红景天苷衍生物及其应用

　　1.本发明属于医药化学领域，具体而言，涉及一种红景天苷衍生物及其应用。背景技术：2.外周动脉疾病(peripheral artery disease)是指由于动脉粥样硬化等导致动脉阻塞，从而限制心脏以外的组织的血流供应。下肢缺血性疾病(limb ischemia)是一种最常见的外周动脉疾病，由于血管堵塞、血栓、高血糖等原因导致远端(下肢)供血不足。由于氧气是由血液中的红血球运输到各个组织器官，供血不足的结果是引起下肢组织缺氧、缺营养，严重时会导致组织坏疽，组织缺失(tissue loss)甚至个体的死亡。3.目前，下肢缺血性疾病尚未有有效的治疗和控制方法，严重时需要对患者进行截肢，给患者带来巨大的痛苦和损失。目前被认为有望起到良好效果的治疗方法是通过促进血管新生，改善远端供血的情况，从而阻止组织继续坏死并起到改善下肢功能的作用。4.作为下肢缺血性疾病的药物，目前有第一代治疗药物和第二代治疗药物。其中，第一代治疗药物利用的是单个血管新生因子(血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，vegf)等)，但临床试验结果不理想，新生血管不成熟，出现漏的情况，缺乏功能性(参见：therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia.nature reviewscardiology,2013,10(7)：387-96)。治疗结果不理想的原因被认为是由于血管重构是个多因子参与的复杂的过程。第二代治疗药物则利用了多种血管新生因子的组合(成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2，fgf2)和血小板衍生因子(platelet-derivedgrowth factor，pdgf)；vegf和血管生成素-1(angiopoietin-1，ang1))，虽然有一定的效果，然而血管新生因子种类繁多，它们在血管重构的不同的阶段起到不同的作用。因此，存在着血管新生因子种类的选择、组合时的比率、何时给药等难题。另外，目前对下肢缺血性疾病的治疗手段还面临外来血管新生因子的局部化，因此不足以在广泛的缺血缺氧区域内诱导足够的新生成熟血管的难题。5.糖尿病足是糖尿病的最常见、最严重并发症之一。由于血糖控制不理想，导致下肢外周血管病变，从而引起下肢供血不足并导致下肢组织细胞缺氧，加上高糖条件下组织修复、伤口愈合能力明显下降，严重时出现组织坏疽、组织缺失(tissue loss)甚至死亡；临床上严重患者往往需要截肢。糖尿病足(diabetic foot)的理想的治疗方法为改善供血状态，目前针对治疗血管病变的方法有利用支架、搭桥、气囊扩张术等；另外，最近，由于其无侵袭性等优势，促进血管重构被认为是最好的治疗途径。6.在本发明的前期研究中，已经发现一种治疗下肢缺血性疾病的药物，该药物含有红景天苷作为活性成分。另外，在本发明的前期研究中，已经发现在小鼠糖尿病足模型中，红景天苷在高糖、低氧条件下特异地促进血管新生因子的表达和分泌。相关的研究成果已经获得中国授权专利cn105687216b和cn105535001b。然而，如何进一步提高红景天苷治疗糖尿病以及下肢缺血性疾病，仍然是本领域亟待解决的技术问题。7.低氧应激蛋白hypoxia inducible factor-1α(hif-1α)是细胞和机体应对低氧/缺氧的关键因子。hif-1a在常氧条件下被prolyl hydroxylase domain家族(phd家族；其中包含phd1、phd2和phd3)以氧气为底物进行羟基化，而羟基化后的hif-1a将通过泛素化/蛋白酶降解途径降解，使其在常氧条件下处于低表达水平。而在低氧/缺氧条件下，由phd家族诱导的羟基化下降，导致hif-1a蛋白质被稳定化。hif-1a蛋白质的积累促进其下游因子表达上升，而其下游因子包括vegf、pdgf-bb等血管新生因子，也包括epo(红细胞生成素)、ho-1等其它低氧应激相关因子(参见：hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.cell,2012,148:399–408)。因此，hif1-a蛋白子的上升有利于促进血管新生从而治疗或改善下肢缺血性疾病。此外，由epo诱导的红细胞上升有利于提高携氧量，从而与血管新生一起缓解例如高原反应等缺氧状况导致的疾病和身体不适(参见：regulation of erythropoiesis byhypoxia-inducible factors.blood reviews,2013,27(1):41-53)。技术实现要素：8.本发明的目的在于如何提高红景天苷治疗糖尿病足以及下肢缺血性疾病的活性，本发明通过在红景天苷(salidroside)的结构基础上延伸出多个系列糖苷类似物从而得以完成。为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下技术方案：9.本发明一方面涉及一种红景天苷衍生物，所述衍生物具有如下的结构：[0010][0011]其中r1＝h、oh、ome、f；[0012]r2＝h、oh；[0013]r3、r4、r5、r6同时为羟基，或这4个取代基中任意一个为h或-ome；[0014]a＝-(ch2)n-、n＝2或3；[0015]-o-(ch2)n-、n＝2或3；[0016]-o-(ch2ch(ch3)2)-、-o-(ch2ch2ch(ch3)2)-、-o-(ch2c(ch2)3)-、[0017]-c6h4-ch2-、-o-c6h4-、-o-c6h4-ch2-；[0018]在本发明的一个优选实施方式中，其中a为-o-c6h4-、-o-c6h4-ch2-，且r1和r2位于苯环上a的邻位、间位和/或对位。[0019]在本发明的一个优选实施方式中，所述r1为-ome，r2为h，且r1位于苯环上x的间位和/或对位。[0020]在本发明的一个优选实施方式中，所述衍生物选自c-1至c-33中的任意一种。[0021][0022]在本发明的一个优选实施方式中，所述衍生物选自c-30或c-31。[0023]本发明另一方面还涉及上述衍生物在制备hif-1α诱导剂中的应用。[0024]本发明另一方面还涉及上述衍生物在制备治疗下至缺血性疾病和/或缓解高原反应的药物中的应用。[0025]在本发明的一个优先实施方式中，所述衍生物用于促进hif-1α的表达水平。[0026]在本发明的一个优先实施方式中，所述衍生物用于促进hif-1α蛋白质的表达水平。[0027]在本发明的一个优先实施方式中，所述衍生物用于通过抑制phd3的表达水平从而促进hif-1α的表达水平。[0028]在本发明的一个优先实施方式中，所述衍生物用于通过抑制phd3的表达水平从而促进hif-1α蛋白质的表达水平。[0029]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于血管生成。[0030]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于血液灌注恢复。[0031]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于促进高血糖和非高血糖状态下的骨骼肌细胞活力。[0032]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于增强高血糖和非高血糖状态下骨骼肌细胞血管生成因子的分泌和迁移潜能力。[0033]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于增强高血糖和非高血糖状态下增强骨骼肌细胞血管生成能力。[0034]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物用于增强高血糖和非高血糖状态下血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移能力。[0035]在本发明的一个优选实施方式中，所述药物为肌肉注射制剂。[0036]本发明另一方面还涉及上述衍生物在制备下肢缺血性疾病的药物中的应用。[0037]发明效果[0038]本发明通过对红景天苷的结构进行修饰，有效提高了红景天苷的药物活性。附图说明[0039]图1：(a)红景天苷各部分结构修饰示意图。(b)使用5×hre-luc报告基因活性检测的第一轮筛选。(c)对在第一轮5×hre-luc报告基因筛选中活性大于salidroside(红景天苷)的化合物进行的第二轮筛选，考察它们对pdg-b启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因(pdgf-b-luc)的活性。(d)蛋白免疫印迹检测在相同浓度(300μm)下，sa、c-30或c-31处理的c2c12细胞中血管生成因子的蛋白表达水平。荧光素酶报告基因活性计算为萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶化学发光值的比值。相对的荧光素报告基因活性由每种化合物处理后的细胞荧光素酶报告基因活性与对照组细胞荧光素酶报告基因活性进行归一化所得。β-actin作为蛋白免疫印迹的负载内参。所有实验均在高血糖状态下进行，数据以均数±sd表示(n＝3)。sa相对于空白对照，##p《0.01；类似物相对于sa,*p《0.05；**p《0.01；ns：无显著差异；sa：salidroside。[0040]图2：c-30和c-31可促进高血糖状态下的骨骼肌细胞活力。(a)高血糖条件下,不同浓度c-30和c-31处理的c2c12细胞在不同时间点的细胞总数(n＝3)。(b和c)edu核素掺入法检测高血糖下不同浓度c-30处理的c2c12细胞增殖能力。(b)代表性图像，标尺：200μm。(c)相对的细胞增殖率由edu阳性细胞与hoechst阳性细胞的比值再与对照组比较所得(n＝6)。(d和e)edu核素掺入法检测高血糖下不同浓度c-31处理的c2c12细胞增殖能力。(d)代表性图像，标尺：200μm。(e)相对的细胞增殖率用edu阳性细胞与hoechst阳性细胞的比值再与对照组比较(n＝6)。(f和g)高血糖条件下c-30和c-31(终浓度：15μm和30μm)处理的c2c12细胞凋亡率，annexin-v/pi双染色，流式细胞仪分析结果。(f)显示代表性图像和(g)定量结果(n＝3)。数据以均数±sd表示。con：对照组细胞；**p《0.01；*p《0.05；ns：无显著性差异。[0041]图3：高血糖状态下c-30增加骨骼肌细胞总数。高血糖条件下，不同浓度c-30和salidroside处理后的c2c12细胞总数。数据以平均值±sd表示(n＝3)。h-glu：高血糖下培养的空白组细胞。**p《0.01；ns：无显著性差异。[0042]图4：c-30在正常血糖状态下增加骨骼肌细胞增殖，抑制凋亡率。(a和b)edu-掺入法检测30μm c-30处理正常血糖条件下c2c12细胞的增殖能力。代表性图像(标尺：200μm：a)、edu阳性细胞与hoechst阳性细胞的比值统计结果(n＝6；b)。(c和d)annexin-v/pi-染色，流式细胞仪分析30μm c-30处理的c2c12细胞在正常血糖条件下培养下的凋亡率。代表性图像(c)和结果统计(n＝3，d)。数据以均数±标准差表示。n-glu：正常血糖下培养的c2c12细胞。**p《0.01。[0043]图5：高血糖下c-30处理的骨骼肌细胞的转录组分析。(a)高糖条件下30μmc-30处理12小时后的c2c12的rna测序分析结果，热图表示差异基因集聚类分析结果。(b)上调基因的基因本体(go)富集分析。(c)上调基因的kegg通路富集分析。(d)血管生成的关键基因的倍增变化。