N-末端修饰的衍生物包括取代酰胺如烷基酰胺和酰肼以及C-末端的苯基丙氨酸残基为苯乙酰胺类似物所取代的化合物(例如，作为三肽Ser-Ile-Phe类似物的Ser-Ile-苯乙酰胺)、糖基化的趋化因20子衍生物、聚乙二醇修饰的衍生物或生物素化的衍生物。对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以直接或间接偶联于至少一个修饰基团。术语"修饰基团"用来包括直接连接于肽结构(例如，通过共价键或共价偶联)的结构，以及间接连接于肽结构(例如，通过一个稳定的非共〗介4建结合或通过一个连4妄物共价偶联25于另外的氨基酸残基)的那些结构。术语"修饰基团"还可指其模拟物、类似物或々f生物，其可以位于SDF-1核心肽结构的侧面。例如，该》f饰基团可偶联于SDF-1肽结构的氨基末端或羧基末端，或者偶联于核心结构侧面的肽或肽模拟区。可替换地，该修饰基团可偶联于SDF-1肽结构至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联于核心结构域侧面的肽或肽才莫拟区(例如，通过赖氨酰残基的s氨基；通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基；通过酪氨酰残基、丝氨酸残基或苏5氨酸残基的羟基；或氨基酸侧链上任何其它合适的反应性基团)。共价偶联于肽结构的^"饰基团可利用本领域中熟知的用于连4妻化学结构的手^:和方法来连4妄，包括例如酰胺、烷胺基、；克化物、氨基甲酸酯(盐)或脲键。在一些具体实施方式中，该修饰基团可以包括一个环状、杂环10或多环基团。如本文所使用的，术语"环状基团"包括具有3至10、4至8或5、6、7个碳原子的环状饱和或不饱和(即，芳族)基团。示例性非芳族环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基以及环辛基。术语"杂环基团"包括可选取代的、饱和的或不饱和的、3至8元环状结构，其中一个或多个骨架原子是氧、氮、辟K或其组合。15环;]犬基团或杂环基团可以在一个或多个环4立置处未净皮取4义或#皮取代。一个环状基团可以例如被卣素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂环、羟基、氨基、硝基、硫醇胺、亚胺、酰胺、磷酸酯、磷化氢、羰基、羧基、甲珪烷基、醚、硫醚、磺酰基、磺酸盐、硒基醚、酮、醛、西旨、-CF3、國CN所取代。该环状基团还可以借助一20条含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多碳原子的々包和或不饱和链连接于一个取代基，例如卣素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂环、羟基、氨基、硝基、硫醇胺、亚胺、酰胺、磷酸酯、磷化氪、羰基、羧基、曱硅烷基、醚、硫醚、磺酰基、碌酸盐、硒醚、酉同、醛、酯、-CF3、-CN;另外的一个或多个可以由氧、氮或碌^原子所25取代。对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以通过加入聚乙二醇(PEG)进行修饰。PEG修饰可以引起循环时间改善、溶解性提高、蛋白水解抗性提高、抗原性和免疫原性减弱、生物利用度提高、毒性降低、稳定性提高以及配制更容易。PEG化还可以引起生物活性显著降低。对本发明的方法4艮有用的SDF-1类似物可以以"前药"形式制备，其中，该化合物本身不作为SDF类似物起作用，而是可以通过体外和/或体内的代谢作用而转化成SDF-1类似物。例如，在这种类型的化合物中，《奮饰基团可以以能够通过代i射作用而转化成活性SDF-1类似物形式的前药形式存在。这种前药形式的修饰基团在本文中称为"二次修饰基团"。已知本领域有多种方案可用于制备限制代谢作用的肽前药，以便优化该活性形式的肽基前药的递送。合适即可应用于其它部分。特别地，在一个部分说明的特征只要合适就可以结合其它部分"i兌明的特4i。遗传修饰细胞的制备在本发明的另一个方面，MPC或其衍生的前体细胞经遗传修饰以制备SDF-1或其肽类似物。典型地，该细胞将经过遗传修饰以使得SDF-1或其肽类似物从其分泌。遗传^f奮饰的细力包可在至少一种其量足以支持该经》务饰细力包生长的细胞因子存在的情况下进行培养，然后选择其中编码的多肽被20过表达的修饰细胞，这样获得的遗传修饰细胞可以立即被利用(例如，在移植物中)、培养和体外扩增或保存以备用。该修饰的细胞可以通过本领域熟知的方法例如在液氮中冷冻而保存。如本文所使用的，遗传修饰涵盖任何可遗传修饰方法，其涉及将外源性或外来多核苷酸引入MPC或其衍生的前体细胞中，或在MPC或其衍生的前体细胞内对内源性基因的修饰。遗传修饰包括但不限于转导(病毒介导的宿主DNA从宿主或供体到受体的转移，在体外或体内)、转染(用分离的病毒基因组DNA转化细胞)、月旨质体介导的转移、电穿孔、磷酸钙转染或共沉淀以及其它。转导的5方法包括将细月包与包装细月包直4妄共培养(Bregnietal.，Blood80:1418-1422,1992)，或在有或没有合适生长因子和聚阳离子的情况下单独利用病毒上清液进4亍培养(Xuetal.，Exp.Hemat.22:223-230，1994)。通常^)夸编石马SDF-1或其肽类4以物的多核苷酸以载体形式引入10宿主细胞。该载体常常包括对于插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件。