一种靶向免疫生发中心抑制抗体介导的排斥反应的新型纳米缓释载药材料、制备方法及应用

　　1.本发明具体涉及一种靶向免疫生发中心抑制抗体介导的排斥反应的新型纳米缓释载药材料、制备方法及应用。背景技术：2.纳米级药物载体(nanoscale drug carriers)是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。纳米粒(nanoparticle)又称毫微粒，是大小在10—1000nm之间的固态胶体颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质构成，可作为传导或输送药物的载体。3.但是目前的纳米级药物载体存在一些缺点，如缺乏病灶特征靶向，缺乏可控释放功能，存在外周、系统性药物损伤等，因此需要提供一种新型纳米载药材料。技术实现要素：4.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种靶向免疫生发中心抑制抗体介导的排斥反应的新型纳米缓释载药材料、制备方法及应用。5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：6.一种靶向免疫生发中心抑制抗体介导的排斥反应的新型纳米缓释载药材料，所述载药材料由以下步骤制备得到：7.(1)介孔二氧化硅纳米球的制备：首先将20-40ml，25wt％ctac水溶液和0.18g tea加入36ml水中，60℃搅拌1小时；然后将20ml，10v/v％teos环己烯溶液加入上述混合物中，并在60℃油浴中以150rpm磁力搅拌反应过夜，所得产物通过离心收集，并将收集的产物分散在0.6wt％硝酸铵乙醇溶液中；8.(2)部分氧化葡聚糖的合成：将1g平均分子量为9000-11000的葡聚糖溶解在4ml水中，在上述溶液中加入0.22g高碘酸钠并在室温下搅拌5小时以产生部分氧化的葡聚糖；部分氧化的葡聚糖通过再生纤维素膜mw 3500da用蒸馏水多次透析进一步纯化；冻干后得到白色的、部分氧化的葡聚糖粉末；9.(3)部分氧化乙酰化葡聚糖即acdex的合成：将1.0g部分氧化葡聚糖加入10ml无水dmso中，搅拌至完全溶解，加入0.062mmol对甲苯磺酸吡啶鎓和37mmol 2-甲氧基丙烯，密封在n2保护下；3小时后，加入1ml tea终止上述反应，加入100ml蒸馏水使修饰的部分氧化葡聚糖沉淀；通过以10000rpm离心10分钟来分离产物，并用去离子水洗涤所得沉淀物，然后离心并去除上清液；通过冻干获得acdex；10.(4)精胺修饰的氧化乙酰化葡聚糖(spacdex)的合成：将1.0g部分氧化的acdex溶解在10ml无水dmso中，并与4.0g精胺混合，在50℃下反应24h；将2.0g nabh4加入到混合物中并在室温下再反应18小时；通过向上述溶液中加入40ml去离子水沉淀，并通过以10000rpm离心10分钟进行分离；所得沉淀物用去离子水洗涤数次，冷冻干燥后，收集spacdex；11.(5)spacdex封装的msn(即msn@spacdex)的制备：将1.0mg·ml-1msn和5mg·ml-1spacdex在乙醇中混合作为微流体的内相，并使用1％的pva水溶液作为外相；将两相溶液连接到注射器的聚乙烯管，将两相溶液混合后获得的msn@spacdex沉淀，收集在0.1％pva溶液中，并以200rpm搅拌；随后，以10000rpm离心5分钟，并用去离子水洗涤数次。12.进一步地，所述载药材料的制备还包括以下步骤：13.将5-10mg纳米颗粒msn@spacdex添加到2ml，1mm双磺基琥珀酸二亚胺酯pbs试剂中；在室温下用磁珠将混合物搅拌6h；用pbs洗涤后，将5-10mg/ml bs3结合的纳米颗粒与0.15mg/ml抗小鼠cd3e抗体孵育并在4℃搅拌过夜；将cd3eab缀合纳米颗粒用pbs洗涤，在10,000g离心5分钟，并重复三次。14.一种载药材料在治疗移植器官炎症中的应用，所述材料为以上所述的载药材料。15.本发明的有益效果是：16.本发明的新型纳米载药材料具有靶向性，能够缓释药物，能够用于治疗移植器官炎症浸润，毒性小(神经毒性与肾毒性小)，副作用小。附图说明17.图1是spacdex的合成过程示意图。18.