文章

　　《眼科新进展》  2017年4期

　　313-316  

　　出版日期：2017-04-05  

　　ISSN:1003-5141  

　　CN:41-1105/R

　　秋水仙碱对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖及凋亡的影响

　　    青光眼是一种不可逆性的致盲眼病，长期病理性眼压升高将损害眼球内各组织尤其是视神经及其视觉通路，进而损害视功能［1］。滤过性手术是治疗青光眼最常用的手术方式，但术后滤过通道的纤维瘢痕化常导致手术失败，给手术医师和患者带来很大的困扰。最新的研究证实，术后Tenon囊成纤维细胞的异常增殖和凋亡抑制参与了病理性瘢痕的形成［2-3］。因此，寻找低毒、高效抑制成纤维细胞增殖的药物一直是眼科医师努力的方向。

　　    秋水仙碱（colchicine）是从百合科秋水仙的球茎和种子中提取的一种生物碱，作为一种微管解聚药，最初主要是用于治疗关节疼痛和痛风，现被认为对肝、肺、血管等器官的纤维化也具有抑制作用［4-6］，这为进一步研究其防治青光眼术后滤过通道瘢痕化提供了启发。本研究观察秋水仙碱对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenon’s capsule fibroblasts，HTCFs）增殖和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制，为评估秋水仙碱作为青光眼滤过术后抗瘢痕形成药物提供实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料

　　1.1.1　主要试剂　秋水仙碱（美国Sigma公司），DMEM培养基和2.5 g·L-1胰蛋白酶（美国Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于杭州四季青公司，MTS试剂和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国Sigma公司），鼠抗聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、Caspase-3、 Caspase-9、β-actin及兔抗active-Caspase-3一抗（美国CST公司）。

　　1.1.2　主要仪器　CO2培养箱（Thermo Forma，美国）；超净工作台（苏州净化设备厂）；倒置相差显微镜（Olympus，美国）；普通光学显微镜（Olympus，美国）；Synergy2多功能酶标仪（Bio Tek，美国）；流式细胞仪（BD，美国）。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞体外培养及鉴定　HTCFs来源于本院斜视手术中所取的球结膜下Tenon囊组织，经由本院伦理委员会批准，并事先征得患者同意。采用组织块贴壁法进行HTCFs培养：Tenon囊组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm组织块，置于直径为100 mm培养皿中，加入含体积分数10% FBS的DMEM培养基培养、传代；使用倒置相差显微镜观察细胞生长，并进行细胞鉴定（vimentin染色），取第3~6代用于实验。

　　1.2.2　秋水仙碱对HTCFs增殖的影响　取对数生长期细胞，用DMEM完全培养基（含体积分数10%FBS）制成30×103mL-1单细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔培养板，37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，贴壁；待细胞长成单层后加入不同浓度（0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1）的秋水仙碱分别处理24 h、48 h和72 h，同时设只加培养基的空白对照组和不加药的阴性对照组，每组设4个副孔。实验终止前4 h每孔加入20 μL MTS/PMS混合液，继续孵育4 h。使用酶标仪以波长490 nm检测各孔吸光度值（OD值），实验重复3次。计算细胞增殖抑制率，即增殖抑制率=（阴性对照组OD值-实验组OD值）/阴性对照组OD值×100%。

　　1.2.3　流式细胞术检测细胞凋亡　取对数生长期细胞，收集并调整细胞至100×103mL-1，接种于6孔板；细胞贴壁后加入不同浓度秋水仙碱（0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、 10 μmol·L-1、20 μmol ·L-1）处理48 h，收集细胞，Annexin-V/PI染色后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.2.4　蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白表达　收集经不同浓度秋水仙碱（0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol ·L-1）作用48 h后的HTCFs，1500 r·min-1离心5 min，用PBS洗涤后，细胞裂解液于冰上裂解30 min，14 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。用Bradford法测定各组蛋白含量，每组样品取蛋白30 μg上样，分别使用体积分数10%及15%SDS-PAGE进行电泳分离蛋白质。电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜上，50 g·L-1脱脂奶粉常温下封闭1 h，依次一抗（鼠抗PARP、Caspase-3、Caspase-9、active-caspase-3 1∶1000）4 ℃封闭过夜，二抗（1∶10 000）37 ℃孵育2 h，设β-actin为内参照，洗膜后用ECL化学发光法观察结果。

　　1.3　统计学方法　采用SPSS 19.0统计分析软件处理实验数据，所有计量数值以均数±标准差（x?±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的邓尼特多重比较检验法(Dunnett’s multiple comparison test)，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　HTCFs体外培养特征　人眼球结膜下Tenon囊组织接种3~7 d后，HTCFs开始从组织块周围游离出来，倒置相差显微镜下观察示：细胞细长，呈典型的梭形或不规则三角形。细胞膜清晰，细胞浆丰富，细胞核呈圆形或椭圆形（图1A）。HTCFs体外繁殖较快，2~3周可长满融合，呈放射状或漩涡状贴壁走行。

　　2.2　HTCFs的免疫细胞鉴定　细胞经免疫化学Vimentin染色可见阳性产物呈棕色，均匀地分布于细胞浆中（图1B）。根据取材部位、细胞体外培养形态及免疫细胞化学鉴定，可以确定本实验中所培养的细胞为HTCFs。

　　2.3　秋水仙碱对HTCFs增殖的影响　不同浓度秋水仙碱对HTCFs增殖的影响见表1。由表1可见，随着药物浓度的增加、作用时间的延长，秋水仙碱对HTCFs的抑制作用逐渐增强，差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）。