用来构建这种载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于才勾建合适表达载体的4支术在Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.(3rdEd.，2000);和Ausubeletal"CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley15&Sons,Inc.，NewYork(1999)中有详细描述。载体可以包括但不限于病毒载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱渗病毒、粘粒、质粒载体、合成型载体以及通常用于本领域中的其它重组载体。含有启动子和克隆位点(多核苷酸可才喿作地与其连接)的载体在本领域中是熟知的。这样的载体能够在20体外或体内转录RNA，并且可从诸如Stratagene(LaJolla，Calif.)和PromegaBiotech(Madison，Wis.)等来源购4寻。具体实例包4舌来自Stratagene的pSG、pSV2CAT、pXtl以及来自Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV和pSVK3。优选的载体包括逆转录病毒载体(参见Coffinetal.，25"Retroviruses",Chapter9pp;437-473，ColdSpringsHarborLaboratoryPress,1997)。本发明中有用的载体可通过本领:威熟知的工艺经重组制备。例如，W094/29438、W097/21824和W097/21825阐述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例性载体包括pCMV哺乳动物表达载体，例如pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.)、pSFFV-Neo和pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实例是那些来源于鼠类、鸟类或灵长类逆转录病毒的载5体。通用的逆转录病毒载体包括那些基于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV-载体)的载体。其它源于MoMLV的载体包括Lmily、LINGFER、MINGFR和MINT(Changetal.，Blood92:1-11，1998)。另外的载体包括那些基于长臂猿白血病毒(GALV)和莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾病灶形成病毒(SFFV)的载体。来源10于鼠干细月包病毒(MESV)的载体包4舌MESV-MiLy(Agarwaletal.,J.ofVirology,72:3720-3728，1998)。逆转录病毒载体还包括基于慢病毒的载体，非限制性实例包4舌基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的载体。制备逆转录病毒载体构建体时，病毒gag、pol和env序列可/人15该病毒去除，形成用于外来DNA序列插入的空间。由外来DNA编码的基因通常在长末端重复序列(LTR)中的强病毒启动子控制下表达。合适的控制调节序列的选择取决于所使用的宿主细胞，且选择属于本领域技术人员的能力范围。除LTR的启动子外，还有多种启动子为人所知。非限制性实例包:fe噬菌体XPL启动子、人20巨细月包病毒(CMV)立即早期启动子、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MMSV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区启动子、GranzymeA启动子以及GranzymeB启动子。另夕卜，可使用可诱导或多重控制元件。选择合适的启动子对于本领域技术人员是显而易见的。25如果gag、pol和env功能由包装细胞系反式提供，则这样的构建体可被有效地包装到病毒粒子中。因此，当该载体构建体净皮引入所述包装细月包中时，由该细月包产生的gag-pol和env蛋白与载体RNA一起组装以产生感染性病毒颗粒(viron)而分泌到培养基中。这样产生的病毒可感染并整合入耙细胞的DNA,^旦不产生感染性病毒粒子因为其缺少基本的包装序列。目前使用的大多数包装细胞系已用单独的质粒(每种质粒含有必需的编码序列中的一个)进行转染，5因此多重重组情况在可复制病毒产生之前是必需的。可替换地，该包装细胞系带有一种前病毒。该前病毒已被破坏，因此尽管其可以产生组装感染性病毒所必需的全部蛋白质，<旦是其自身RNA不能包装入病毒，而是包装由重组病毒产生的RNA。因此，/人该包装细胞释放的病毒原种仅含有重组病毒。逆转录病毒包装林系的非限制104生实例包4舌PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI14、GP7C-tTA-G10、ProPak-A(PPA-6)以及PT67。参考了Milleretal"Mol.CellBiol.6:2895，1986;Milleretal.