图2中，a是msn纳米颗粒的透射电镜照片；b是他克莫司@msn@spacdex核壳结构的透射电镜照片；c是msn@spacdex载他克莫司在不同ph值下的释放曲线。19.图3是纳米颗粒装载药物后的细胞毒性研究结果示意图。20.图4是药物在体毒性评估结果示意图，其中a是小鼠体重统计图；b是小鼠肾功能三项指标测定结果统计图：b1是24小时尿蛋白测定结果统计图，b2是血清肌酐测定结果统计图，b3是血清尿素氮测定结果统计图；c是小鼠脂代谢指标检测结果统计图：c1是血清总甘油脂肪酸检测结果统计图，c2是血清总胆固醇检测结果统计图，c3是低密度胆固醇检测结果统计图，c4是高密度胆固醇检测结果统计图，c5是肝脏油红o染色图片(bar＝50μm，表示图中横线为标尺，代表50μm)；d是独木桥测试结果统计图：d1是通过时间统计图，d2是脚趾滑落次数统计；数据以x±sd形式呈现，**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001vs control组，#p《0.05,##p《0.001,###p《0.001,####p《0.0001vs tac组；vs tac-np组。21.图5是各组小鼠肺、肝、脾、肾、脑(海马、纹状体)组织he染色结果示意图(bar＝100μm，表示图中横线为标尺，代表100μm)。22.图6是各组小鼠心、肺、肝、脾、肾组织masson染色结果示意图(bar＝100μm，表示图中横线为标尺，代表100μm)。23.图7是纳米颗粒靶向性细胞学验证结果示意图，fitc(绿色)信号为cd3eab-fitc，cy5.5(红色)信号为cy5.5-np，蓝色信号为细胞核(bar＝10μm，表示图中横线为标尺，代表10μm)。24.图8是纳米颗粒靶向性在体验证结果示意图，a是在体ivis结果示意图；b是小鼠脾脏组织荧光染色结果示意图，fitc(绿色)信号为cd3eab，cy5.5(红色)信号为cy5.5-np，蓝色信号为细胞核(bar＝25μm表示图中横线为标尺，代表25μm)。25.图9是小鼠移植肾功能结果示意图，a是小鼠移植肾组织pas染色结果图(bar＝25μm，表示图中横线为标尺，代表25μm)；b是小鼠肾功能三项指标(24小时尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮)测定结果统计图，数据以x±sd形式呈现，*p《0.05，**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001vs isograft组,##p《0.001,####p《0.0001vs allograft组,vs tac组,vs tac-np组。26.图10是小鼠移植肾补体激活和dsa水平测定结果示意图，其中a是小鼠移植肾组织cd31(绿色)和c4d(红色)荧光染色结果图(bar＝25μm，表示图中横线为标尺，代表25μm)；b是小鼠血清抗供体抗原igm和igg丰度测定结果图；数据以x±sd形式呈现，**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001vs allograft组,#p《0.05,##p《0.001vs tac组,vs tac-np组。27.图11是小鼠肾移植后生发中心排斥激活水平测定结果示意图，其中a是脾脏细胞中激活tfh细胞(cxcr5+/bcl-6+)群落和浆细胞(cd138+/cd19mid+low)群落流式结果典型图；b是脾脏细胞中激活tfh细胞(cxcr5+/bcl-6+)群落占t细胞比例和浆细胞(cd138+/cd19mid+low)群落占b细胞比例统计图；c是各组脾脏增生情况示意图，c1是各组脾脏大小图片，c2是各组脾脏/体重质量比统计图；数据以x±sd形式呈现，*p《0.05，**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001vs isograft组,###p《0.001,####p《0.0001vs allograft组,allograft组,vs tac组,vs tac组。28.图12是微流控装置结构简图。具体实施方式29.以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定，其中1m＝1mol/l。30.