一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用

　　一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用技术领域1.本发明属于细胞相关技术领域，特别是涉及一种鉴定移植后aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用。背景技术：2.急性髓系白血病是一种恶性血液肿瘤，五年生存率仅为25％。虽然造血干细胞移植(hsct)是作为治疗中/高危急性髓系白血病化疗后复发或耐药疾病患者的挽救治疗，提供最大的长期生存潜力。然而，高达30％的患者最终会因中危白血病而复发，而高危或难治性复发白血病的复发风险更高，因此复发仍然是hsct治疗失败的主要原因。以往的研究已经观察到t细胞耗竭与hsct后aml的复发率有关。然而该发现已不能满足当下技术人员对hsct后aml是否复发的判断需求。3.因此，本技术领域中，亟需一种帮助技术人员判断hsct后aml是否复发的研究方法。技术实现要素：4.为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用。该研究方法通过检测健康供者、aml患者和hsct后aml复发患者的nk细胞表型、细胞毒性、增殖能力以及转录组学分析，以鉴定aml患者骨髓中是否存在nk细胞耗竭现象。具体内容如下：5.第一方面，本发明提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法，所述方法为：6.研究aml患者复发时骨髓中nk细胞的成熟度表型，并在确定所述nk细胞的成熟度后，基于受体标志物研究所述aml患者复发时抑制性受体在nk细胞上是否处于过度表达；接着，进一步通过研究所述aml患者复发后nk细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析，来鉴定aml患者骨髓中nk细胞的耗竭现象。7.优选地，所述方法包括以下步骤：8.步骤1，设置复发组、cr组和hc组，并收集各组中每例的骨髓采集物bm；其中，所述cr组为移植后aml完全缓解的患者，所述hc组为健康供者组；9.步骤2，根据对所述复发组、所述cr组和所述hc组进行的nk细胞表型分析，研究aml复发患者nk细胞的耗竭表型；并根据所述耗竭表型，进一步研究所述aml复发患者nk细胞的抗肿瘤功能变化；10.步骤3，分别与原代aml细胞共培养4小时、24小时和48小时，并用7?aad和annexin v标记，研究所述nk细胞对原代aml细胞的杀伤作用；11.步骤4，通过组学分析，研究移植后所述aml复发患者nk细胞的耗竭表型。12.优选地，在所述步骤1中，所述复发组由至少15例hsct后首次血液学复发的aml患者组成。13.优选地，在所述步骤2中，所述耗竭表型包括aml复发患者nk细胞的成熟和表型变化。14.优选地，在所述步骤2中，进行所述nk细胞表型分析时，所有nk细胞在血样中用抗cd3、抗cd56的组合进行标记，采用受体标志物，以研究所述aml患者复发时抑制性受体在nk细胞上是否处于过度表达。15.优选地，所述受体标志物为nkg2a。16.优选地，在所述步骤3中，通过分析ifn?γ的产生、cd107a的表达以及对原代aml细胞的杀伤能力，来研究所述aml复发患者nk细胞的抗肿瘤功能变化。17.优选地，在所述步骤3中，每一个培养体系中的e:t比为1:1。18.第二方面，本发明提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法的应用，具体为：将上述第一方面所述的方法，用于研究急性髓系白血病hsct后复发患者骨髓nk细胞的耗竭。19.本发明提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用。其中，该方法为：研究aml患者复发时骨髓中nk细胞的成熟度表型，并在确定nk细胞的成熟度后，基于受体标志物研究aml患者复发时抑制性受体在nk细胞上是否处于过度表达；接着，进一步通过研究aml患者复发后nk细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析，来鉴定aml患者骨髓中nk细胞的耗竭现象。20.本发明提供的该方法，首次为白血病引起的nk细胞耗竭，提供了系统地研究方法，并证实了hsct后aml复发患者存在nk细胞耗竭现象，同时，nkg2a+nk细胞的高频率表达与复发风险相关，以及单独抑制nk细胞上的nkg2a可以显著降低肿瘤负担，从而提高体内长期存活率。