，Biotechniques7:980，1989;Danosetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460，1988;Pearetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8392-8396，1993;andFineretal"Blood1583:43-50，1994。其它合适的载体包括腺病毒载体(参见Freyetal.，Blood91:2781，1998;和WO95/27071)以及&i相关病毒载体。这些载体在本4页i或中者卩是^;^口6勺,fe口Chatterjeeetal"CurrentTopicsinMicrobiol.AndImmunol"218:61-73，1996;StemcellBiologyandGeneTherapy,20eds.Quesenbenyetal.，JohnWiley&Sons,1998;andU.S.Pat.Nos.5,693,531and5,691,176中所描述的。l，病毒书f生载体的应用在某些情形下可能是有利的，因其不能够感染非分裂细胞。与逆转录病毒DNA不同，腺病毒DNA不整合入靶细胞的基因组中。而且，腺病毒载体携带外来DNA的能力比逆转录病毒载体大4艮多。腺相关病25毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以被整合入非分裂细胞中，利用腺相关病毒载体已将多种多核苷酸成功引入不同细月包型中。在一些具体实施方式中，该构建体或载体包括两种或更多种异源性多核苷酸序列a)编石马SDF-1或其类4以物的核酸序列，和b)一种或多种其它核酸序列。伊C选;也，所述其它核酸序列是编石马选择性标记物、结构基因、治疗基因、CXCR4受体或其它细胞因子/趋5化因子基因的多核苷酸。一种选择性标i己物可以净皮包含于构建体或载体中，用于监测遗传修饰的成功以及用于选择DNA已整合入其中的细胞。非限制性实例包括耐药性标记物，如G148或潮霉素。另外也可采用阴性选择，例如，其中的标记物是HSV-tk基因。该基因使该细胞对诸如10阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(gancyclovir)等药物每丈感。通常使用NeoR(新霉素/G418抗性)基因，但任何便利的标记基因均可使用，只要其基因序列尚未存在于靶细胞中。进一步的非限制性实例包括低亲和力的神经生长因子(NGFR)、增强绿色荧光蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠CD2415(HSA)、鼠CD8a(lyt)、j陚予嘌t令霉素或腐草霉素抗性的细菌基因以及p-半乳糖苷酶。其它多核苷酸序列可以在与编石马SDF-1或其肽类4以物的多核苷酸相同的载体上^皮引入到宿主细胞中，或者所述其它多核苷酸序列可以在另一个载体上^皮引入宿主细月包。在一个4尤选的具体实施方20式中，一种选择性标记物将^皮包含在与编码SDF-1或其肽类似物的多核苷酸相同的载体上。本发明还涵盖对内源性SDF-1基因的启动子区进行遗传修饰，以使该内源性基因的表达上调，导致相比于野生型MPC或其衍生的前体细胞，SDF-1的产生增加。25基盾细胞4汙生因子-l(SDF-1)及其类似物的给予本发明的方法可以涉及4夸SDF-1或其类4以物纟会予一个受治者，以原位增强MPC或其4汙生后^^的增生和/或存活。这些方法可以涉及部分、系统或局部4口在才直入物或装置内部纟会予SDF-1或其类4以物。5在一个特定的具体实施方式中，本发明提供一种通过将SDF-1或其类似物系统性地给予所述受治者，而在需要其的受治者中增强MPC或其书于生后4戈增生和/或存活的方法。例》0,该SDF-1或其类似物可通过皮下或肌内注射而给予。本发明的这个具体实施方式可能对那些希望特定组织中MPC10的增生和/或存活增加的系统变性疾病的治疗4艮有用。可用这种方式治疗的系统变性疾病的实例包^"骨质疏+>症或骨^"、專欠骨变性疾病、动"永粥一羊^/Hl、外周动力永疾病或心血管疾病等。因此，根据本发明，包含治疗或预防有效量SDF-1或其类似物的组合物可以用于治疗的疾病或失调选自由自身免疫性疾病、急性15慢性炎症、癌症、心血管病、感染性疾病以及炎症性疾病(包括风湿性关节炎、慢性炎症性肠道疾病、慢性炎症性盆腔疾病、多发性硬化症、哮喘、骨关节炎、动脉粥样硬化、银屑病、鼻炎、自身免疫性和器官移才直排斥)组成的组。在一个实施例中，这样的组合物包括治疗或预防有效量的SDF-1或其类似物，足以用来辅助刺激组20织特异性细^^的产生。"治疗有效量"是指在必要的剂量和时间期内可有岁文获得MPC或其衍生后代的增生和/或存活增强的量。"预防有效量，，是指在必要的剂量和时间期内可有效获得希望的子贞防,文果如防止或水卩制MPC或其书f生后^死亡的量。在特定的具体实施方式中，SDF-1或其类似物的治疗或预防有效量的优选范围可以是0，lnM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15nM或O.OlnM-lOpM。应当注意，剂量4直可以随着祠r纟爰解病症的严重禾呈度而变化。对于任何特定的受治者，根据个体需要以及给予或监控5该组合物给予的人员的专业判断，特定的剂量方案可随时间进行调整。本文提出的剂量范围仅是示例性的，并不限制可能由医疗人员选才奪的剂量范围。组合物中的SDF-1或其类似物的量可以4艮据诸如个体疾病状态、年龄、性别以及等因素而变化。可对剂量方案进行调整以提供最佳治疗应答。例如，可以给予单一推注，可以在一定10时间内给予若干分次剂量，或者该剂量可以根据治疗情形紧急性的指示而成比例地减少或增加。