一、合成过程31.1.介孔二氧化硅纳米球的制备32.以阳离子表面活性剂ctac(十六烷基三甲基氯化铵)为模板，teos(正硅酸乙酯)为二氧化硅源，tea(三乙胺)为催化剂，环己烯为乳化剂，通过一锅两相分层法连续生长msn。33.具体合成如下：首先将20-40ml(25wt％)ctac水溶液和0.18g tea加入36ml水中，60℃缓慢搅拌1小时。然后将20ml(10v/v％)teos环己烯溶液加入上述水、ctac和tea的混合物中，并在60℃油浴中以150rpm磁力搅拌反应8-12h，所得产物通过10000rpm离心10分钟收集，并用乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，并将所有上述反应中收集的产物分散在体积为10ml的0.6％(w/v)硝酸铵(nh4no3)乙醇溶液中。将得到的msn保存在0.6％(w/v)硝酸铵乙醇溶液中，4℃储存用于后续实验。34.2.sulfo-cy5.5-nhs标记的msn(msn-cy5.5)35.msn-cy5.5纳米结构的制备采用与msn相似的工艺合成，在ctac水溶液中加入10μl，1.0mg/ml sulfo-cy5.5-nhs。36.3.精胺修饰氧化乙酰葡聚糖(spacdex)的合成37.3.1部分氧化葡聚糖的合成38.首先将1g平均分子量为9000-11000的葡聚糖溶解在4ml水中，在上述溶液中加入0.22g高碘酸钠，并在室温下搅拌5小时以产生部分氧化的葡聚糖。部分氧化的葡聚糖通过再生纤维素膜(mw 3500da)用蒸馏水多次透析进一步纯化。冻干后得到白色的、部分氧化的葡聚糖粉末。39.3.2部分氧化乙酰化葡聚糖(acdex)的合成40.将1.0g部分氧化葡聚糖加入10ml无水dmso中，搅拌至完全溶解，加入对甲苯磺酸吡啶鎓(15.6mg，0.062mmol)和2-甲氧基丙烯(3.4ml，37mmol)，密封在n2保护下以防止2-甲氧基丙烯蒸发。3小时后，加入1ml tea终止上述反应，加入100ml蒸馏水使修饰的部分氧化葡聚糖沉淀。通过以10000rpm离心10分钟来分离产物，并通过超声分散用去离子水充分洗涤所得沉淀物，然后10000rpm离心10分钟去除上清液。通过冻干获得的部分氧化缩醛葡聚糖的白色粉末。41.3.3精胺修饰的氧化乙酰化葡聚糖(spacdex)的合成42.将1.0g部分氧化的acdex溶解在10ml无水dmso中，并与4.0g精胺混合，在50℃下反应24h。将2.0g nabh4加入到混合物中并在室温下再进行18小时的还原。通过向上述溶液中加入40ml去离子水沉淀，并通过以10000rpm离心10分钟进行分离。所得沉淀物用去离子水洗涤数次，冷冻干燥后，收集spacdex并储存于-20℃。图1是spacdex的合成过程示意图。43.4.三维微流控协流装置的制作44.使用不同参数的硼硅酸盐玻璃毛细管并组装在载玻片上：用作内管的圆柱形毛细管的一端(内径和外径分别为580和1000μm，world precision instruments,inc.,usa)，使用微量移液器拉拔器(p-97，sutter美国仪器公司)牵拉毛细管形成微孔径毛细管；然后使用砂纸将孔口直径扩大到80μm。然后将制造的内管插入另一个更厚的圆柱形毛细管外管(内径和外径分别为1100和1500μm，美国vitrocom，inc.)并组装成同轴配置。外毛细管由两个皮下注射针(warner instruments，usa)终止。必要时使用透明环氧树脂(5分钟epoxi，devcon)密封组件。两种可混溶的液体通过连接到注射器的聚乙烯管以恒定流速分别注射到微流体装置中。不同液体的流速由泵控制(phd 2000，harvard apparatus，usa)。45.5.spacdex封装的msn(msn@spacdex)的制作46.为了将msn包封到spacdex聚合物中，首先将1.0mg·ml-1msn和5mg·ml-1spacdex在乙醇中混合作为微流体的内相，并使用1％(v/v)的pva(聚乙烯醇)水溶液作为外相。将两相溶液通过连接到注射器的聚乙烯管，以内相2ml·h-1和外相40ml·h-1的流速注入上述制造的微流控装置中，微流控装置结构简图如图12所示，流速为由微流体泵控制。