(e和f)30μm c-30对c2c12细胞关键血管生成因子表达的验证。(e)采用qrt-pcr分析mrna表达水平，(f)采用western blotting测定蛋白水平。β-actin进行qrt-pcr归一化，并作为western blotting内参对照。数据以均数±sd表示(n＝3)。**p《0.01。[0044]图6：c-30增强了高血糖状态下骨骼肌细胞血管生成因子的分泌和迁移潜能。(a)蛋白免疫印记检测30μm c-30或salidroside处理的c2c12细胞中血管生成因子的蛋白表达水平。(b和c)用elisa检测高糖条件下，30μm c-30或salidroside处理的c2c12细胞培养液中vegf-a(b)和pdgf-bb(c)的分泌量。(d和e)鬼笔环肽染色分析在高血糖状态下用30μm c-30或salidroside处理的c2c12细胞中f-肌动蛋白聚合情况；(d)代表性图片(标尺：100μm或50μm)；(e)分形维数定量分析(n＝6)。(f和g)用transwell小室实验检测30μm c-30或salidroside处理的c2c12细胞的迁移。(f)代表性图像，标尺：100μm；(g)迁移到transwell下室的细胞数统计分析(n＝6)。数据以平均值±sd表示(n＝3)。n-glu：在正常血糖条件下用空白溶剂处理培养的细胞；h-glu、h-glu+sa、h-glu+c-30：高血糖条件下分别用空白溶剂、30μm salidroside或30μm c-30处理培养的细胞。**p《0.01；*p《0.05。[0045]图7：shrna靶向hif-1α的敲减效率。(a)shhif-1α表达质粒转染的c2c12细胞中hif-1α的mrna表达水平。(b)shhif-1α表达质粒转染c2c12细胞后的蛋白表达水平。代表性图像(左)和定量统计结果(n＝3；右)。β-actin为qrt-pcr的内参和蛋白免疫印迹实验的对照。数据以平均数±sd(n＝3)。**p《0.01。[0046]图8：高血糖状态下hif-1α对c-30增强骨骼肌细胞血管生成能力至关重要。(a)蛋白免疫印迹检测30μm c-30处理的敲减了hif-1α的c2c12细胞中hif-1α蛋白及血管生成因子的表达水平。左边为代表性图像，右边为定量结果(n＝3)。(b和c)edu-掺入法检测hif-1α敲减后的c2c12细胞用30μm c-30处理后的增殖能力。b为代表性图像(标尺：200μm)，(c)为定量分析结果(n＝6)。(d和e)annexin-v/pi双染色后流式细胞仪分析hif-1α敲减后的c2c12细胞用30μm c-30处理后的凋亡率。d为代表性图像，e为定量分析结果(n＝3)。(f和g)transwell实验检测hif-1α敲减后的c2c12细胞用30μm c-30处理后的迁移能力。(f)为代表性图像(标尺：100μm)，(g)表示迁移到transwell下室细胞数统计结果(n＝6)。数据以平均值±sd表示(n＝3)。con：转染shcon的c2c12细胞；c-30：30μm c-30处理的c2c12细胞；shhif-1α：转染抗hif-1αshrna表达载体的c2c12细胞；**p《0.01；*p《0.05。[0047]图9：c-30抑制phd3的表达水平。(a)采用qrt-pcr分析30μm salidroside或c-30处理的c2c12细胞中phd1、phd2和phd3的mrna表达水平。(b)30μm的salidroside和c-30处理骨骼肌细胞后，蛋白免疫印迹检测hif-1α、phd1、phd2和phd3的蛋白表达水平，β-actin为qrt-pcr归一化和蛋白上样的内参。数据用平均数+sd差表示，(n＝3)*p《0.05；**p《0.01；ns:无显著差异。[0048]图10：骨骼肌细胞条件培养基的制备。(a)正常血糖培养条件下用空白溶剂处理的c2c12细胞条件培养基(cm-n)制备示意图。(b)高血糖培养条件下用空白溶剂、30μm sa或30μm c-30处理的c2c12细胞条件培养基(cm-h)、(cm-h/sa)或(cm-h/c-30)制备示意图。[0049]图11：c-30处理后的骨骼肌细胞分泌，增强高血糖下血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移能力。(a-d)用edu-掺入法检测cm-h/c-30培养的huvecs(a和b)和movas细胞(c和d)在高血糖下的增殖能力。(a和c)为代表性图像(标尺：200μm)，(b和d)为edu阳性细胞与hoechst阳性细胞之比与对照组比较的相对值(n＝6)。(e-h)使用鬼笔环肽染色分析高血糖下用cm-h/c-30培养的huvecs(e和f)和movas细胞(g和h)中的f-肌动蛋白聚合。(e和g)为代表性图片(标尺：100μm，小图50μm)；(f和h)为f-肌动蛋白分形维数的定量分析(n＝6)。(i-l)用transwell小室实验检测cm-h/c-30培养的huvecs(i和j)和movas细胞(k和l)在高血糖下的迁移。(i和k)为代表性图像(标：100m)；(j和l)为迁移到transwell室下室的细胞数统计分析(n＝6)。数据以平均值±sd表示，(n＝3)。cm-n：正常血糖条件下，从空白溶剂处理的c2c12细胞中获得的条件培养基；cm-h、cm-h/sa、cm-h/c30：高血糖条件下，分别从空白溶剂、salidroside、c-30处理的c2c12细胞中获得的条件培养基。**p《0.01；*p《0.05；ns：无显著差异。[0050]图12：hif-1α在c-30通过骨骼肌细胞的分泌，促进血管内皮细胞和平滑肌细胞在高血糖下的增殖和迁移的作用中至关重要。(a-d)在高血糖条件下用hif-1α沉默的c2c12细胞条件培养基培养的huvec(a和b)和movas细胞(c和d)的增殖潜力，用edu掺入测定。代表性图像(比例尺：200μm；a和c)以及edu阳性细胞与hoechst阳性细胞的比率(n＝6；b和d)。(e-h)在高血糖下用hif-1α沉默的c2c12细胞条件培养基培养的huvec(e和f)和movas细胞(g和h)的迁移潜力，用transwell小室迁移实验测定。代表性图像(比例尺：100μm；e和g)和迁移到transwell室下室的细胞数量(n＝6；f和h)。cm-h/shcon和cm-h/shcon+c-30：分别用空白溶液和c-30处理的c2c12细胞获得的条件培养基；cm-h/shhif-1α和cm-h/shhif-1α+c-30：分别从用载体和c-30处理的hif-1α沉默的c2c12细胞中获得的条件培养基；数据表示为平均值±sd。*p《0.05；**p《0.01；ns：不显著。[0051]图13：高血糖培养条件下vegf-a和pdgf-bb对c-30诱导的骨骼肌细胞和血管形成细胞之间的相互作用至关重要。(a-d)用edu-掺入法检测cm-h/c-30培养的huvecs(a和b)和movas细胞(c和d)用vegf受体抑制剂ki8751或pdgf-bb受体抑制剂cp868596处理后的增殖潜力。(a和c)为代表图像(标尺：200μm)，(b和d)表示edu阳性细胞与hoechst阳性细胞之比与对照组比较的相对值(n＝6)。(e-h)用transwell小室迁移试验检测cm-h/c-30培养的huvecs(e和f)和movas细胞(g和h)用vegf受体抑制剂ki8751或pdgf-bb受体抑制剂cp868596处理后的迁移能力。(e和g)为代表性图像(标尺：100μm)，(f和h)为迁移到transwell下室的细胞数统计分析(n＝6)。数据以平均值±sd表示(n＝3)。cm-n：正常血糖条件下，空白溶液处理c2c12细胞后获得的条件培养基；cm-h和cm-h/c30：高血糖条件下，分别用空白溶剂或c-30处理c2c12细胞后获得的条件培养基；**p《0.01。[0052]图14：肌肉注射c-30可促进糖尿病hli小鼠血液灌注恢复。(a)左股动脉切除诱导hli的示意图。(b和c)在指定时间点，对糖尿病hli小鼠缺血后肢肌肉注射指定浓度的c-30或salidroside后血流恢复情况。(b)为激光多普勒成像系统获得的代表性图像，(c)为缺血后肢(左)与非缺血后肢(右)的血流灌注对比分析结果。(d)在指定时间点对糖尿病hli小鼠缺血后肢肌肉注射指定浓度的c-30或salidroside后的形态学评估(0＝与对照组无差异；1＝颜色略有变化；2＝颜色变化适中；3＝严重变色、坏死、皮下组织丢失；4＝下肢截肢；每组n＝8)。(e和f)糖尿病hli小鼠缺血后肢腓肠肌中血管内皮细胞(pecam-1阳性)和平滑肌细胞(α-sma阳性)的免疫荧光。(e)为代表性图像(标尺：100μm)，(f)为定量分析结果(n＝6)。数据以均值±sd表示(n＝3)。(g)蛋白免疫印迹法检测向糖尿病hli小鼠缺血后肢肌内注射指定浓度c-30或salidroside术后21天后hif-1α和血管生成因子的蛋白质表达水平。con：对照组；sa：小鼠肌注salidroside；c-30：小鼠肌肉注射c-30。**p《0.01；*p《0.05；ns：无显著差异。[0053]图15：c-30对糖尿病hli小鼠各种组织的影响。(a)tunel法分析相应浓度的c-30和salidroside注射糖尿病hli小鼠缺血后肢腓肠肌凋亡率。代表性图像(标尺：100μm，左图)，tunel阳性细胞与dapi阳性细胞的比例(n＝6；右)。(b)30mg/kgc-30给药组糖尿病hli小鼠的心、肝、脾、肺、肾免疫组化。标尺：100μm。数据以均数±标准差表示。**p《0.01。[0054]图16：红景天苷类似物c-30通过增强骨骼肌细胞活力、迁移和分泌从而促进糖尿病hli小鼠血管生成和血液灌注恢复的药理活性示意图。[0055]图17：c-30促进非糖尿病hli模型小鼠血流灌注恢复。(a)非糖尿病hli小鼠缺血后肢在指定时间点肌注30mg/kg c-30后的血液灌注，由激光多普勒成像系统测得的代表性图像。(b)非糖尿病hli小鼠缺血(左)后肢与非缺血(右)后肢在指定时间点肌注30mg/kg c-30的血灌注比(n＝4)。con：小鼠注射空白溶剂。**p《0.01。具体实施方式[0056]为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0057]如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。[0058]本发明还包括同位素标记的化合物，它们等同于式c-1至c-33所述的那些，但一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子所代替。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氧的同位素，分别例如2h、3h、13c、11c、14c、18o和17o。[0059]本发明中的治疗糖尿病的药物和/或治疗下肢缺血性疾病的药物也可以包含一种或多种辅料。辅料没有限定，例如溶剂、等张剂、ph调整剂、抗氧化剂、保存剂等本领域常用的辅料。[0060]作为溶剂可以列举：注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油之类的醇类等。[0061]作为等张剂可以列举：山梨醇、氯化钠、葡萄糖等本领域常用的等张剂。[0062]作为ph调整剂可以列举：盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、强氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。[0063]作为抗氧化剂可以列举：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等。