将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，可能对方便给予和统一剂量是有利的。如本文所使用的，"剂量单位形式"是指物理性分开的单位，适合作为用于待治疗受治者的单一剂型；每一个单元含有经计算的预定量活性化合物，以联合15必需的药用载体而产生希望的治疗作用。应当理解，SDF-1或其类似物可以以一种包含药用栽体或J3武形剂的组合物形式而给予。如本文所使用的，"药用载体"或"赋形剂"包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延緩吸20收剂等。在一个具体实施方式中，该载体适合于肠胃外给予。可替换地，该载体可适合于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服给予。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。这些用于药学活性物质的介质和试剂应用在本领域是熟知的。除了任何与该活性化合物不相容的常规25介质或试剂的范围，均考虑其在本发明药物组合物中的应用。补充的活'性4b合物也可并入到该《且合物中。用于肠胃外给药的药物制剂可以包括脂质体。脂质体和乳液是熟知的对于疏水性药物特别有用的递送工具或栽体的实例。根据治疗试剂的生物学稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质的方案。此夕卜，人们可以给予存在于耙向药物递送系统中的药物，例如，存在5于涂覆靶特异性抗体的脂质体中。该脂质体会结合于靶蛋白并由表达把蛋白的细胞选"^奪性吸收。通常，在生产和贮存条件下治疗组合物应该是无菌且稳定的。该组合物可配制成溶液、樣吏乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例4口，丙三10醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可通过例如利用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需颗粒大小以及通过利用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在该组合物中包括等渗剂，例如糖类、多醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物15中包含一种延緩吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。此外，SDF-1或其类似物可以在延时释放制剂中给予，例如在包括緩释聚合物的组合物中给予。该活性化合物可利用防止该化合物快速释放的载体如控释制剂一起制备，包括植入物和微嚢化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚肝、20聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这些制剂的许多方法都被授予专利或通常对于本领域技术人员是已知的。另外，本发明化合物的悬浮液可被制成适当的油状悬浮液用于注射。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪25酸酯，如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂质体。用于注射的悬浮液也可含有增加该悬浮液粘度的物质，如羧曱基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加该化合物溶解性的试剂，以制备高度浓缩的溶液。无菌可注射溶液可通过在合适溶剂中以需要量的活性化合物才艮据需要与上述列举组分中的一种或其组合加以混合而制备，随后5进行过滤消毒杀菌。通常，分散液通过将活性化合物并入含有一种基本分散介质以及所需的来自以上列举的其它组分的无菌载体中而制备。在用于无菌可注射溶液的无菌4分末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，可从其之前已无菌过滤的溶液得到一种活性成分与任何其它希望组分的粉末。#4居本发明的一个可替换10方面，SDF-1或其类卩以物可以与一种或多种增强该SDF-1或类4以物溶解性的其它化合物一起配制。如果本发明的化合物需要通过吸入给予，则它们可以以压缩包装的气溶胶喷射规格或雾化剂的形式，同时采用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三绿氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化,友或其它15合适的气体)一起方侵J也加以递送。在一种压缩气;容月交的情况下，剂量单位可以通过一个阀递送可测定的量来确定。例如用于吸入器的胶嚢和明胶套可以配制成包含该化合物和一种合适粉末基质如淀粉或乳糖的粉末混合物。本发明的细胞组合物的给予20包含MPC和/或其衍生后代的本发明的细胞组合物可对多种类型的组织再生很有用，包括骨、软骨、肌腱、韧带、肌肉、皮肤和其它结締组织，以及神经、心脏、肝、肺、肾、胰腺、脑和其它器官组织。在一些具体实施方式中，本发明的ia合物可以结合一种适当的25基质(例如，用于支持MPC和/或其衍生后代和为骨、软骨、肌肉、神经、表皮和/或其它结締组织的生长提供表面)一起给予。该基质可以是传统基质生物材料的形式。