将两相溶液在微流控泵管道中混合后即可获得的msn@spacdex沉淀，输出端将沉淀收集在体积分数0.1％pva水溶液中，并以200rpm轻轻搅拌。随后，以10000rpm离心5分钟，并用去离子水洗涤数次。msn@spacdx保存在4℃的去离子水中。47.6.纳米复合材料的表征48.通过透射电子显微镜(tem，jeol 1400plus，美国)在80kv的加速电压下评估合成的msn和msn@spacdex的结构。通过使用一次性折叠毛细管细胞(dts1070，malvern，uk)，使用zetasizer nano zs测量msn@spacdx的表面zeta电位。49.7.用他克莫司加载msn(或者tac-np)。50.对于他克莫司的包封，使用浸渍法将其加载到msn纳米颗粒中。51.首先制备5.0mg·ml-1的他克莫司乙醇溶液，再将1.0mg msn重悬于该溶液中，使质量比为1:5(msn:他克莫司＝1:5)。将混合物在室温下缓慢搅拌24小时以达到msn负载的饱和。之后，通过10000rpm离心5分钟获得沉淀物，用乙醇洗涤3次，然后获得负载他克莫司的msn(他克莫司@msn)。仔细收集上清液中的所有他克莫司，并根据他克莫司在乙醇溶液中的标准曲线进行定量。载量按以下公式计算：载量％＝他克莫司在msn中的量/msn总量*100。52.8.体外药物释放试验53.他克莫司从纳米复合材料的体外释放在磷酸盐缓冲盐溶液中进行评估，ph7.4和5.0分别用于模拟细胞外和细胞内环境。通过将载药纳米复合材料(500μg)放入各自的缓冲溶液中并在100rpm和37±1℃下摇动来进行特定的释放曲线。游离他克莫司用作对照。由于他克莫司的低溶解度，将两亲性f-127(5％，w/v)添加到所有释放缓冲液中。样品首先在不同时间点离心(10000rpm，5min)，吸取100μl上清液，加入等体积的预热rpmi1640培养基代替吸取体积，然后通过hplc定量上清液中的药物浓度。54.9.纳米颗粒与cd3e抗体的结合55.为了使空纳米颗粒(np)和载药纳米颗粒(tac-np)与cd3eab结合，将5mg纳米颗粒(基于spacdex质量)添加到2ml新鲜制备的1mm双磺基琥珀酸二亚胺酯(bs3)pbs试剂(1mm，ph 7.4)中。在室温下用磁珠(200hz)将混合物搅拌6h。用pbs(1mm，ph 7.4)洗涤两次后，将bs3结合的纳米颗粒(pbs中bs3结合的纳米颗粒的浓度为5mg/ml)与抗小鼠cd3e抗体(0.15mg/ml，克隆号145-2c11，bd pharmingen，ca，usa)孵育并在4℃搅拌8-12h。游离的bs3被50mm甘氨酸封闭并在室温下搅拌2h。将cd3eab缀合纳米颗粒(np-cd3eab)用pbs洗涤，在10,000g离心5分钟，并重复三次。56.用bis-tris凝胶(np0326box，thermofisher，ca，usa)电泳检测结合抗体浓度，与梯度牛血清白蛋白标准品(cat.23208，thermofisher)在凝胶中使用考马斯亮蓝染色，使用imagej对所显示的条带面积进行比较后定量，用pbs稀释至100μg/ml。将1ml新鲜pbs用于重新悬浮靶向纳米缀合物，并在4℃下储存。57.二、毒性研究58.1.离体：取原代脾细胞测定纳米粒的毒性。根据制造商的说明进行水溶性四氮唑盐(wst-1)分析。59.简单地说，急性分离脾脏单细胞悬液(5×104/100μl/孔)接种于96孔微孔板上，分别用0、10、15、20、30、50、100μg/ml他克莫司(tac)或相同载药量的纳米粒(tac-np)孵育8小时。加入10μl/孔wst-1试剂(货号：cellpro-ro，罗氏)在37℃下培养4小时。用多功能酶标仪(infinite m1000 pro)测量450nm和600nm处的吸光度。60.2.在体：61.涉及动物的实验方案由浙江大学医学院第一附属医院研究伦理委员会批准(编号：2019-1231)，并根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(nih出版物编号：80-23)执行。8周龄雄性balb/c和c57bl/6小鼠(体重：23±2g)由浙江大学实验动物中心提供。动物可以自由获得水和标准的啮齿动物食物，并饲养在室温为25℃环境中，12小时的光/暗循环。