[0064]作为保存剂可以列举：尼泊金类、山梨酸及其盐等本领域常用的保存剂。[0065]合成实施例：[0066]1)c-1到c-6、c-17到c-22、c-26到c-33的主体合成路线：[0067][0068]合成路径1β-o-糖苷化合物c-1到c-6、c-17到c-22、c-26到c-33的合成。试剂和条件：(a)三氟化硼乙醚，二氯甲烷，-10℃到室温，过夜；(b)甲醇钠，甲醇，盐酸，2步收率30-65％；(c)10％钯碳，h2，甲醇，收率90-95％。[0069]合成路径1中阐述了β-o-糖苷化合物c-1到c-6、c-17到c-22、c-26到c-33的合成。根据文献方法(das,s.k.；et al，carbohydr.res.2007,342,2309-2315.)所述，在路易斯酸三氟化硼乙醚的催化下，通过相应的醇类或酚类中间体(34a-t)与β-d-葡萄糖五乙酸酯，在干燥二氯甲烷溶液中高效地偶联成了o-糖苷化合物。虽然偶合产物不可避免地包含α和β两种异头异构体，但无需立即将其分离。在过量甲醇钠/甲醇溶液中去除所有的乙酰基后，盐酸酸化反应液ph＝1-2，然后在室温下搅拌，大部分α异构体糖苷键又被水解开来，相对稳定的β异构体用硅胶柱层析纯化(如有需要,进一步用pd/c催化加氢脱苄基保护)，得到目标化合物。核磁共振氢谱中，目标产物糖环1，2号位氢原子的耦合常数j1,2＝7～8hz，证实所有产物均为β构型。[0070]2)β-c-糖苷化合物c-15、c-16、c-23到c-25的主体合成路线：[0071][0072]合成路径2β-c-糖苷化合物c-15、c-16、c-23到c-25的合成。试剂和条件：(a)镁粉或正丁基锂，乙醚或四氢呋喃，-78℃；(b)三氟化硼乙醚，三乙基硅烷，乙腈，-30℃；(c)10％钯碳，氢气，甲醇，6-16小时。总收率35-60％。[0073]合成路径2中阐述了β-c-糖苷化合物c-15、c-16、c-23到c-25的合成。根据文献所描述的方法(ho,t.c.，et al，org.lett.2016,18,4488-4490)，起始原料溴代芳烃或烷烃37a-e，首先与镁粉或正丁基锂制备成格氏试剂，然后与过量的糖内酯中间体36反应生成半缩酮中间体38a-e。该半缩酮中间体再经三氟化硼乙醚/三乙基硅烷体系低温下还原得到中间体39a-e，最后经10％钯碳催化下氢化脱除苄基得到目标化合物。[0074]3)β-o-糖苷化合物c-7、c-8、c-11和c-12的主体合成路线：[0075][0076]合成路径3β-o-糖苷化合物c-7、c-8、c-11和c-12的合成。试剂和条件：(a)苯甲醛，对甲苯磺酸，n,n-二甲基甲酰胺，原甲酸三乙酯，78.6％；(b)1.2当量，溴化苄，1.5当量氢氧化钠，80℃，6小时，硅胶柱层析分离区域异构体，收率：41d 18％，41u 22％，41 39％；(c)i.氢化钠，n,n-二甲基甲酰胺，0℃，30分钟，碘甲烷，室温，过夜；ii.10％钯碳，氢气，乙酸乙酯/甲醇(4：1)，2步收率48-76％；(d)i.硫羰基二咪唑，二甲氨基吡啶，二异丙基乙胺，ii.三丁基锡氢，偶氮二异丁腈，甲苯，80℃，4小时，iii.10％钯碳，氢气，乙酸乙酯/甲醇(4：1)，3步收率39-65％。[0077]合成路径3展示了β-o-糖苷类化合物c-7、c-8、c-11和c-12的合成路线。首先由苯甲醛选择性地和化合物c-1糖环上4，6位两个羟基发生缩合反应，得到4,6-o-苯基亚甲基–β-吡喃葡萄糖苷中间体40。糖环2，3位剩余的两个羟基再经溴化苄非选择性单保护，经柱层析分离，得到两个区域同分异构体：3-位苄基保护的41d,和2位苄基保护的41u。将41d和41u中未保护的羟基分别甲基化，然后氢化脱除苄基保护后，得到目标化合物c-7和c-8；同时，对41d和41u进行barton-mccombie脱氧反应将未保护的羟基还原为亚甲基，再经催化氢化反应脱除苄基保护，最终得到目标化合物c-11和c-12。[0078]4)β-o-糖苷化合物c-9，c-10，c-13和c-14的主体合成路线：[0079][0080]合成路径4.β-o-糖苷化合物c-9，c-10，c-13和c-14的合成。试剂和条件：(a)溴化苄，氢氧化钠，76％；(b)三乙基硅烷，i2，0℃，83％；(c)三氟甲磺酸三甲基硅酯，硼烷四氢呋喃，二氯甲烷，分子筛室温，80％；(d)i.氢化钠，n,n-二甲基甲酰胺，0℃，30分钟，碘甲烷，室温，过夜；ii.10％钯碳，氢气，乙酸乙酯/甲醇(4：1)，2步收率48-76％。(e)i.硫羰基二咪唑，二甲氨基吡啶，二异丙基乙胺，ii.三丁基锡氢，偶氮二异丁腈，甲苯，80℃，4小时，iii.10％钯碳，氢气，乙酸乙酯/甲醇(4：1)，3步收率65％.(f)i.对甲苯磺酰氯，三乙胺，二氯甲烷，吡啶，二甲氨基吡啶，0℃→室温，过夜；ii.氢化铝锂，四氢呋喃，40℃，2小时；iii.10％钯碳，乙酸乙酯/甲醇，(4：1)，3步收率47.8％。[0081]合成路径4展示了β-o-糖苷类化合物9-10,13-14的合成路线。首先用过量的溴化苄完全保护中间体40剩余的两个羟基得到中间体42。然后，将42的苄基缩醛环结构在不同的还原反应体系下进行区域选择性开环。其中，用三乙基硅烷/碘开环后，得到4-oh中间体43，而用三甲基硅三氟甲磺酸/硼烷四氢呋喃体系还原，游离出6-oh得到的中间体44。将43和44中暴露额的羟基分别用碘甲烷甲基化，再氢化脱除苄基保护，分别得到所需化合物c-9和c-10；另外，中间体43经barton-mccombie脱氧还原反应将暴露的羟基还原成亚甲基，再经氢化脱除苄基保护保护得到化合物c-13。将44的6-oh与对甲苯磺酰氯酯化，然后用lialh4还原该对甲苯磺酸酯，氢化脱除苄基保护后以较高收率得到目标化合物c-14。30℃，三乙基硅烷(2.0当量)加入到溶液中，接着加入三氟化硼乙醚(2.0当量)，-30℃搅拌反应2h。用水淬灭反应，后乙酸乙酯提取产物，合并的有机相用无水硫酸钠干燥后，蒸掉溶剂，剩余产物按照步骤b脱苄及纯化后得到目标化合物。[0092]procedure d：中间体40-44的合成[0093]合成中间体40[0094]化合物c-1(2.6g，6.67mmol)，苯甲醛(918mg，8.67mmol)，p-甲苯磺酸(316mg，1.67mmol)and原甲酸三乙酯(1.23g，8.3mmol)溶于20ml的n，n-二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，加入乙酸乙酯，有机相用水和盐水先后洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩至干，剩余物用20ml乙酸乙酯加热溶解后，加入150ml正己烷室温搅拌1小时，过滤收集得到的白色固体，真空下干燥后得到中间体40。(2.5g，78.6％)1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.48(dd,j＝6.5,2.9hz,2h),7.41(t,j＝7.3hz,3h),7.39–7.34(m,4h),7.34–7.28(m,1h),7.14(d,j＝8.5hz,2h),6.92(d,j＝8.5hz,2h),5.52(s,1h),5.04(s,2h),4.37(d,j＝7.7hz,1h),4.33(dd,j＝10.5,4.9hz,1h),4.12(dd,j＝15.1,7.9hz,1h),3.79(dd,j＝9.6,4.9hz,1h),3.77–3.68(m,2h),3.54(t,j＝9.3hz,1h),3.50–3.46(m,1h),3.46–3.39(m,1h),2.90(dd,j＝10.3,5.1hz,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.49,137.03,136.91,130.39,129.83,129.26,128.55,128.32,127.91,127.43,126.25,114.92,103.29,101.91,80.53,74.57,73.10,71.28,70.03,68.64,66.42,35.22.[0095]中间体41的合成[0096]中间体40(4.5g,9.4mmol)，氢氧化钠(564mg，14.1mmol)，溴化苄(1.93g，11.2mmol)，溶完全解于混合溶液中(乙腈/n，n-二甲基甲酰胺/h2o，10：1：0.1，v/v/v)，加热到80℃搅拌反应6小时。反应液加水稀释后乙酸乙酯提取产物，合并的有机相用水和盐水先后洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，剩余物用柱层析(正己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷，10：1：2，v/v/v)纯化，并分离出区域异构体(tlc：正己烷/乙酸乙酯，5：1；rf：0.2和0.3)，得到41u(1.2g，22％，rf：0.3)，41d(963mg，18％，rf：0.2)和他们的混合物41(2.2g，39％)。[0097]中间体42的合成[0098]中间体40(2.4g，5mmol)，60％氢化钠(700mg，17.5mmol)，溴化苄(3.0g，17.5mmol)，和四丁基溴化铵20mg溶于30ml n,n-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜。加水淬灭反应，产物用乙酸乙酯萃取。有机相干燥浓缩后，向剩余物中加入正己烷搅拌结晶得到中间体42(2.5g，76％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.48(d,j＝6.3hz,2h),7.35(dt,j＝15.0,6.6hz,10h),7.26(dt,j＝13.7,6.9hz,8h),7.14(d,j＝8.2hz,2h),6.86(d,j＝8.2hz,2h),5.56(s,1h),4.96(s,2h),4.84(dd,j＝43.3,11.4hz,2h),4.66(t,j＝15.3hz,2h),4.51(d,j＝7.6hz,1h),4.34(dd,j＝10.4,4.8hz,1h),4.14(dd,j＝15.6,6.7hz,1h),3.72(ddd,j＝20.8,19.4,9.8hz,4h),3.47–3.42(m,1h),3.42–3.36(m,1h),2.90(t,j＝6.9hz,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.44,138.51,138.39,137.32,137.11,130.77,129.86,128.92,128.54,128.26,128.22,128.04,128.00,127.88,127.60,127.58,127.42,125.99,114.82,104.07,101.12,82.16,81.46,80.81,75.21,75.08,71.23,69.97,68.80,66.02,35.36.[0099]中间体43的合成[0100]中间体42(1.0g，1.5mmol)溶解于8.0ml干燥乙腈中，冷却到0℃，加入三乙基硅烷(0.48ml 3.0mmol)，分次加入单质碘(500mg，2mmol)保持反应液深红色，tlc检测反应进度，直到起始原料完全转化。