该基质可以提供表达的蛋白和分化的细胞的緩释和/或其存在的适当环境。在一些具体实施方式中，预期多种月交原和非月交原净皮上调并/人MPC或其4汙生后^分泌。这种5现象通过增强基质沉积而加速组织再生。基质蛋白也可在遗传改造的细胞中表达且促进移植的细胞移入并连接到移植区。基质材料的选择根据生物相容性、生物降解性、机械性能、创面外^见和界面性质。该基于细月包的组合物的特定应用^!寻确定适当的制剂。用于该组合物的可能基质可以是生物可降解的以及化学定义10的石克酸钓、石粦酸三4丐、羟石粦灰石、聚乳酸和聚酐(polyanhydride)。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上良好定义的，如骨或真皮胶原。其它基质由纯蛋白或胞外基质组分构成。其它可能的基质是非生物降解的和化学定义的，如烧结的羟石粦灰石、生物3皮璃、铅酸盐或其它陶瓷材料。基质可以由上述类型的材料中任意的组合，15如聚乳酸和羟石粦灰石或力交原与石粦酸三钙的组合。生物陶瓷在组成上可以#:改变如在磷酸铝4丐中，也可经加工以改变孔径大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。本发明的细胞组合物可以用来治疗由疾病或创伤或该组织发育不正常引起的需要软骨或骨组织的修复或置换的受治者，或用来20^是供一种整容功能，如增强身体的面部或其它特征。治疗可〗吏得本发明的细胞的应用4艮必要，以产生新的软骨组织和骨组织。例如，包含未分化的或專欠骨形成分化i秀导的前体细月包的组合物可用来治疗软骨病症，例如风湿性关节炎或骨关节炎，或一种对软骨的创伤性或手术性损伤。作为另一个实施例，包含骨前体细胞的组合物可25用来治疗骨病症，包括代谢和非代谢骨疾病。骨病症的实例包括半月板撕裂、脊柱融合、脊柱盘摘除、脊柱重建、骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育异常、脊柱侧凸、骨质疏松症、牙周病、牙骨质丢失、骨软化症、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和骨佩吉特式病(Paget'sdiseaseofbone)。本发明的细胞组合物可单独给予或作为与其它细胞的混合物给予。可以结合本发明组合物而给予的细胞包括^旦不限于其它多潜5能或多向性细胞或库欠骨细月包、成库欠骨细;f包、骨细月包、成骨细月包、石皮骨细l包、骨4于细月包、干细月包或骨髓细月包。不同类型的细月包可在主会予前立即或短期内与本发明的组合物进行混合，或在给予前它们可共培养一段时间。本发明的细月包组合物可与其它有益的药物或生物分子(生长因10子、营养因子)一起^^予。当MPC和/或其彩f生后^^与其它试剂一起纟合予时，它们可以在单一药物组合物中一起纟会予，或在分开的药物组合中同时或与其它试剂按顺序给予(在给予其它试剂之前或之后)。可以共同乡合予的生物活性因子包括「抗凋亡^式剂(例如，EPO,EPO模拟抗体(mimetibody),TPO,IGF-I和IGF-II，HGF,胱冬15酵4中制齐寸(caspaseinhibitor))、4元炎剂(侈'W口，p38MAPK4中制剂，TGF-p抑制剂，〗也汀类药物，IL-6和IL-1抑制剂，PEMIROLAST，TRANILAST，REMICADE,SIROLI而S,和NSAID(非甾》矣4元炎剂物；例如TEPOXALIN，TOLMETIN,SUPROFEN))、免疫抑制/免疫调节剂(例如，钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂，如环孢20素，他克莫司(tacrolimus);mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS,EVEROLIMUS);抗增生剂(例如，咪哇巯噪p令，吗乙霉酚酸盐/酉旨)；皮质激素类(例如，氢化泼尼松(prednisolone),氢化可的^>);抗体如单克隆抗-IL-2Ra受体抗体(例如，巴利昔单抗(basiliximab)，达克J朱单抗(daclizumab))、多克隆抗-T细胞抗体(例如，抗胸腺25细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、单克隆抗-T细胞抗体OKT3))、抗-血栓形成剂(例如，肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿斯匹林、双嘧咬胺醇、鱼精蛋白，水蛭素，前列腺素抑制剂，和血小板抑制剂)和抗氧化剂(例如，丙丁酚，维生素A,抗坏血酸，生育酚，辅酶Q-IO,谷光甘肽，L-半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)5以及局部麻醉剂。作为另一个实施例，该细胞可以与瘢痕抑制因子(如在美国专利第5,827,735号中描述的，其内容结合于此作为参考)一起给予。在一个具体实施方式中，本发明的细月包组合物作为未分化的细胞给予，即，如在生长培养基中培养的细胞。可替换地，该细胞组10合物可以在培养过程中暴露于刺激分化朝向希望表型例如成骨表型的条件之后进行给予。本发明的细月包组合物可以手术才直入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接给予至需要修复或加强的部4立。这些细"包可以4昔助基质(例如，一种三维支架)而纟合予。15这些细胞可以与传统药用载体一起给予。