62.c57bl/6小鼠每3天静脉注射pbs、他克莫司、tac-np或tac-np-cd3eab，共4周。他克莫司在tac、tac-np和tac-np-cd3eab组的剂量相当于1mgtac/kg小鼠。每周监测体重。在4周结束时，通过独木桥试验评估小鼠的神经毒性，代谢笼研究评估小鼠的肾毒性，并处死小鼠以获取血清和多器官。63.2.1神经毒性评估64.使用独木桥实验，评估药物对各组小鼠的神经毒性。驱使小鼠在长1m宽0.5cm的木棍上行走，记录穿越时间和后肢滑脱次数，每只小鼠重复行走三次；65.2.2肾毒性评估66.收集小鼠24h尿液，测定尿蛋白水平；收集小鼠血清，在生化分析仪(dri-chem 7000i，fujifilm)中使用fuji dri-chem试剂片测定血清肌酐(cr)和血尿素氮(bun)水平；67.2.3脂代谢评估68.收集小鼠血清，在生化分析仪中使用fuji dri-chem试剂片分析血清甘油三酯(tg)、胆固醇(tcho)和高密度脂蛋白(hdl)。69.2.4组织学检测70.将小鼠肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肺和脑组织用质量分数4％多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，切成3μm厚的切片，行苏木精和伊红(h&e)、高碘酸希夫(pas)和/或masson三色染色。肝脏组织留取部分行15μm厚冰冻切片，另外用油红o染色以观察中性脂质，以上染色图片均使用光学显微镜(dm4000，leica)拍摄。71.三、靶向性研究72.1.离体：将脾脏c57bl/c小鼠脾与i型胶原酶(1mg/ml，cat.17018029，thermofisher，ma，usa)在37℃下孵育15分钟，消化悬液通过40μm细胞过滤网(cat.431750，corning，ny，美国)，300g离心5分钟，在含体积分数10％热灭活fbs(cat.10100139c，gibco)rpmi 1640培养基(cat.11835030，gibco，ny，美国)中重悬至5x106细胞/ml。通过fitc偶联试剂盒(ab102884)将cd3eab标记fitc偶联试剂盒备用。73.为了评估np-cd3eab的结合特异性，将1/10体积的cy5.5-np或cy5.5-np-cd3eab加入制备好的细胞悬液中，37℃孵育1小时，加入cy5.5-np-cd3eab的细胞悬液则分成两份，其中一份预先加入10μg/ml的cd3eab孵育1h进行抗原封闭。结合后的细胞，经pbs洗涤，350g，8min离心沉淀，1ml pbs溶液重悬后，采用荧光图像分析来评估靶向能力。74.2.在体：静脉注射cy5.5-np-cd3eab或cy5.5-np(5mg/kg，200μl)入同型或异型肾移植术后小鼠c57bl/6体内,24小时后，吸入异氟醚麻醉小鼠并进行体内光谱成像(ivis)。然后，用过量的戊巴比妥钠(250mg/kg，华东医药)处死小鼠以收集脾脏用于器官ivis、组织免疫荧光(if)和透射电子显微镜(tem)分析。75.2.1ivis76.使用带有cy5.5滤光片组(激发675nm，发射720nm，曝光时间1s)的ivis lumina lt系列iii(perkin elmer，ma，usa)进行光谱成像，以获得np的cy5.5信号。使用living image 4.5版软件(perkin elmer)获取和分析所有图像，并以相同的荧光强度标度显示，荧光发射被归一化为每秒每平方厘米每球面度的光子(p/s/cm2/sr)。77.2.2if78.对脾脏行15μm的冰冻切片，用0.5％正常山羊血清室温封闭2h，cd3e抗体4℃孵育过夜，fitc标记。细胞核用hoechst(cat.62249,thermo fisher)染色，使用leica tcs-sp8共聚焦激光扫描显微镜摄取荧光图像。79.2.3tem80.脾组织在体积分数2.5％戊二醛溶液中固定过夜，用pbs(1mm，ph 7.4)小心洗涤3次；用1％(w/v)四氧化锇水溶液后固定1小时，纯水洗涤3次；用2％(w/v)醋酸铀水溶液染色30分钟，在体积分数50％-100％乙醇和100％丙酮中逐步脱水，在室温下渗透到树脂和丙酮混合物(1:1，v/v)中2小时，然后嵌入树脂中。