反应液用水稀释后乙酸乙酯提取产物，合并的有机层用盐水洗涤无水硫酸钠干燥后浓缩，剩余物用硅胶柱层析纯化(正己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷，10：2：1)得到中间体43(832mg,83％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.44–7.25(m,21h),7.17(d,j＝8.5hz,2h),6.89(d,j＝8.5hz,2h),4.99(s,2h),4.94(d,j＝11.4hz,1h),4.75(t,j＝11.8hz,2h),4.64–4.57(m,3h),4.45(d,j＝7.1hz,1h),4.19(dt,j＝9.2,6.6hz,1h),3.79(dd,j＝10.4,3.6hz,1h),3.77–3.70(m,2h),3.64–3.58(m,1h),3.49–3.41(m,3h),2.94(t,j＝7.0hz,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.40,138.63,138.47,137.95,137.15,131.00,129.87,128.55,128.53,128.42,128.30,128.11,127.96,127.89,127.82,127.71,127.61,127.43,114.81,103.68,84.01,81.75,75.25,74.64,74.09,73.67,71.53,70.91,70.29,69.98,35.39.[0101]中间体44的合成[0102]中间体42(1.5g，2.27mmol)溶于30ml二氯甲烷中，加入分子筛，然后加入硼烷四氢呋喃(11.5ml，11.3mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅100μl，室温下搅拌反应2.5小时，加入10ml甲醇和15ml三乙胺淬灭反应，有机相先后用10％碳酸氢钠和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后真空下蒸掉溶剂。剩余物用硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯，4：1，v/v)纯化后得到中间体44(1.2g，80％)。[0103]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.43–7.33(m,4h),7.33–7.24(m,14h),7.24–7.20(m,2h),7.14(d,j＝8.5hz,2h),6.86(d,j＝8.5hz,2h),4.95(d,j＝8.9hz,2h),4.88(dd,j＝23.6,11.0hz,2h),4.76(dd,j＝21.8,11.0hz,2h),4.62(t,j＝11.1hz,2h),4.44(d,j＝7.8hz,1h),4.13(dt,j＝9.2,6.6hz,1h),3.85(ddd,j＝11.7,5.6,2.6hz,1h),3.77–3.68(m,2h),3.60(dt,j＝18.6,9.0hz,2h),3.44–3.37(m,1h),3.34(ddd,j＝9.3,4.2,2.8hz,1h),2.90(t,j＝6.9hz,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.45,138.53,138.42,137.98,137.12,130.81,129.85,128.55,128.49,128.37,128.31,128.07,127.92,127.89,127.86,127.62,127.43,114.83,103.66,84.46,82.33,77.54,75.67,75.08,75.04,74.80,71.08,69.98,62.05,35.41.[0104]procedure e：甲基化类似物c-7到c-10的合成[0105]封管中41d，41u，43或44(1.0当量)溶入n，n-二甲基甲酰胺中，分次加入60％氢化钠(3.0当量)室温搅拌20分钟后，加入碘甲烷(6.0当量)室温下密封反应直到原料完全转化，用水结束反应，产物用乙酸乙酯提取后，按流程b脱苄纯化得到目标化合物。[0106]procedure f：脱氧化合物c-11，c-12和c-13的合成[0107]中间体41d，41u或43(1.0当量)，1，1'-硫羰基二咪唑(2.0当量)，二甲氨基吡啶(0.2当量)，二异丙基乙胺(2.0当量)于n，n-二甲基甲酰胺中室温搅拌20小时。加水淬灭反应后用乙酸乙酯提取产物。有机层用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，加入正己烷析出硫羰基咪唑酯固体，该固体真空干燥后与三丁基锡氢(1.1当量)，偶氮二异丁腈(0.25当量)在甲苯中80℃回流4小时。减压下蒸掉甲苯，加入正己烷强烈搅拌，过滤收集析出的固体，经步骤b脱苄纯化得到目标化合物。[0108]7.具体实例：[0109](2r,3r,4s,5s,6r)-2-(4-(苄氧基)苯乙氧基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-1)白色固体，熔点95.8-97.5℃,(c 0.16，甲醇)。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c21h26o7na，413.1576，found 413.1574.hplc分析方法1，主峰保留时间＝12.39min，95.33％。[0110](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(3-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-2)[0111]由中间体34b(228mg，1.0mmol)按procedure a和b得到c-2(92mg，32.0％for3steps)。白色固体，熔点71.5-73.4℃，(c 0.28，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.07(t,j＝7.8hz,1h),6.71(d,j＝7.4hz,2h),6.65–6.58(m,1h),4.30(d,j＝7.8hz,1h),4.07(dd,j＝17.0,7.6hz,1h),3.87(d,j＝12.2hz,1h),3.77–3.71(m,1h),3.71–3.64(m,1h),3.36(t,j＝8.6hz,1h),3.28(d,j＝7.6hz,2h),3.19(t,j＝8.4hz,1h),2.86(t,j＝6.9hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ156.95,140.06,128.90,119.81,115.40,112.71,102.93,76.64,76.50,73.66,70.25,70.16,61.28,35.74。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o7na,323.1107,found 323.1105.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.73min,97.80％。[0112](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(2-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-3)[0113]由中间体34c(250mg，1.1mmol)按procedure a和b得到c-3(110mg，33.3％for 3steps)。粘稠泡状，(c 0.3，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.12(d,j＝7.1hz,1h),7.01(t,j＝7.5hz,1h),6.74(t,j＝6.9hz,2h),4.32(d,j＝7.8hz,1h),4.05(dd,j＝16.4,8.1hz,1h),3.86(d,j＝11.2hz,1h),3.77(dd,j＝15.9,8.4hz,1h),3.67(dd,j＝11.9,5.0hz,1h),3.39–3.34(m,1h),3.29(dd,j＝15.4,7.0hz,2h),3.19(t,j＝8.3hz,1h),2.93(t,j＝7.4hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.11,130.42,127.06,124.63,119.19,114.60,103.00,76.61,76.48,73.67,70.13,69.35,61.26,30.47。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o7na,323.1107,found 323.1105.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.95min,98.45％。[0114](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-苯乙氧基四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-4)[0115]由中间体34d(200mg，1.63mmol)按procedure a得到c-4(165mg，35.6％for 2steps)。白色固体，熔点113.8-115.9℃，(c 0.28，甲醇)。1h nmr(400mhz，cd3od)δ7.25(d,j＝4.3hz,4h),7.16(dt,j＝8.4,4.1hz,1h),4.30(d,j＝7.8hz,1h),4.09(dd,j＝16.8,7.7hz,1h),3.86(d,j＝12.1hz,1h),3.75(dd,j＝16.5,7.9hz,1h),3.66(dd,j＝11.8,4.9hz,1h),3.37–3.27(m,3h),3.18(t,j＝8.4hz,1h),2.93(t,j＝7.1hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ138.61,128.58,127.90,125.77,102.94,76.65,76.53,73.66,70.28,70.19,61.31,35.80。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found 307.1155.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.12min,99.67％。[0116](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(4-甲氧基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-5)[0117]由中间体34e(310mg，2.04mmol)按procedure a得到c-5(296mg，46.3％for 2steps).白色固体，mp 98.1-100.5℃，(c 0.3，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.17(s,1h),7.15(s,1h),6.83(s,1h),6.81(s,1h),4.29(d,j＝7.8hz,1h),4.05(dd,j＝17.0,7.6hz,1h),3.86(d,j＝10.5hz,1h),3.74(s,3h),3.73–3.63(m,2h),3.40–3.22(m,3h),3.19(t,j＝8.4hz,1h),2.91–2.81(m,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.19,130.53,129.53,113.34,102.92,76.64,76.50,73.66,70.54,70.18,61.31,54.22,34.90。