本发明的细胞或其组合物或组分(例如，ECM，细胞溶解产物，条件培养基)的给予途径包括肌内、眼用、肠胃夕卜(包括静脉内)、动脉内、皮下、口服以及鼻道给予。肠胃外给药的特定路径包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、大月卤内、心室内、月亩心室内、胸内、月亩池内，脊4主内和/或脊4主20周围的,会药^各径。当这些细胞以半固态或固态装置进行给予时，手术植入体内的精确位置通常是一种合适的给药方式。然而，液体或流体药物组合物可以给予至一个更广泛的位置(例如，整个广泛受影响的区域)，其从该位置移动到一个特定位置，例如，通过对化学信号产生反应。其它具体实施方式涵盖了通过给予含细胞组分(例如，细胞溶解产物或其组分)或产物(例如，通过遗传修饰产生的胞外基质、营养和其它生物因子)的药物组合物的治疗方法。用于给予本文所述的细胞组合物的剂型和方案是根据良好的5医疗实践而开发的，考虑了个体受治者的情况，例如正治疗病症的性质和程度、年龄、性别、体重和整体医疗条件以及其它为医疗人员所知的因素。因此，待给予受治者的药物组合物的有效量是由本领域已知的这些考虑来确定的。在本发明的一些具体实施方式中，在用本发明的细月包组合物开10始治疗之前抑制一个受治者的免疫反应可能是不必要的或不希望的。因此，利用同种异体或甚至异基因的MPC或其书f生后4戈进4亍移植在某些情况下可耐受的。然而，在其它情况下，可能希望或需要在细胞治疗开始之前药理学地抑制一个受治者的免疫反应。这可以通过系统或局部应用免15疫抑制剂来实现，或者通过在嚢化装置中递送该细胞而实现。MPC或其书f生后^C可以:帔包4皮于胶嚢中，该月交嚢允许细胞和治疗因子所需的营养物质和氧气透过，而该细"包对免疫体液因素和这些细胞是不可透过的。优选地，该胶嚢密封材料是低变应原性的，易于稳定定位于革巴组织中，并且对该4直入的结构^是供额外^f呆护。这些以及其20它用于减少和消除对该才直入细力包的免疫反应的方式在本领i或中是已知的。作为一种替4灸方案，MPC和其书f生后^可以经过遗传^修饰以减少其免疫原性。移植的MPC或其衍生后代在生存患者中的存活可通过利用各种扫描4支术来确定，例如计算才几4b轴向断层4金查(CAT或CT)扫描、一磁共^展成4象(MRI)或正电子发射断层成4象25术(PET)扫描。移植物存活的确定也可通过死后取出靶组织，并通过肉眼或通过一个显^f款镜来^r查而完成。可替换地，这些细胞可利用特异于特定种系细月包染剂来处理。移才直的细月包也可通过提前并入示踪性染料如罗丹明或荧光素标记的微球体、快蓝(fastblue)、二苯甲酰胺、含铁微粒或遗传性导入报道子基因产物如p-牛乳糖或J3-葡糖醛酸糖苷酶来而加以鉴定。移植的MPC或其衍生后代功能性整合至受治者可通过检查被5损伤或病态的功能的恢复而进^f于评估，例如关节或骨功能的恢复或功能的加强。本发明的细月包《且合物可以包4舌一种或多种生物活性因子，例如4旦不限于生长因子、分化i秀导因子、细胞存活因子如胱冬酶抑制剂、抗炎剂如p38激酶抑制剂或血管生成因子如VEGF或bFGF。生物10活性因子的一些实例包括PDGF-bb、EGF、bFGF、IGF-1和LIF。可*#换地，4寺移才直的MPC或其4汙生后4气可以经过遗传改造，以表达这些生长因子、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂或血管生成因子。本发明的药物组合物可以包含MPC或其衍生后代的同源或异15源种群、胞外基质或其细胞溶解产物或在药用载体中的条件培养基。用于本发明细胞的药用载体包括合适的有机或无机载体物质，其不会与本发明的细胞或其組合物或組分有害地反应。在它们是生物相容性的程度上，合适的药用载体包括水、盐溶液(如林格氏溶液)、乙醇、油、明胶和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂20肪酸酯、羟曱基纤维素和聚乙烯基吡咯烷。这样的制剂可被消毒杀菌，如果需要，其可与辅助试剂如润滑剂、防腐剂、稳、定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、緩冲剂和着色剂一起进行混合。适合用于本发明中的药用载体在本领域是已知的，且在例如PharmaceuticalSciences(17.sup.thEd.,MackPub.Co.,Easton,Pa.)25和WO96/05309中有描述，其每一个的内容均结合于此作为参考。可将一种或多种其它组分添加到移才直的细月包中，包括所选的月包外基质组分，如本领域已知的一种或多种类型的胶原、和/或生长因子、富血小板血浆以及药物。可替换地，本发明的细胞可经遗传改造以表达和产生生长因子。本文中^是供了关于本发明细胞的遗传改5造的详细内容。在一个非限制性具体实施方式中，制备包含本发明细胞的制剂，用于直接给予至需要新组织如骨组织产生的部位。例如，但不限制地，该MPC或其书f生后^可净皮悬浮在一种用于注射的7jc凝月交溶液中。用于本发明的合适水凝胶的实例包括自组装肽如RAD16。10可替换地，含有这些细胞的水凝胶溶液植入前可允许固化，例如在一个模具中形成细胞分散于其中的一种基质。或者，一旦该基质已被固化，则该细J包制备物可以;故培养，以使这些细胞在植入前经有丝分裂而扩增。该水凝胶是一种有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联产生三维开放的晶格结构，其捕15获水分子而形成凝胶。