　　2.4　秋水仙碱对HTCFs凋亡的影响　不同浓度的秋水仙碱作用HTCFs 48 h后，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡率，结果显示，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol ·L-1的秋水仙碱作用HTCFs的凋亡率分别为（18.37±4.26）%、（33.80±5.02）%及（52.00±2.00）%，存在剂量依赖性，差异具有统计学意义（F=91.59，P＜0.001；图2）。

　　

　　

　　

　　

　　2.5　秋水仙碱对HTCFs凋亡相关蛋白的影响　使用不同浓度的秋水仙碱处理HTCFs 48 h，提取蛋白，使用蛋白质印迹法检测各凋亡相关蛋白的表达（图3）：与对照组相比，秋水仙碱可以引起凋亡执行蛋白PARP的明显切割、激活，而随着秋水仙碱浓度的增加，Caspase-3和Caspase-9酶原降解增多，活化形式的Caspase-3条带逐渐增强，均呈剂量依赖性。

　　3　讨论

　　    流行病学资料显示，青光眼是全世界范围内导致视力丧失的主要眼病之一，仅次于白内障［1］。滤过性手术是治疗青光眼的最常用手术方式，可以通过人为地建立一条滤过通道，将房水引流至巩膜瓣和结膜瓣下，从而缓解升高的眼压［1］。但青光眼滤过术后2 a内的失败率高达15%~25%，主要与滤过通道内瘢痕形成有关［7］。而越来越多的研究表明，HTCFs是参与滤过手术后瘢痕形成的主要功能细胞：术后早期的创伤刺激会促发炎症细胞释放细胞因子，诸如血小板衍化生长因子、转化生长因子-β等，这些炎症细胞因子会募集和激活成纤维细胞，促进成纤维细胞增殖、移行、释放细胞外基质，以及引发纤维血管反应和伤口收缩，从而导致瘢痕形成［2］；此外，术后伤口修复过程中产生的结缔组织生长因子会抑制成纤维细胞的凋亡，进一步加重增生性瘢痕的形成，导致滤过手术的失败［3］。因此，寻找可以抑制成纤维细胞增殖和促进其凋亡的药物对于青光眼术后眼压的控制具有重要的临床意义。戴丽华等［8］曾发现全反式维甲酸可以在体外抑制HTCFs的增殖并诱导凋亡，同时无明显细胞毒作用。但除此之外，关于此类药物的研究报道较少。

　　    在本研究中，秋水仙碱浓度为5 μmol·L-1时即可抑制HTCFs的增殖，并会随着药物浓度的增加及作用时间的延长出现明显的增殖抑制效应。而这种药物性细胞增殖活力的降低通常与所诱导的细胞凋亡相关，因此我们用流式细胞术检测了秋水仙碱作用HTCFs 48 h后的细胞凋亡率，结果发现秋水仙碱可以诱导HTCFs发生凋亡，且呈剂量依赖性，20 μmol·L-1 时HTCFs的凋亡率可达50%。众所周知，细胞凋亡在生物体内自稳态的维持过程中发挥着重要的调节作用，此种调节一旦发生异常会引发疾病、肿瘤，甚至死亡。近来研究发现，手术后产生的结缔组织生长因子会抑制成纤维细胞的正常凋亡，导致其过度增殖，从而引起滤过通道瘢痕化［3］。因此，秋水仙碱的诱导凋亡作用对于青光眼滤过术后房水的正常引流具有重要的临床价值。

　　    细胞凋亡是一个复杂的，受多环节、多因素调节的程序性细胞死亡过程［9］。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族在凋亡过程中发挥着重要的作用，处于级联反应下游的Caspase-3被认为是最重要的效应凋亡蛋白酶，是细胞凋亡的关键执行者［10］。它的活化代表着细胞凋亡进入不可逆阶段，可以使许多与细胞结构维持及DNA修复等重要功能相关的激酶或蛋白发生裂解、失活，进而引起凋亡［11］。PARP原本与DNA损伤修复密切相关，而凋亡启动后它成为Caspase-3的主要切割对象，可加速凋亡进程［12］。因此，Caspase-3活化及PARP剪切通常被认为是凋亡发生的重要标志。在本研究中，HTCFs经秋水仙碱作用后，可发生明显的Caspase-3活化及PARP切割，表明秋水仙碱抑制HTCFs的活性与诱导凋亡密切相关，这与文献报道相符［13-14］。同时，作为启动凋亡内源性激活途径的关键因子Caspase-9也发生了明显的活化，预示着秋水仙碱可能是通过激活线粒体途径促进了HTCFs的凋亡，具体机制有待进一步探究。

　　    综上所述，本研究表明秋水仙碱可以在体外通过诱导细胞凋亡抑制HTCFs增殖，潜在的凋亡机制可能与内源性线粒体凋亡途径的激活有关。此外，虽然秋水仙碱已经被广泛证实可以抑制血管、肝脏、肾脏等器官的纤维化［4-6］，但其在青光眼滤过术后抗纤维化的临床实用性还有待进一步深入探讨。