因而，本技术提供的研究方法，在研究nk细胞耗竭和判断hsct后aml是否复发中具有巨大的应用价值。附图说明21.图1a示了本发明实施例中运用流式flowjo软件画出nk细胞的圈图策略；图1b示了本发明实施例中在三组间nk细胞占淋巴细胞比例的结果；图1c示了本发明实施例中cd56 brightnk占总体nk细胞的比例；图1d示了本发明实施例中cd56dimnk占总体nk细胞的比例；图1e示了本发明实施例中kir+nk占总体nk细胞的比例；图1f示了本发明实施例中cd57+nk占总体nk细胞的比例；22.图2a示出了本发明实施例中nkg2a+nk占总体nk细胞的比例；图2b示出了本发明实施例中的pd?1+nk占总体nk细胞的比例；图2c示出了本发明实施例中的tim?3+nk占总体nk细胞的比例；图2d示出了本发明实施例中的tigit+nk占总体nk细胞的比例；图2e示出了本发明实施例中nkg2c+nk占总体nk细胞的比例；图2f示出了本发明实施例中nkp30+nk占总体nk细胞的比例；图2g示出了本发明实施例中nkg2d+nk占总体nk细胞的比例；图2h示出了本发明实施例中nkp46+nk占总体nk细胞的比例；图2i示出了本发明实施例中抑制性和活化性受体在nk细胞上平均荧光强度的表达；23.图3a示出了本发明实施例中nk细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌cd107a的功能；图3b示出了本发明实施例中的nk细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌ifn?γ的功能；图3c示出了本发明实施例中的nk细胞与aml母细胞共培养后，杀伤aml母细胞的能力；24.图4a示出了本发明实施例中经go富集分析得出复发患者nk细胞相比于健康供者，相关信号通路受损的结果；图4b示出了本发明实施例中的复发患者相比于健康供者，nk细胞基因上表达差异的结果；图4c示出了本发明实施例中的复发患者相比于缓解患者，nk细胞上基因表达差异的结果；图4d示出了本发明实施例中ki?67+在ki?67抗体中的占比；图4e示出了本发明实施例中的复发组、cr组以及hc组中各自的骨髓nk细胞周期结果。具体实施方式25.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。26.在当下的技术研究中，虽然已经观察到t细胞耗竭与hsct后aml的高复发率有关。但目前的研究结果中，尚不足以证明aml中是否存在nk耗竭，并且还缺乏对抑制性受体和转录因子的探索。27.也就是说，现有技术中，aml中是否存在nk耗竭的研究极少，并且，关于nk细胞耗竭是否会导致aml控制失败的研究，也非常缺乏。同时，复发性aml患者是否诱导nk细胞耗竭，以及nk细胞耗竭是否与复发率相关，均尚不清楚。此外，针对nkg2a的过度表达是否导致白血病中nk细胞耗竭，也不清楚。28.本发明的发明人为了解决上述现有技术中存在的问题，在本实施例中提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用。具体内容如下：29.第一方面，本发明实施例提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法。该方法为：30.研究aml患者复发时骨髓中nk细胞的成熟度表型，并在确定所述nk细胞的成熟度后，基于受体标志物研究所述aml患者复发时抑制性受体在nk细胞上是否处于过度表达；接着，进一步通过研究所述aml患者复发后nk细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析，来鉴定aml患者骨髓中nk细胞的耗竭现象。31.本实施例中，优选地，该研究方法包括以下步骤：32.步骤1，设置复发组、cr组和hc组，并收集各组中每例的骨髓采集物bm；其中，cr组为移植后aml完全缓解的患者，hc组为健康供者组。33.在本实施步骤中，优选地，复发组由至少15例hsct后首次血液学复发的aml患者组成。34.具体实施时，收集72例骨髓标本，包括12例健康献血者(hc组)和30例hsct后首次血液学复发的aml患者(复发组，排除单纯髓外复发患者)以及30例缓解期匹配的aml患者(cr组，于2018年5月至2020年11月在北京大学人民医院血液病研究所进行。所有患者在未经治疗的情况下至少30天内出现免疫表型明确的急性髓系细胞白血病。aml的诊断与cr或复发状态与先前报告一致。供体选择和干细胞采集如前所述。