使用超薄切片机(leica uc7)对嵌入的脾脏标本进行70nm厚度切割，并在电子显微镜(tecnai g2 spirit tem，thermo fisher)以80kv强度观察并拍照。81.四、疗效研究82.1.abmr疾病模型和药物处理83.在腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后，c57bl/6受体小鼠接受了来自balb/c供体小鼠的1cm直径皮肤移植物到背部区域，用于预致敏。皮肤移植两周后，将来自balb/c(同种异体移植，allo)或c57bl/6(同种移植，iso)供体小鼠的肾脏移植到c57bl/6受体小鼠体内，受体小鼠自有肾脏行切除术。84.移植术后，每日静脉注射无菌pbs、他克莫司(tac组)、tac-np(tac-np组)、tac-np-cd3eab(tac-np-cd3eab组)治疗allo受体小鼠，而iso小鼠则静脉注射无菌pbs。含药处理各组中，他克莫司用药当量为1mg/kg/d。肾移植术后5天，腹腔注射过量戊巴比妥钠处死小鼠，取样进行相应检测。85.1.1dsa测定86.balb/c供体小鼠脾细胞与c57bl/6受体小鼠血清在室温下孵育30分钟，用pbs洗涤。使用抗小鼠igm alexa647(cat.ab150123，abcam)和抗小鼠igg488(cat.ab96879，abcam)标记表面结合dsa，dsa信号的荧光强度通过cytoflex lx流式细胞仪测量。87.1.2c4d沉积88.对移植肾行15μm的冰冻切片，用0.5％正常山羊血清室温封闭2h，抗小鼠c4d抗体4℃孵育过夜，fitc荧光标记二抗，染色。细胞核用hoechst(cat.62249,thermo fisher)染色，使用leica tcs-sp8共聚焦激光扫描显微镜摄取荧光图像。89.1.3组织学检测90.将移植肾行3μm的石蜡切片，行pas染色，使用光学显微镜(dm4000，leica)拍摄。91.五、统计分析92.所有统计分析均使用graphpad prism 8(graphpad inc，ca，usa)进行。结果显示为平均值±标准偏差(sd)，除非另有说明。多组比较采用tukey后测方差分析。p《0.05具有统计学意义。93.结果部分94.一、纳米颗粒理化特性95.msn的代表性透射电子显微镜(tem)图像结果显示，其平均颗粒大小约为80纳米(图2a)。zeta电位测量显示表面电荷为-15.1±0.5mv。然后在60.0℃下将纳米粒子在0.6wt％的硝酸铵(nh4no3)乙醇溶液中搅拌6小时，重复两次以去除msn合成模板剂十六烷基三甲基氯化铵(ctac)。96.为了跟踪纳米粒子被细胞的摄取过程，将红色荧光染料sulfo-cyanine 5.5nhs酯(cy5.5)包裹在msn(cy5.5-msn)中，即在合成msn的过程中，将一定量的cy5.5与二氧化硅合成前驱体混合。他克莫司作为模型药物，在搅拌下将它们混合在乙醇溶液中负载到msn孔道里，孵育24小时后测定他克莫司的负载能力高达438.2mg/g。97.在载药的过程中，由于他克莫司和spacdex是不溶于水的，所以在搅拌下将一定量的spacdex加入到载药的他克莫司@msn乙醇溶液中。在微流控技术的帮助下，通过改变互溶的溶液中溶质的溶解度，将聚合物沉积在纳米粒子上。98.首先，将上述载药纳米颗粒和聚合物的混合溶液设定为微流控的内相，水溶液作为外相。两相溶液连接到微流控芯片上，通过微流控泵控制流速，两相溶液混合后得到他克莫司@msn@spacdex(即tac@msn@spacdex)的沉淀(图2b)。从图中可以清楚地看到他克莫司@msn@spacdex(即tac@msn@spacdex)的核/壳结构，这是因为核和聚合物壳的电子穿透性不同。这种新系统结合了微流控技术的简易合成和聚合物的生物相容性，以及对生理上相关的酸性条件敏感的受控有效载荷释放的额外优势。99.酸敏系统具有特别理想的特性，因为药物的释放可以在细胞摄取时响应溶酶体的酸化而被触发。根据标准曲线，在磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)中评估了他克莫司(图2c)从tac@msn@spacdex纳米复合材料中的体外释放曲线，分别用ph为7.4和5.0的pbs溶液来模拟细胞外和细胞内环境。