可用来形成凝胶的材料的实例包括离子交联的多糖(如藻酸盐)及其盐、肽、聚磷,和聚丙烯酸酯，或者嵌段聚合物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH进行交联。在一些具体实施方式中，MPC或其衍生后代的支撑物是生物可降解的。20在本发明的一些具体实施方式中，制剂包含一种可原位聚合的凝月交，侈寸^口美国专矛J中i青zi^开2002/0022676;Ansethetal.，J.ControlRelease,78(1-3):199-209(2002);Wangetal.，Biomaterials,24(22):3969-80(2003)中所描述的。在一些具体实施方式中，该聚合物在含7JC溶液^n水、纟爰冲盐;容25液或水-乙醇溶液中至少部分可溶，所述溶液具有带电侧基或其单Y介离子盐。带有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物实例是聚(膦腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙婦酸和甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，如磺酸化聚苯乙烯。也形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卣化的(优选氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基。5带有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物实例是聚(乙烯胺)、聚(乙烯吡啶)、聚(乙烯咪唑)以及一些亚胺基取代的聚磷腈。该聚合物的铵盐或季盐也可由主链氮或侧链亚氨基形成。^威性侧基的实例是氨基和亚氨基。室温下，藻酸盐可在水中与二价阳离子进行离子交联，形成一10种水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已成为用于杂交瘤细月包嚢4匕最通用的聚合物，例如在Lim的第4,352,883号美国专利中描述的。在该Lim工艺中，包含待封装生物材料的含水溶液一皮悬浮于水溶性聚合物的溶液中，所述悬浮液形成孩i滴，其通过4妄触多i"介阳离子而被配制成分散的微胶嚢，然后该微胶嚢的表面用多氨基酸15进行交联，而在囊化的材料周围形成半透膜。聚膦腈是其主链由交替单键和双键分隔的氮和磷构成的聚合物。每一个磷原子共<介4建合至两条侧《连。适合于交联的聚膦腈其大部分的侧链基团是酸性的并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧基的实例是羧酸基和20磺酸基。水解稳定的聚膦腈由具有羧酸侧基(其通过二价或三价阳离子如Ca^或A产进行交联)的单体形成。通过并入具有咪唑、氨基酸酯或丙三醇侧基的单体可合成通过水解作用而降解的聚合物。例如，一种聚阴离子的聚(双(羧酸根苯氧基))膦腈(PCPP)可以被合成，其可于室温或^f氐于室温下在含水介质中与溶解的多^f介阳25离子进行交联，以形成水凝胶基质。生物可降解的聚膦腈具有至少两种不同类型的侧链能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基以及在体内条件下可水解的侧基，例如咪唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。侧链的水解导致聚合物的腐蚀。水解性侧链的实例是未取代和5取代的咪唑以及氨基酸酯，其中该基团通过一个氨基键结合于磷原子(其中两个R基团以这种方式连接的膦腈聚合物被称为聚氨基膦腈)。对于聚咪唑膦腈，在聚膦腈主链上的"R"基团的一部分是咪唑环，通过一个环氮原子连接于主链中的石粦。其它"R"基团可以是不参与水解的有机残基，如曱基苯氧基基团或其它在Allcockefa/.，10Macromolecule10:824(1977)的科学论文中示出的基团。该水凝月交材料的合成方法以及用于制备这样的水凝胶的方法在本领域中是已制剂中也可包括其它组分，包括但不限于下列组分中的任何一种(1)用来l是供适当pH和等渗压性的緩沖剂；(2)润滑剂；(3)15用来在给予部位或附近保持该细胞的粘性材料，包括例如藻酸盐、琼脂和植物胶；以及(4)可以在给予部位处产生预期效应的其它细月包类型，例如组织或其物化特性形成的增强或《多饰，或者作为用于细力包生存的支撑物，或者抑制炎症或排斥。这些细J包可以用一种适当的创面覆盖物加以覆盖以防止细胞离开该部位。这样的创面覆20盖物对于本领域才支术人员是已知的。骨组织补片的配制MPC或其衍生后代在预成型孔中的培养或共培养使得能够制造预定厚度和体积的组织补片。所得组织补片的体积取决于孔的体积和该孔中MPC或其书于生后^的凄t量。最佳预定体积的组织可通25过改变前述参凄t中的一个或两个而以常规实验进行制备。孑L的细胞接触表面可以涂覆一种阻碍MPC或其衍生后代粘附至该细胞接触表面的分子。优选的涂覆剂包括硅基试剂，即二氯二曱基硅烷，或聚四氟乙烯基试剂，即TEFLON。用于将材料涂覆硅基试剂，特别是二氯二曱基石圭烷的流程步骤在本领i或是熟知的。参5见，例如Sambrooketal.(1989)"MolecularCloningALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress，其内容纟吉合于》匕讦乍为参考。应当理解，阻止细月包连4妄于孔表面的其它生物相容性试剂在本发明的实践中可能^f艮有用。