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c15h22o7na,337.1263,found337.1261.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.11min,97.52％。[0118](2r,3r,4s,5s,6r)-2-(4-氟苯乙氧基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-6)[0119]由中间体34f(150mg，1.07mmol)按procedure a得到c-6，124mg(38.6％for 2steps)。白色固体，熔点114.1-116.5℃，(c 0.27，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.27(dd,j＝8.3,5.6hz,2h),6.98(t,j＝8.8hz,2h),4.29(d,j＝7.8hz,1h),4.08(dt,j＝9.4,7.3hz,1h),3.91–3.82(m,1h),3.74(dt,j＝9.5,7.3hz,1h),3.70–3.62(m,1h),3.35(t,j＝8.8hz,1h),3.31–3.25(m,2h),3.18(t,j＝8.4hz,1h),2.92(t,j＝7.1hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ162.71,160.30,134.66,130.30,130.23,114.52,114.31,102.94,76.66,76.53,73.65,70.19,70.15,61.32,34.90.hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h19fo6na,325.1063,found 325.1061.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.32min,98.87％。[0120](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(4-羟基苯乙氧基)-5-甲氧基四氢-2h-吡喃-3,4-二醇(c-7)[0121]由中间体41d(300mg，0.53mmol)按procedure e得到c-7(90mg，53.8％for 2steps)。白色固体，熔点97.2-99.8℃，(c 0.25，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.06(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.3hz,2h),4.31(d,j＝7.8hz,1h),4.09(dt,j＝9.3,6.8hz,1h),3.85(dd,j＝11.9,1.8hz,1h),3.73–3.62(m,2h),3.45(s,3h),3.37–3.24(m,3h),3.24–3.16(m,1h),2.81(t,j＝6.6hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.34,129.49,114.61,103.09,83.42,76.31,76.03,70.45,70.14,61.25,59.51,34.97。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c15h22o7na,337.1263,found 337.1262.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.46min,97.91％。[0122](2r,3r,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(4-羟基苯乙氧基)-4-甲氧基四氢-2h-吡喃-3,5-二醇(c-8)[0123]由中间体41u(300mg，0.53mmol)按procedure e得到c-8(81mg，48.8％for2steps).粘稠泡状，(c 0.15，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.06(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,2h),4.29(d,j＝7.8hz,1h),4.02(dd,j＝16.6,8.0hz,1h),3.85(dd,j＝11.8,1.8hz,1h),3.73–3.64(m,2h),3.63(s,3h),3.35(t,j＝9.3hz,1h),3.28–3.20(m,2h),3.06(d,j＝9.0hz,1h),2.83(t,j＝8.2hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.35,129.50,129.29,114.67,102.88,86.44,76.37,73.49,70.68,69.71,61.18,59.62,34.92.hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c15h22o7na,337.1263,found337.1262.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.50min，98.68％。[0124](2r,3r,4r,5s,6r)-6-(羟甲基)-2-(4-羟基苯乙氧基)-5-甲氧基四氢-2h-吡喃-3,4-二醇(c-9)[0125]由中间体43(330mg 0.5mmol)按procedure e得到c-9(121mg，76.9％for 2steps)。白色固体，熔点177.0-179.5℃，(c 0.29，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.05(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,2h),4.26(d,j＝7.8hz,1h),4.01(dd,j＝16.6,8.1hz,1h),3.81(dd,j＝11.9,1.7hz,1h),3.70(dd,j＝15.1,6.0hz,2h),3.55(s,3h),3.45(t,j＝9.1hz,1h),3.26–3.14(m,2h),3.09(t,j＝9.3hz,1h),2.82(t,j＝7.4hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.34,129.50,129.27,114.69,102.83,79.43,76.67,75.57,73.77,70.67,60.80,59.42,34.93。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc15h22o7na,337.1263,found 337.1262.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.35min,98.60％。[0126](2r,3r,4s,5s,6r)-2-(4-羟基苯乙氧基)-6-(甲氧甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-10)[0127]由中间体44(330mg 0.5mmol)按procedure e得到c-10(118mg，75.2％for 2steps)。粘稠泡状，(c 0.42，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.05(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,2h),4.27(d,j＝7.8hz,1h),3.98(dd,j＝17.0,7.6hz,1h),3.74–3.61(m,2h),3.56(dd,j＝10.8,5.5hz,1h),3.38(s,3h),3.34(dd,j＝8.0,6.4hz,2h),3.31–3.25(m,1h),3.18(t,j＝8.3hz,1h),2.83(t,j＝8.7hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.34,129.51,129.26,114.70,102.95,76.58,75.27,73.59,71.63,70.78,70.16,58.18,34.94。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c15h22o7na,337.1263,found 337.1262.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.52min,95.41％。[0128](2r,3s,4r,6r)-2-(羟甲基)-6-(4-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4-二醇(c-11)[0129]由中间体41d(350mg，0.51mmol)按procedure f，得到c-11(89mg，51.0％for3steps)。粘稠泡状，(c 0.3，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.02(d,j＝8.3hz,2h),6.67(d,j＝8.3hz,2h),4.50(d,j＝8.4hz,1h),4.02(dd,j＝12.0,4.7hz,1h),3.84(t,j＝8.8hz,1h),3.69–3.58(m,2h),3.51(dt,j＝11.6,4.9hz,1h),3.20–3.10(m,2h),2.75(t,j＝7.2hz,2h),2.07(dd,j＝12.4,3.7hz,1h),1.45(dd,j＝21.9,12.0hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.35,129.47,129.43,114.62,99.77,76.60,71.65,71.09,70.11,61.49,38.95,34.99。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found 307.1156.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.49min,》98.0％。[0130](2r,3s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(4-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,5-二醇(c-12)[0131]由中间体41u(400mg，0.59mmol)按procedure f，得到c-12(81mg，65.3％for3steps)。