鳃耳综合征家系EYA1 基因一个新的无义突变

时间：2023-08-15

　　1.3 基因检测

　　1.3.1 样本制备

　　采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K_2) 抗凝管留取家系成员（先证者IIIa 、先证者妹妹IIIb 、先证者母亲IIb 、先证者舅舅IIa 、先证者父亲IIc ）外周血2mL 。采用德国Qiagen 公司的DNA 抽提试剂盒提取家系成员基因组DNA 。琼脂糖凝胶电泳质检DNA 质量。

　　1.3.2 捕获测序

　　采用超声波细胞打断仪片段化基因组DNA 至约150 ～200 bp ，末端修复（采用Kapa 末端修复酶）后进行样本纯化（采用AMPure 磁珠去除大片段以及各种杂质）并使用KAPA A -Tailing Buffer 和KAPA A-Tailing Enzyme 在DNA 3 ′端添加A 碱基，然后使用KAPA DNA Ligase 和KAPA Ligation Buffer 将特异Adapter 连接到DNA 片段上，最后进行文库扩增，完成文库制备。

　　1.3.3 杂交捕获

　　将制备好的DNA 文库样本采用芯片进行杂交捕获，用磁珠对杂交产物进行捕获，然后通过洗脱去除非捕获目的基因和其它杂质，并进行Qubit 对文库核酸进行核酸定量与片段大小的质控。

　　1.3.4 测序

　　对质控合格的文库采用hiseq2500 平台标准化上机测序。

　　1.3.5 测序数据质量评估

　　测序下机后的原始数据经Illumina 测序操控软件（Sequence Control Software ，SCS ）进行实时的分析处理并判定数据质量。

　　1.3.6 数据分析

　　去除测序接头以及引物序列后过滤低质量值数据，确保数据质量，经过质量控制之后得到的高质量的Clean Data 。后使用基因组分析工具包（Genome Analysis ToolKit ，GATK ）进行variation calling 分析。经过以上操作后，将得到的SNV 和Indel 突变位点与正常人群及已知致病人群数据进行比对（dbSNPA 、ESP6500 、PVFD 、ExAC 、HGMD 、本地人数据库等），最终将符合千人基因组频率<5% 且本地人群频率<2% 条件的突变点判定为可能致病的基因突变点并汇总。

　　结合家系患病情况将符合孟德尔遗传的突变位点参照ACMG 指南，进一步使用SIFT 、Polyphen-2 、Mutationtaster 等蛋白质功能预测软件，预测筛选出变异对蛋白结构和功能有影响的突变点，分析包括进化保守、对剪切位点变化、蛋白质特征的丧失和可能影响mRNA 量的变化等。最终将变异分类为致病（Pathogenic ）、可能致病（Likely Pathogenic ）、临床意义不明（Uncertain Significance ）、可能良性（Likely benign ）、良性（benign ）的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)/Indel / exon 基因拷贝数变异（copynumber variations ，CNV ）。

　　1.3.7 一代测序验证

　　采用BI 3730XL 测序仪将二代测序得到的高度可疑变异位点，在患者及其他成员中进行验证，同时对100 名正常人进行对照实验，基因序列分析采用DNASTAR 软件进行序列分析和比对[9] 。

　　2.1 临床检测结果

　　系谱图中IIIa 是先证者，查体可见她有双侧耳前瘘管（图2A ），双侧鳃裂囊肿（图2B ）。纯音听力图显示双耳重度感音神经性聋（图3A ），现佩戴助听器可以进行日常交流。中耳CT 未见明显异常。