移植方案和移植后时间在复发和非复发患者中进行分类和匹配(54?885对73?897d)。所有患者在复发或骨髓采集前均达到完全供体嵌合。所有存活时间超过100天的慢性移植物抗宿主病(cgvhd)患者中，仅有9例发生局限性慢性cgvhd，无轻度或重度cgvhd。复发和非复发患者cgvhd的发生率具有可比性。35.发明人在治疗前或治疗后至少收集一次bone marrow(骨髓采集物)。在样本采集之前，患者和捐赠者都提供了书面知情同意书。根据《赫尔辛基宣言》，本研究由北京大学人民医院人类伦理审查委员会批准。36.步骤2，根据对步骤1中的复发组、cr组和hc组进行的nk细胞表型分析，研究aml复发患者nk细胞的耗竭表型；并根据耗竭表型，进一步研究aml复发患者nk细胞的抗肿瘤功能变化。37.在本实施步骤中，耗竭表型包括aml复发患者nk细胞的成熟和表型变化。38.在本实施步骤中，进行nk细胞表型分析时，优选地，所有nk细胞在血样中用抗cd3、抗cd56的组合进行标记；采用受体标志物，以研究aml患者复发时抑制性受体在nk细胞上是否处于过度表达。在本实施步骤中，优选地，受体标志物为nkg2a。39.由本实施步骤可以得出以下结果(即：急性髓细胞白血病复发时骨髓nk细胞的耗竭表型)：40.为探讨aml复发患者nk细胞的成熟和表型是否发生改变，发明人对复发组、cr组和hc组进行了nk细胞表型分析。图1a示出了本发明实施例中运用流式flowjo软件画出nk细胞的圈图策略；由图1a可知nk细胞是由cd3,cd56抗体标记后圈出再进行下一步分析的。41.在本实施步骤中，发明人通过流式细胞术分析上述三组间的受体标志物是否与移植后aml复发相关。图1b示出了本发明实施例中在三组间nk细胞占淋巴细胞比例的结果；图1c示出了本发明实施例中cd56brightnk占总体nk细胞的比例；图1d示出了本发明实施例中cd56dimnk占总体nk细胞的比例；图1e示出了本发明实施例中kir+nk占总体nk细胞的比例；图1f示出了本发明实施例中cd57+nk占总体nk细胞的比例。由图1b?图1f可知，对nk细胞表面受体的分析显示，与hc相比，aml患者的抑制性受体(包括nkg2a、pd?1和tim?3)(p<0.05)显著过度表达。42.并且，图2a示出了本发明实施例中nkg2a+nk占总体nk细胞的比例；图2b示出了本发明实施例中的pd?1+nk占总体nk细胞的比例；图2c示出了本发明实施例中的tim?3+nk占总体nk细胞的比例；图2d示出了本发明实施例中的tigit+nk占总体nk细胞的比例；图2e示出了本发明实施例中nkg2c+nk占总体nk细胞的比例；图2f示出了本发明实施例中nkp30+nk占总体nk细胞的比例；图2g示出了本发明实施例中nkg2d+nk占总体nk细胞的比例；图2h示出了本发明实施例中nkp46+nk占总体nk细胞的比例；图2i示出了本发明实施例中抑制性和活化性受体在nk细胞上平均荧光强度的表达。43.由图2a?i可知，复发患者nkg2a受体在nk细胞上的表达明显高于cr组(p＝0.00346)或hc组(p＝0.0018)，各抑制性受体的mfi(平均荧光强度)分析与上述频率结果相似；同时，nk细胞活化受体(如nkp30、nkp46、nkg2d和nkg2c)的百分比和mfi在这些组之间具有可比性。44.由上述的研究结果可知，nkg2a受体在nk细胞上的过度表达，能反映nk细胞的耗竭表型。即，这些结果表明nk细胞的耗竭表型在白血病hsct后复发中起重要作用。45.步骤3，分别与原代aml细胞共培养4小时、24小时和48小时，并用7?aad和annexin v标记，研究所述nk细胞对原代aml细胞的杀伤作用。46.在本实施步骤中，每一个培养体系中的e:t比为1:1。47.在本实施步骤中，通过分析ifn?γ的产生、cd107a的表达以及对原代aml细胞的杀伤能力，来研究所述aml复发患者nk细胞的抗肿瘤功能变化。48.具体实施时，测定nk细胞的细胞毒性和细胞因子分泌，用cd107a的表达和ifn?γ的分泌来进行测定，以mhc?ⅰ类缺陷的人红白血病k562细胞株为靶细胞。bmmcs以1×106cells/ml在1640完全培养基中培养，如前所述，加入/不加入1000iu/ml白细胞介素?2(il?2，北京双鹤制药)作为效应剂，培养12?16小时。bmmcs(骨髓单核细胞)和肿瘤细胞在含有抗cd107a(bd biosciences)的新鲜培养基中，效应剂与靶点(e:t)的比率为5:1(即效靶比为5:1)。mhcⅰ类缺陷的人红白血病k562细胞株，在96孔圆形平板上共培养4小时，并在1h后加入高尔基氏阻断剂(0.7μl/ml，bd biosciences)。