白色固体，熔点134.8-136.2℃，(c 0.5，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.06(d,j＝8.4hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,2h),4.23(d,j＝7.6hz,1h),4.03(dd,j＝16.6,8.1hz,1h),3.84(dd,j＝11.8,2.3hz,1h),3.66(ddd,j＝15.7,13.8,7.0hz,2h),3.54–3.44(m,1h),3.37(ddd,j＝12.1,7.5,5.0hz,1h),3.26–3.20(m,1h),2.82(dd,j＝10.8,4.2hz,2h),2.28(dt,j＝12.0,4.8hz,1h),1.47(q,j＝11.7hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.33,129.51,129.34,114.69,104.98,80.27,70.46,67.91,64.73,61.40,39.14,34.96。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found307.1156hplc分析方法2,主峰保留时间＝3.75min,97.39％。[0132](2r,3r,4s,6s)-6-(羟甲基)-2-(4-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4-二醇(c-13)[0133]由中间体43(330mg，0.5mmol)按procedure f，得到c-13(56mg，39.4％for 3steps)。白色固体，熔点155.3-157.7℃，(c 0.35，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.06(d,j＝8.4hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,2h),4.23(d,j＝7.7hz,1h),4.01(dd,j＝16.3,8.3hz,1h),3.68(dd,j＝16.2,8.4hz,1h),3.63–3.47(m,4h),3.12–3.04(m,1h),2.90–2.74(m,2h),1.91(dd,j＝11.8,5.0hz,1h),1.36(dd,j＝23.7,11.5hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.33,129.49,129.30,114.68,103.26,75.47,72.46,70.75,70.65,64.10,34.99,34.96。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found 307.1156.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.69min,96.91％。[0134](2r,3r,4s,5s,6r)-2-(4-羟基苯乙氧基)-6-甲基四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-14)[0135]由中间体44(330mg，0.5mmol)，吡啶(2.0ml)，二甲氨基吡啶(30mg)，二氯甲烷(2.0ml)，冷却到0℃，加入对甲苯磺酰氯(285mg，3.0mmol)室温搅拌过夜，向反应液中加入乙酸乙酯，先后用2n盐酸，10％碳酸氢钠和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩至干，剩余物溶于干燥四氢呋喃(10.0ml)中，分次加入氢化铝锂(76mg，2.0mmol)40℃反应2小时。加入乙酸乙酯(20ml)and 20％氢氧化钠(0.8ml)淬灭反应，滤除固体，浓缩滤液后剩余物按procedure b脱苄基，得到c-14(68mg，47.8％for 3steps)。粘稠泡状，(c 0.15，甲醇)。1h nmr(400mhz，cd3od)δ7.05(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.3hz,2h),4.26(d,j＝7.8hz,1h),3.95(dd,j＝16.2,8.4hz,1h),3.67(dd,j＝16.0,8.7hz,1h),3.30–3.25(m,2h),3.17(t,j＝8.5hz,1h),2.99(t,j＝9.1hz,1h),2.86–2.77(m,2h),1.27(d,j＝6.1hz,3h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.36,129.46,129.21,114.68,102.83,76.31,75.57,73.90,71.82,70.73,34.97,16.63。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found 307.1156.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.29min,97.72％。[0136](2r,3s,4r,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(4-羟基苯乙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-15)[0137]由中间体37a(580mg，2.0mmol)和36(520mg，0.96mmol)按procedure c得到c-15(97mg，35.2％for 3steps)。白色固体，熔点139.3-141.5℃，(c0.20，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.02(d,j＝8.4hz,2h),6.68(d,j＝8.4hz,2h),3.88(dd,j＝11.9,2.0hz,1h),3.66(dd,j＝11.9,5.8hz,1h),3.32–3.24(m,2h),3.18(dd,j＝5.6,1.9hz,1h),3.12–3.00(m,2h),2.77(ddd,j＝13.8,9.6,4.5hz,1h),2.62(dt,j＝13.6,8.4hz,1h),2.08(dt,j＝15.9,8.4hz,1h),1.72–1.55(m,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ154.84,132.99,129.05,114.60,80.19,78.44,78.23,74.14,70.68,61.78,33.69,30.08。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c14h20o6na,307.1158,found307.1156.hplc分析方法2,主峰保留时间＝5.71min,96.61％。[0138](2r,3s,4r,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(3-(4-羟基苯基)丙基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-16)[0139]由中间体37b(900mg，2.96mmol)和36(800mg，1.48mmol)按procedure c得到c-16(150mg，34.0％for 3steps)。白色固体，熔点136.2-138.5℃，(c0.32，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.99(d,j＝8.4hz,2h),6.67(d,j＝8.4hz,2h),3.83(dd,j＝11.8,2.0hz,1h),3.63(dd,j＝11.8,5.6hz,1h),3.32(dd,j＝12.2,6.0hz,1h),3.29–3.24(m,1h),3.20–3.15(m,1h),3.12(d,j＝7.9hz,1h),3.04(t,j＝8.9hz,1h),2.52(t,j＝6.9hz,2h),1.91–1.79(m,2h),1.70–1.54(m,1h),1.42(dd,j＝18.9,9.1hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ154.77,133.34,128.90,114.55,80.14,79.37,78.45,74.10,70.59,61.69,34.72,31.16,27.36。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc15h22o6na,321.1314,found 321.1320.hplc分析方法2,主峰保留时间＝6.01min,95.89％。[0140](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(3-(4-羟基苯基)丙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-17)[0141]由中间体34g(600mg，1.47mmol)按procedure a和b得到c-17(200mg，43.3％for 3steps)。白色固体，熔点65.2-67.3℃，(c 0.34，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.02(d,j＝8.3hz,2h),6.69(d,j＝8.3hz,2h),4.25(d,j＝7.8hz,1h),3.96–3.82(m,2h),3.67(dd,j＝11.8,5.3hz,1h),3.57–3.47(m,1h),3.40–3.29(m,2h),3.29–3.24(m,1h),3.20(t,j＝8.4hz,1h),2.61(t,j＝7.5hz,2h),1.93–1.79(m,2h)。13cnmr(101mhz,cd3od)δ154.89,132.71,128.99,114.64,102.98,76.65,76.42,73.71,70.20,68.67,61.31,31.49,30.81.hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c15h22o7na,337.1263,found 337.1261.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.45min,99.73％。[0142](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(2-(4-羟基苯基)-2-甲基丙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-18)[0143]由中间体34h(220mg，0.86mmol)按procedure a和b得到c-18(160mg，57.0％for 3steps)。白色固体，熔点135.0-136.9℃，(c 0.42，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.22(d,j＝8.6hz,2h),6.70(d,j＝8.6hz,2h),4.20(d,j＝7.8hz,1h),3.94(d,j＝9.4hz,1h),3.84(dd,j＝11.8,1.5hz,1h),3.65(dd,j＝11.9,5.5hz,1h),3.44(d,j＝9.5hz,1h),3.31(dd,j＝18.8,9.6hz,2h),3.26–3.20(m,1h),3.19–3.14(m,1h),1.30(s,6h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ154.87,138.22,126.77,114.33,103.53,79.03,76.63,76.42,73.73,70.17,61.30,37.93,25.25,25.22。