在ph值为7.4时，药物浓度在几个小时内保持不变，几乎没有药物释放。相反，在ph值为5.0时，他克莫司的快速释放与spacdex在高酸度下的降解一致。该系统表现出快速释放行为，48小时内累计释放量为68.9％。他克莫司在内吞后以受控模式释放，这为调控他克莫司的释放通量以达到预期的生物效果提供了途径。100.二、毒性研究101.1.离体结果：102.wst-1结果(图3)显示，他克莫司在0-30μg/ml浓度范围内，生长曲线结果与无药物对照组无显著差异，提示其在这一浓度范围内对脾脏细胞无显著损伤，而在50-100μg/ml浓度范围，生长曲线值显著低于无药物对照组，体现出他克莫司对脾细胞的药物毒性；载药纳米粒在0-50μg/ml浓度范围内，生长曲线结果与无药物对照组无显著差异，提示其在这一浓度范围内对脾脏细胞无显著损伤，100μg/ml浓度时，生长曲线显著较无药物对照组降低，但仍高于他克莫司组。103.2.在体结果：104.2.1整体毒性评估105.每周对各组小鼠进行体重测量，结果显示在用药的4周内，各组小鼠体重与pbs注射对照组未见显著性差异(图4a)。106.2.2肾毒性评估107.pbs注射组血清肌酐(cr)在实验结束时为39.8±3.1μmol/l；tac组cr值在注射他克莫司4周后显著增高至78.3±14.9μmol/l(p《0.01vs pbs)；tac-np和tac-np-cd3eab的cr值分别为52.3±10.8μmol/l和48.8±14.2μmol/l，与pbs组无显著差异(p》0.05)，且均显著低于tac组(p《0.05vs tac-np，p《0.05vs tac-np-cd3eab)。pbs组、tac组、tac-np组和tac-np-cd3eab组血清bun水平分别为34.6±3.8mg/dl、28.8±0.7mg/dl、28.6±2.2mg/dl和28.6±1.8mg/dl，各组间均无显著性差异(p》0.05)。尿蛋白凝胶电泳显示tac和tac-np注射明显增加蛋白尿水平，而tac-np-cd3eab给药降低尿蛋白上调水平(图4b)。108.2.3脂代谢评估109.血清学检测结果(图4c)显示，各组血清tg和tcho没有显著差异(p》0.05)，但油红o染色结果显示，他克莫司注射4周后，tac组肝细胞中的脂滴沉积显著增加；使用np装载他克莫斯后，tac-np组和tac-np-cd3eab组肝细胞中的脂滴沉积较tac组显著减少；用tac-np-cd3eab治疗甚至提高了hdl胆固醇的血清水平，称为“好”胆固醇(2.67±0.16mmol/l vs 2.00±0.16in control group,p《0.001；2.67±0.16mmol/l对比tac组中的2.14±0.17和tac-np组中的2.12±0.14，p《0.01)。110.2.4神经毒性评估111.通过独木桥(beam-walking)测试(图4d)来反映小鼠运动功能缺陷和协调性。小鼠穿越独木桥的时间，各组无显著差异；在穿越过程中脚趾滑落次数各组为：pbs注射组5.9±0.7次、tac组10.4±0.8次、tac-np组6.8±1.0次、tac-np-cd3eab组5.6±0.4次，统计显示，tac组小鼠后脚滑落次数比其他三组都显著增高(p《0.01vs pbs,p《0.05vs tac-np,p《0.01vs tac-np-cd3eab),但其他三组间无显著差异，说明纳米粒子包裹后，tac的神经毒性至少对于精细运动能力的影响显著减少。112.2.5组织学检测113.使用苏木精和伊红(h&e)染色对大脑(海马和纹状体)、肺、心脏、肝脏、脾脏和肾脏进行了组织学评估，各组间内未观察到显著的结构差异(图5)；然而，与pbs、tac-np和tac-np-cd3eab组的小鼠相比，tac组的小鼠心脏、肝脏和肾脏中血管周围胶原沉积量相对增加。114.三、靶向性研究115.1.离体：细胞荧光结果(图7)显示，空白组和np组仅检测到cd3eab-fitc的绿色荧光，同时给予cy5.5-np-cd3eab和fitc-cd3eab则能在同一细胞表面检测到绿色和红色荧光；如提前使用cd3eab封闭细胞表面cd3e抗原，再给予cy5.5-np-cd3eab和fitc-cd3eab孵育的细胞则只有非常微弱的红绿色荧光。