cd107a表达与ifn?γ在使用抗cd3、抗cd56和其他表面标记物鉴定亚群后，通过细胞内标记量化nk淋巴细胞的产生。49.将来源于骨髓基质细胞的纯化的nk细胞，分别与原代aml细胞共培养4小时、24小时和48小时，每一个培养体系中的e:t比例为1:1，并用7?aad(bd biosciences)和annexin v(bd biosciences)标记，探讨其诱导aml细胞凋亡的细胞毒作用。50.通过本实施步骤，得出的研究结果(aml复发时nk细胞功能失调)，具体如下：51.根据aml复发患者nk细胞的耗竭表型，进一步检测复发后aml患者bm?nk细胞的功能变化。为研究复发组nk细胞是否出现功能障碍，发明人通过分析ifn?γ的产生、cd107a的表达以及对原代aml细胞的杀伤能力来评价bm?nk细胞的功能。图3a示出了本发明实施例中nk细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌cd107a的功能；图3b示出了本发明实施例中的nk细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌ifn?γ的功能。由图3a和图3b可知，与cr患者相比，在复发患者中观察到：ifn?γ的分泌(p＝0.0003)和cd107a(p＝0.0004)对k562的脱颗粒作用，显著降低。52.图3c示出了本发明实施例中的nk细胞与aml母细胞共培养后，杀伤aml母细胞的能力。由图3c可知，在联合培养的整个动态过程中，复发患者的nk细胞对原发性aml细胞的靶向杀伤率明显低于cr组(p＝0.0137)和hc组(p＝0.0009)，即，在复发患者中，nk细胞杀伤aml母细胞的能力是显著降低的。因而，复发组的nk细胞对靶向肿瘤细胞系和原发性白血病细胞的细胞毒作用，均存在缺陷。53.由上述研究结果可知，nk细胞与aml母细胞共培养后，杀伤aml母细胞的能力在复发患者中是显著降低的。由此可知，在复发部位，bm?nk细胞表现出与耗竭表型一致的功能损害。54.步骤4，通过组学分析，研究移植后所述aml复发患者nk细胞的耗竭表型。55.本实施步骤的具体实施过程包括通过rna?seq的分析方法，对基因的表达进行了分析。具体内容如下：56.具体实施时，用流式细胞仪从复发和完全缓解的aml患者以及健康人的nk细胞中分离纯化nk细胞，并用含有10％β?巯基乙醇的rneasy裂解缓冲液(rlt，qiagen)保存，然后放在冰上以避免rna降解。根据制造商的规范，使用rneasy迷你试剂盒(qiagen)提取bm nk细胞样本的rna。使用q?buit4荧光计(invitrogen)定量rna浓度。用neb?next?poly(a)mrna磁性分离模块试剂盒(neb)和neb?next?ultra?rna文库制备试剂盒(neb?e7500s)构建了用于illumina双端复合测序文库(neb?e7500s)的文库。最后在agilent bioanalyzer 2100系统上对产品质量进行了评价。样本在illumina nova?seq平台上测序，并产生150bp配对末端读取。fastq格式的原始数据(raw reads)首先通过内部perl脚本进行处理。在这一步中，通过从原始数据中删除包含适配器的读取、包含ploy?n的读取和低质量的读取来获得干净的数据(即，干净的读取)。同时计算了q20、q30和gc含量。参考直接从基因组网站下载的基因组和基因模型注释文件。使用bowtie v2.2.3构建参考基因组的索引，并使用tophat v2.0.12将成对末端清洁读数与参考基因组对齐，其中包含从ensembl下载的人类基因组参考序列版本19(hg19)。ht?seqv0.6.1被用来计算每个基因的读取数。然后根据每个基因的长度计算出每个基因的fpkm，并对该基因进行读取计数。fpkm，即每百万碱基对中转录序列每千碱基的预期片段数，同时考虑了测序深度和基因长度对读取计数的影响，是目前估计基因表达水平最常用的方法。57.在差异基因表达分析之前，对于每个测序文库，读取计数由edge?r程序包通过一个标度归一化因子进行调整。使用deg?seq r软件包(1.20.0)对两种情况进行差异表达分析。用benjamini&hochberg法调整p值。校正后的p值为0.05，log2(倍数变化)为1，作为显著差异表达的阈值。差异表达基因的基因本体(go)富集分析是通过go?seq?r软件包实现的，该软件包修正了基因长度偏差。校正p值小于0.05的go项被认为是差异表达基因的显著富集。