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c16h24o7na,351.1420,found 351.1418.hplc分析方法1,主峰保留时间＝3.62min,98.76％。[0144](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-((1-(4-羟基苯基)环丁基)甲氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-19)[0145]由中间体34i(640mg，2.38mmol)按procedure a和b得到c-19(320mg，53.8％for 3steps).粘稠泡状，(c 0.23，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.04(d,j＝8.5hz,2h),6.70(d,j＝8.5hz,2h),4.20(d,j＝7.7hz,1h),4.02(d,j＝9.6hz,1h),3.84(d,j＝11.9hz,1h),3.65(dd,j＝11.9,5.5hz,1h),3.53(d,j＝9.6hz,1h),3.32–3.26(m,2h),3.18(dt,j＝17.1,8.4hz,2h),2.37(td,j＝8.7,4.8hz,2h),2.30–2.17(m,2h),2.06(dq,j＝16.9,8.6hz,1h),1.81(qd,j＝9.4,4.7hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ154.78,138.95,126.84,114.22,103.44,77.22,76.67,76.43,73.76,70.11,61.24,45.85,29.67,29.52,15.13。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c17h24o7na,363.1420,found363.1418.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.91min,98.78％。[0146](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(2-甲基-2-苯基丙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-20)[0147]由中间体34j(450mg，3.0mmol)按procedure a得到c-20(452mg，48.3％for2steps).粘稠泡状，(c 0.24，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.43(d,j＝7.5hz,2h),7.27(t,j＝7.7hz,2h),7.15(t,j＝7.3hz,1h),4.22(d,j＝7.8hz,1h),4.02(d,j＝9.5hz,1h),3.85(dd,j＝11.9,1.9hz,1h),3.66(dd,j＝11.9,5.4hz,1h),3.51(d,j＝9.5hz,1h),3.34–3.30(m,1h),3.26(d,j＝8.4hz,1h),3.24–3.19(m,1h),3.16(t,j＝8.3hz,1h),1.37(s,6h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ147.32,127.63,125.77,125.42,103.53,78.68,76.66,76.46,73.71,70.19,61.32,38.60,25.15,25.09。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c16h24o6na,335.1471,found 335.1468.hplc分析方法1,主峰保留时间＝6.88min,94.86％。[0148](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(2-(4-甲氧基苯基)-2-甲基丙氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-21)[0149]由中间体34k(470mg，2.61mmol)按procedure a得到c-21(320mg，35.8％for2steps)。白色固体，熔点68.3-70.2℃，(c 0.13，甲醇)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.28(d,j＝8.7hz,2h),6.83(d,j＝8.7hz,2h),4.17(d,j＝7.6hz,1h),3.97–3.81(m,2h),3.75(s,4h),3.49(d,j＝7.3hz,1h),3.46–3.37(m,2h),3.30(t,j＝8.0hz,1h),3.16(d,j＝9.3hz,1h),1.31(d,j＝9.2hz,6h)。13c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.68,139.06,127.07,113.52,103.59,79.86,76.12,75.41,73.37,69.37,61.39,55.19,38.46,26.09,25.89。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c17h26o7na,365.1576,found365.1574.hplc分析方法1,主峰保留时间＝7.09min,97.39％。[0150](2r,3s,4s,5r,6r)-2-(羟甲基)-6-(3-(4-甲氧基苯基)-3-甲基丁氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-22)[0151]由中间体34l(600mg，3.09mmol)按procedure a得到c-22(322mg，29.3％for 2steps)。白色固体，熔点102.5-104.7℃，(c 0.30，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.27(d,j＝8.8hz,2h),6.83(d,j＝8.8hz,2h),4.11(d,j＝7.8hz,1h),3.81(d,j＝11.9hz,1h),3.75(s,3h),3.74–3.68(m,1h),3.63(dd,j＝11.9,5.5hz,1h),3.35–3.23(m,3h),3.21–3.14(m,1h),3.11(t,j＝8.3hz,1h),2.07–1.91(m,2h),1.30(s,6h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ157.57,140.52,126.31,113.05,102.99,76.62,76.38,73.64,70.11,66.96,61.20,54.19,43.08,35.42,28.74,28.45。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c18h28o7na,379.1733,found 379.1731.hplc分析方法1,主峰保留时间＝9.22min,99.26％。[0152](2r,3s,4r,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(2-(4-甲氧基苄基)苯基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-23)[0153]由中间体37c(370mg，1.3mmol)按procedure c得到c-23(211mg，45.1％for 3steps)。粘稠泡状，(c 0.10，甲醇)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(s,1h),7.09(d,j＝2.6hz,2h),6.92(d,j＝8.4hz,3h),6.71(d,j＝8.1hz,2h),4.37(d,j＝8.7hz,1h),3.98(d,j＝15.8hz,1h),3.84(d,j＝15.9hz,1h),3.64(s,3h),3.54(d,j＝23.8hz,5h),3.05(d,j＝7.5hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.14,137.32,136.91,132.57,129.82,129.22,128.52,126.94,125.55,113.52,81.19,76.62,75.33,71.13,67.33,61.73,54.25,37.53.hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c20h24o6na,383.1471,found383.1469.hplc分析方法1,主峰保留时间＝9.09min,97.96％。[0154](2r,3s,4r,5r,6s)-2-(甲氧基)-6-(3-(4-甲氧基苄基)苯基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-24)[0155]由中间体37d(355mg，1.28mmol)按procedure c得到c-24(288mg，62.5％for3steps).粘稠泡状，(c 0.28，甲醇)。1h nmr(400mhz，cd3od)δ7.27(s,1h),7.25–7.19(m,2h),7.09(d,j＝8.5hz,3h),6.80(d,j＝8.6hz,2h),4.09(d,j＝9.4hz,1h),3.89(s,2h),3.85(s,1h),3.73(s,3h),3.68(dd,j＝12.0,5.2hz,1h),3.45(dd,j＝15.7,6.9hz,1h),3.38(t,j＝8.2hz,2h),3.34(s,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.05,141.52,139.47,133.27,129.41,128.14,128.05,127.72,125.24,113.38,82.33,80.79,78.38,74.96,70.53,61.75,54.22,40.51。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc20h24o6na,383.1471,found 383.1469.hplc分析方法2,主峰保留时间＝6.19min,96.48％。[0156](2r,3s,4r,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(4-(4-甲氧基苄基)苯基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-25)[0157]由中间体37e(355mg，1.28mmol)按procedure c得到c-25(151mg，32.7％for3steps)。白色固体，熔点95.3-97.8℃，(c 0.32，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.32(d,j＝8.0hz,2h),7.15(d,j＝7.9hz,2h),7.07(d,j＝8.5hz,2h),6.79(d,j＝8.5hz,2h),4.09(d,j＝9.4hz,1h),3.86(s,2h),3.86-3.82(m,1h),3.72(s,3h),3.68(dd,j＝11.9,5.1hz,1h),3.46(dd,j＝16.5,7.9hz,1h),3.40-3.32(m,3h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.04,141.61,137.00,133.35,129.35,128.09,127.69,113.39,82.06,80.73,78.35,74.92,70.53,61.76,54.24,40.29。