因此只有cd3eab标记的nps(np-cd3eab)可特异性结合cd3e+细胞，而nps-cd3eab的cd3+细胞靶向结合能力可被同源抗原竞争性抑制。图7为纳米颗粒靶向性细胞学验证结果图，fitc(绿色)信号为cd3eab-fitc，cy5.5(红色)信号为cy5.5-np，蓝色信号为细胞核(bar＝10μm)。116.2.在体：nps-cd3eab静脉注射24小时后，ivis结果显示小鼠脾脏cy5.5信号强烈，在异体肾移植小鼠脾脏中，cy5.5信号进一步增高约3.7倍，而np静脉注射组则无法检测信号cy5.5聚集。if结果显示，cy5.5-nps-cd3eab注射组脾脏组织中红色(cy.5.5)荧光信号与绿色荧光(fitc)信号有高丰度的重合，而在cy5.5-nps注射组，红色信号极少，并与绿色荧光信号未见重叠；tem结果显示，nps-cd3eab组脾细胞质中可检测到np信号，而np组脾未检测到np信号。这表明np体内靶向特异性还取决于连接抗体的亲和力，且信号密度受靶丰度的正相关影响。图8是纳米颗粒靶向性在体验证图a.在体ivis结果；b.小鼠脾脏组织荧光染色结果，fitc(绿色)信号为cd3eab，cy5.5(红色)信号为cy5.5-np，蓝色信号为细胞核(bar＝25μm)。117.四、治疗性研究118.1.np降低dsa水平119.pas染色结果(图9a)显示，在iso组中，肾组织无其他显著损伤；在allo组中，肾组织病理存在小球炎、小管上皮肿胀，间质炎及间质水肿，表现为典型的急性abmr表型；tac组中存在肾组织轻度间质炎症和小球炎；tac-np组小管炎和小球炎表型显著；np-tac-cd3e组中有轻度小管上皮细胞脱落，但并无abmr病理表型。24小时尿蛋白、血肌酐和尿素氮在allo组中急剧增加，tac组中显著下调，而tac-np中又有所回升，np-tac-cd3eab组各指标均为异体移植组间最低。小鼠24小时蛋白尿、血肌酐、血清尿素氮在allo组中显著增高；tac组中由于他克莫司的作用，均被显著下调；tac-np组中均有所回调，说明药物释放有所阻滞；np-tac-cd3eab中所有指标均为最低，较单纯他克莫司用药更低，并于iso组未见显著差异(图9b)。120.2.np降低移植肾组织中c4d沉积和病理改变121.免疫荧光对c4d和cd31共定位结果(图10a)显示：在iso组中，移植肾管周毛细血管中仅有微弱c4d信号，这与移植中缺血再灌损伤相关；在allo组中，移植肾管周毛细血管中有强烈c4d信号沉积，提示存在强abmr反应；tac组中，c4d信号被显著抑制，说明补体激活水平下调显著；而np-tac组比allo组信号呈现下降趋势，但仍可观察到高强度c4d信号，说明np-tac组中他克莫司有少量释放，并产生降低abmr的效应；np-cd3e-tac组中c4d信号微弱，说明补体激活水平维持在极低水平，很好的抑制了abmr的发生。122.通过流式细胞术测量皮肤移植致敏后的肾移植术后5天小鼠血清dsa水平(图10b)。iso组igg和igm均保持低丰度水平，与未移植组无显著差异；allo组中igm显著较iso组升高；他克莫司的使用将tac组中igm降低至与iso组无显著差异水平；np-tac组中igm有轻微下降，但仍显著高于iso和tac组；np-cd3-tac组显著下调igm水平，并与tac组无显著差异。123.3.np抑制脾效应tfh细胞激活和浆细胞生成124.利用流式细胞检测脾脏中浆细胞的产生和tfh的激活水平(图11a，b)，结果显示：与iso组比较，allo组浆细胞(cd138+)细胞比例显著增高，并且激活的tfh细胞(cxcr5+/bcl-6+)比例也显著增高；tac组中这两群细胞的比例显著较allo组降低(p《0.001)；tac-np组中浆细胞和激活的tfh细胞比例有微弱下调，但仍显著高于iso组；np-cd3e-tac组中浆细胞和tfh细胞群较tac组有进一步下降，呈现更好的抑制作用。另一方面，对于脾脏组织大体的检测(图11c)发现，allo组脾组织体积和重量较iso组显著增大，tac组和np-cd3e-tac组中，脾组织体积和重量则与iso组相似，因此也反映出abmr病理进程中脾脏淋巴细胞的高度增殖和动员(allo组)，并被他克莫斯或靶向用药显著降低。125.显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。