可替换地，该孔可由一种柔韧性或可塑性生物相容材料(其本10身不允许细胞连接)铸成。阻止这种细胞连接的优选材料包括但不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养塑并牛和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未处理的细胞培养塑料，即还没有用具有静电荷的材料处理或由其制成的塑料是商业上可获得的，并且可/人例如FalconLabware，Becton-Dickinson，LincolnPark,N丄购得。然而，前述才才料15不用于限制的目的。应当理解，本身可阻止MPC或其4汙生后K连接的任何其它柔韧性或可塑性生物相容材料在本发明的实践中可能很有用。悬浮液中的MPC或其衍生后代可以接种到预成型孔中并进行培养。MPC或其衍生后代可以在该孔的培养基中被诱导分化成成软20骨或成骨表型，或可能在接种到孔中之前已被诱导分化。可通过加入培养基而将细胞稀释到细胞密度为约lxl()S至lxl(^个细胞/毫升。这些细月包可以形成一种细月包的内聚塞(cohesiveplug)。戶斤述细胞内聚塞可以从该孔移出，经手术植入组织缺损中。预期未分化的MPC或其4汙生后^可以原位分化，A人而在体内形成组织。25骨缺损可以通过利用计算才几辅助层^f成^象(CAT扫描)、X射线才企查、》兹共振成"f象(MRI)、滑液或血清标记物的分析，或通过本领域已知的任何其它工艺步骤而进行推理鉴定。哺乳动物中的缺损在关节镜检查或开放性手术过程中也易于肉眼鉴定。该缺损的治疗可利用本文中披露的方法和组合物在关节镜检查或开放性手术过程中实现。5因此，一旦该缺损被鉴定，则该缺损可通过以下步骤进行治疗(1)在预定部位植入利用本文所述方法制备的组织补片，以及(2)允i午该组织4卜片整合入预定部4立处。该组织补片具有的最适大小和形状可使得当该补片被植入所述缺损中时，才直入的组织的边乡彖直4^接触该缺损的边全彖。另外，可10在手术过程中将该组织补片固定于适当位置。这可以通过手术将该补片利用生物可降解的缝固定入所述缺损中和/或通过将生物粘合剂施加于该补片和缺损的分界区域而实现。在某些情况下，损伤的组织可以在该《且织#卜片才直入前手术切除。15利用支架移才直MPC或其书于生后代i本发明的细月包组合物或其共培养物可以*接种到一个三维支架上或其内部并才直入体内，其中才妻种的细胞将在该框架上增生并与受治者的细胞共同在体内形成置换组织，如骨组织。例如但不是限制地，该支架可以被设计，以使该支架结构(1)20在没有后续降解的情况下支撑接种的细胞；(2)从接种直至该组织移植物由宿主组织重建的时间内支撑这些细胞；(3)允许接种的细胞连接、增生、并在体外发育成具有足够机械整体性以支撑其自身的纟且织结构，此时该支架一皮降解。支架i殳计的综述提供于Hutmacher,J.Biomat.Sci.PolymerEdn.，12(1):107-124(2001)中。本发明的支架可联合任意一种或多种生长因子、细胞(例如，干细胞，骨髓细胞，软骨细胞，成软骨细胞，骨细胞，成骨细胞，石皮骨细"包，骨邱于细W包，或它们的前体)、药物或上述的刺;敫纟且织形成或其它方式增强或改进本发明实践的其它组分一起给予。待接种5于该支架上的MPC或其书f生后^可进^f于遗传改造以表达生长因子或药物。本发明的细胞可用来在体外产生新的组织，其随后可祐^直入、移植或以其它方式插入受治者需要组织修复、置换或加强的部位。在一个非限制性具体实施方式中，本发明的细胞用来在体外产10生三维组织构建体，其随后植入体内。作为产生三维组织构建体的一个实例，参见美国专利第4,963,489号，其内容结合于此作为参考。例如，本发明的细胞可"接种"到一个三维框架或支架上，并在体外增生或生长，以形成可4直入体内的活组织。本发明的细胞可在培养亚内自由生长至亚融合或融合，从培养15基转移接种于三维框架上。利用高浓度细胞(例如，约106至5乂107个细胞/毫升)接种该三维框架将实现在相对较短的时间周期内建立三维支撑物。可用于本发明的支架实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以是例如利用由合成的乙醇酸和乳酸的可p及收共聚物20(PGA/PLA)构成的纤维形成，该共聚物以商才示名VICRYL出售。由例如利用诸如冷冻干燥或冻干过程(如在美国专利第6，355，699中i仑述的)形成的聚(s-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也是可能的支架。也可以4吏用诸如自组装肽(例如，RAD16)的水凝胶。这些材料经常用作用于组织生长的支撑物。三维框架可由陶瓷材料制成，其包括^旦不限于石粦酸一钓、磷酸二钙、-粦酸三钙、-岸酸a三钓、》粦酸|3三钙和^粦酸四钓；羟石粦灰石；氟磷灰石；硫酸钧；氟化钙；氧化4丐；碳酸钓；磷酸钩镁；生物学活性3皮璃如BIOGLASS(UniversityofFlorida,Gainesville,Fla.)5及其混合物。目前在市场上存在多种合适的多孔生物相容性陶资材泮牛，如SURGIBON(UnilabSurgibone，Inc.,Canada)、ENDOBON(MerckBiomaterialFrance,France)、CEROS(Mathys,A.G"Bettlach，Switzerland)和INTERPORE(Interpore，Irvine,Calif"UnitedStates),以及矿化月交原骨嫁4妄产品，如HEALOS(Orque