　　IIIb 是先证者的妹妹，2 岁，查体可见她有双侧耳前瘘管，双耳前赘，双侧小耳畸形（图2C ）以及双侧鳃裂瘘管（图2D ），客观听力检查显示双耳重度感音神经性聋（图3C ），现佩戴助听器辅助听力。中耳CT 可见双侧前庭导水管扩大。IIb 是先证者的母亲，35 岁，查体可见她有双侧耳前瘘管（图2E ），因右颈侧反复肿痛行右颈部肿物切除术，术后病理证实为第二鳃裂囊肿，现可见右侧鳃裂囊肿术后疤痕（图2F ）。纯音听力图显示双耳极重度感音神经性聋（图3B ），现没有进行干预，存在言语障碍。中耳CT 显示双侧前庭导水管增宽。Ia 是先证者的姥爷，十年前已故。他有双侧耳前瘘管，双侧鳃裂瘘管，极重度感音神经性聋，未曾干预。所有健在患者都进行了肾脏超声及肾脏功能检查，均未发现异常。根据Chang[4] 的临床诊断标准，所有发病家系成员均符合鳃耳肾综合征谱系的鳃耳综合征的诊断。然而，先证者的舅舅（IIa ）和父亲（IIc ）以及已故的姥姥（Ib ）均表现正常。

　　2.2 分子检测结果

　　全外显子及剪切位点测序结果显示，先证者的EYA1 基因上发现一个未见报道的杂合突变位点，c.769C>T ( NM_000503) ，该突变为无义突变，使257 号谷氨酰胺突变成终止密码子，经Sanger 测序验证家系中所有发病成员均存在该突变位点，而未发病家系成员均未见该突变（图4 ），家系中该变异与表型共分离。100 名听力正常人检测结果为阴性。

　　鳃耳肾综合征谱系是罕见的常染色体显性遗传性耳聋综合征，在中国家系中报道较少。EYA1 基因的突变最常见，占了整个鳃耳肾综合征谱系的40%[4] 。现已发现EYA1 基因上的218 种突变形式（http://www.hgmd. cf.ac.uk/, 更新于2019 年10 月）可引起鳃耳肾综合征谱系，在不同人群中发现多种突变形式（例如点突变，小片段及大片段的缺失等）[10-13] 。

　　鳃耳肾综合征谱系的临床表现异质性较大，但目前被普遍接受的仍是Chang[4] 等2004 年提出的临床诊断标准。本研究中所有患者都符合诊断标准中的第一条“具有至少三项主要表现”且所有患者都缺乏肾脏表现，因此在临床上可以诊断为鳃耳肾综合征谱系中的鳃耳综合征。随着二代测序技术的蓬勃发展，已有学者证实高通量测序技术是遗传性耳聋行之有效的分子诊断工具[14] ，本研究利用二代测序技术对先证者进行全外显子测序，分子诊断结果进一步验证了临床诊断。我们对先证者进行了基因全外显子及剪切位点的测序，并对可疑位点进行了Sanger 验证，最终发现所有患者的EYA1 基因第9 个外显子上均存在c.769C>T 的杂合突变，该突变为无义突变，使257 号谷氨酰胺突变成终止密码子，而在家系中正常成员以及100 名正常人中均未发现该突变。既往研究已证明EYA1 基因类似的功能缺失性突变可以致病[15] ，根据ACMG[16] 指南，可以判定此无义突变为致病性非常强的突变（PVS1 ）。由于先证者的母亲和妹妹中耳CT 都显示大前庭导水管开大，为了判断是否同时存在其他耳聋基因突变，我们在补充实验中又分别对先证者的母亲和妹妹进行了全外显子及剪切位点测序，结果显示除了与先证者相同的突变外，不存在其它耳聋基因的变异。因此，EYA1 基因c.769C>T 突变位点与家系表型共分离，最终确定该突变为此家系的致病突变，而此突变位点在既往文献中未见报道。

　　4 结论

　　本研究为临床诊断为鳃耳综合征的家系找到了致病突变，即EYA1 基因c.769C>T 杂合突变，拓展了EYA1 基因在鳃耳综合征的突变谱，同时我们认为将临床诊断和基因诊断相结合是综合征性耳聋诊断的要点。