58.kegg是一个数据库资源，用于从分子级信息，特别是基因组测序等高通量生成的大规模分子数据集，了解细胞、生物体和生态系统等生物系统的高级功能和效用。因而，发明人使用kobas软件测试了kegg通路中差异表达基因的统计富集情况。59.图4a示出了本发明实施例中经go富集分析得出复发患者nk细胞相比于健康供者，相关信号通路受损的结果。由图4a可知，利用go富集分析发现复发患者的nk细胞相比于健供者来说，有以下途径受损：nk细胞脱颗粒作用，nk细胞分化，nk细胞活化，nk细胞介导的细胞毒作用，nk细胞介导的免疫。60.图4b示出了本发明实施例中复发患者相比于健康供者，nk细胞基因上表达差异的结果。由图4b可知，复发患者骨髓nk细胞与健康供者相比，转录组水平上调与下调基因，其中与耗竭相关的tbx21，eomes显著下调。61.图4c示出了本发明实施例中复发患者相比于缓解患者，nk细胞上基因表达差异的结果。由图4c可知，复发患者骨髓nk细胞与健康供者相比，转录组水平上调与下调基因，其中与耗竭相关的tbx21显著下调。62.由本实施步骤的组学分析数据(图4a?c)可知，复发患者的nk细胞也是耗竭的。63.此外，在本实施例中，还通过对nk细胞周期的研究，来研究移植后所述aml复发患者nk细胞的增殖能力。64.具体实施时，为检测nk细胞周期，用dapi(4'，6?二氨基?2?苯基吲哚)加ki?67抗体对新鲜bmmc标本进行nk细胞内染色。65.在该增设的实施步骤中，为证实aml复发状态下细胞周期被阻断。发明人用dapi加ki?67抗体检测nk细胞的细胞周期，来测定骨髓nk细胞的增殖能力。图4d示出了本发明实施例中ki?67+在ki?67抗体中的占比。由图4d可知，与cr(0.002)和hc(<0.0001)组相比，复发患者的骨髓nk细胞显示ki?67+比率显著增加，而ki?67+表示增殖活跃的细胞，由此可见，复发患者骨髓nk细胞的增殖能力是显著更高的。图4e示出了本发明实施例中复发组、cr组以及hc组中各自的骨髓nk细胞周期结果。由图4e可知，在复发患者的nk细胞周期中，虽然有27.02％的细胞处于g1期，但是仅1.49％细胞进入了s/g2/m期，由此可见，复发患者的nk细胞的细胞周期被阻滞于g1向s/g2/m期分化；并且，与cr组相比可知，细胞周期结果显示复发组nk细胞g1期明显高于cr组(27.02％vs13.56％，p<0.001)。。66.因此，由图4d?e可知，复发组只有1.49％的nk细胞从g1期进入s/g2/m期，与cr组相当。因此，复发性aml患者nk细胞周期从g1期限制到s/g2/m期。67.由上述步骤2?4的研究数据表明，可以证实在移植后复发的aml患者的nk细胞是存在耗竭的，并且与患者预后是相关的，并且原始表型、抗肿瘤功能受损、细胞周期停滞和转录组异常应共同导致复发的aml患者nk耗竭。68.本发明提供的该方法，首次为白血病引起的nk细胞耗竭，提供了系统地研究方法，并证实了hsct后aml复发患者存在nk细胞耗竭现象，同时，nkg2a+nk细胞的高频率表达与复发风险相关，以及单独抑制nk细胞上的nkg2a可以显著降低肿瘤负担，从而提高体内长期存活率。因而，本技术提供的研究方法，在研究nk细胞耗竭和判断hsct后aml是否复发中具有巨大的应用价值。69.此外，本实施例的研究结果，提示了：nkg2a作为挽救白血病nk细胞衰竭耗竭的检查点，这是首次在白血病中得到证实。nkg2a可能是白血病发展过程中nk耗竭的一个潜在的天然免疫检查点。70.在此，发明人需要指出的是，在上述的统计分析中，使用graphpad prism软件版本8进行分析。有关所用统计数据的详细信息，请参见上述各图例。采用kaplan?meier法和log?rank计数分析小鼠的复发率和生存率，多变量分析采用cox模型。组间比较采用单因素方差分析(anova)进行统计分析。样本以平均值或中间值显示，带或不带显示sd的误差条。显著性假设为*p<0.05**p<0.01***p<0.001，****p<0.0001。71.第二方面，本发明实施例提供了一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法的应用，具体为：将上述第一方面所述的方法，用于研究急性髓系白血病hsct后复发患者骨髓nk细胞的耗竭。72.对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。73.以上对本发明所提供的一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。