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc20h24o6na,383.1573,found 383.1469.hplc分析方法1,主峰保留时间＝10.23min,98.93％。[0158](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-((4'-甲氧基-[1,1'-联苯]-2-基)氧)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-26)[0159]由中间体34m(500mg，2.5mmol)按procedure a得到c-26(450mg，49.7％for2steps)。白色固体，熔点55.2-58.1℃，(c 0.32，dmso)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.52(d,j＝8.7hz,2h),7.25(dd,j＝9.0,6.2hz,3h),7.10–7.00(m,1h),6.93(d,j＝8.7hz,2h),5.02(d,j＝7.3hz,1h),3.86(dd,j＝11.9,1.3hz,1h),3.79(s,3h),3.68(dd,j＝12.0,5.3hz,1h),3.46–3.35(m,4h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.74,154.05,130.96,130.66,130.47,130.25,127.76,122.04,114.95,112.96,100.33,76.93,76.68,73.50,69.83,61.08,54.27。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c19h22o7na,385.1263,found 385.1261.hplc分析方法1,主峰保留时间＝10.59min,95.04％。[0160](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-((4'-甲氧基-[1,1'-联苯]-3-基)氧)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-27)[0161]由中间体34n(750mg，3.75mmol)按procedure a得到c-27(700mg，51.5％for2steps)。白色固体，熔点199.1-201.5℃，(c 0.25，dmso)。1h nmr(400mhz,dmso)δ7.62(d,j＝8.7hz,2h),7.34(t,j＝7.9hz,1h),7.30–7.23(m,2h),6.99(dd,j＝15.4,5.3hz,3h),4.95(d,j＝7.2hz,1h),3.79(s,3h),3.73(dd,j＝11.6,3.5hz,1h),3.48(dt,j＝11.7,5.9hz,1h),3.38–3.30(m,1h),3.33–3.25(m,2h),3.18(dt,j＝13.6,7.0hz,1h)。13c nmr(101mhz,dmso)δ159.41,158.38,141.61,132.65,130.22,128.24,120.11,115.07,114.74,114.46,100.89,77.55,77.10,73.74,70.30,61.21,55.60。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c19h22o7na,385.1263,found 385.1262.hplc分析方法1,主峰保留时间＝10.28min,96.25％。[0162](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-((4'-甲氧基-[1,1'-联苯]-4-基)氧)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-28)[0163]由中间体34o(600mg，3.0mmol)按procedure a得到c-28(500mg，46.8％for2steps)。白色固体，熔点227.5-229.2℃，(c 0.15，dmso)。1h nmr(400mhz,dmso)δ7.54(dd，j＝8.5,6.6hz,4h),7.10(d,j＝8.6hz,2h),7.00(d,j＝8.7hz,2h),4.89(d,j＝7.2hz,1h),3.78(s,3h),3.72(dd,j＝10.5,5.2hz,1h),3.49(dt,j＝11.7,5.9hz,1h),3.33-35(m,1h),3.32–3.23(m,2h),3.19(dt,j＝14.2,7.1hz,1h)。13c nmr(101mhz,dmso)δ158.89,156.98,133.97,132.62,127.76,127.52,117.10,114.73,100.96,77.51,77.05,73.70,70.15,61.16,55.57。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc19h22o7na,385.1263,found 385.1258.hplc分析方法1,主峰保留时间＝10.38min,97.69％。[0164](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(2-(4-甲氧基苄基)苯氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-29)[0165]由中间体34p(200mg，0.93mmol)按procedure a得到c-29(200mg，6.9％for 2steps)。白色固体，熔点112.5-114.7℃，(c 0.30，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.19–7.09(m,4h),7.03(d,j＝7.4hz,1h),6.94–6.87(m,1h),6.78(d,j＝8.5hz,2h),4.91(d,j＝7.3hz,1h),4.03(d,j＝15.0hz,1h),3.95–3.85(m,2h),3.72(s,3h),3.71–3.65(m,1h),3.50(dd,j＝16.9,9.1hz,2h),3.40–3.35(m,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ157.87,155.28,133.16,131.18,129.83,129.61,126.92,121.88,114.82,113.24,101.24,76.80,76.67,73.62,69.93,61.11,54.22,34.31。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c20h24o7na,399.1420,found 399.1418.hplc分析方法2,主峰保留时间＝7.66min,97.51％。[0166](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(3-(4-甲氧基苄基)苯氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-30)[0167]由中间体34q(120mg，0.56mmol)按procedure a得到c-30(121mg，57.1％for2steps)。白色固体，熔点132.1-133.5℃，(c 0.25，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.15(t,j＝7.7hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,2h),6.89(d,j＝9.0hz,2h),6.81(t,j＝7.7hz,3h),4.84(d,j＝7.2hz,1h),3.84(s,2h),3.73(s,3h),3.67(dd,j＝12.0,4.5hz,1h),3.43(dd,j＝9.8,7.0hz,2h),3.36(t,j＝9.8hz,2h),3.28(d,j＝9.4hz,1h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ158.09,157.75,143.41,133.02,129.48,128.86,122.36,116.70,113.66,113.41,100.72,76.59,76.55,73.45,69.84,60.96,54.23,40.37。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c20h24o7na,399.1420,found 399.1419.hplc分析方法1,主峰保留时间＝11.29min,97.53％。[0168](2r,3s,4s,5r,6s)-2-(羟甲基)-6-(4-(4-甲氧基苄基)苯氧基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-31)[0169]由中间体34r(428mg，2.0mmol)按procedure a得到c-31(450mg，59.8％for 2steps)，白色固体，熔点126.2-128.3℃，(c 0.34，甲醇)。1h nmr(400mhz，cd3od)δ7.05(t,j＝8.2hz,4h),6.99(d,j＝8.6hz,2h),6.79(d,j＝8.6hz,2h),4.84(d,j＝7.2hz,1h),3.89–3.84(m,1h),3.80(s,2h),3.72(s,3h),3.67(dd,j＝12.1,4.9hz,1h),3.43(dd,j＝8.1,4.0hz,2h),3.41–3.35(m,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ157.99,155.95,135.74,133.58,129.29,129.26,116.34,113.38,101.01,76.63,76.54,73.50,69.94,61.07,54.23,39.67。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c20h24o7na,399.1420,found399.1419.hplc分析方法1,主峰保留时间＝11.42min,97.87％。[0170](2s,3r,4s,5s,6r)-2-(4-(4-羟基苄基)苯氧基)-6-(羟甲基l)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-32)[0171]由中间体34s(200mg，0.69mmol)按procedure a得到c-32(150mg，60.0％for2steps)。白色固体，熔点215.1-217.2℃，(c 0.20，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.06(d,j＝8.5hz,2h),6.98(d,j＝8.6hz,2h),6.95(d,j＝8.4hz,2h),6.67(d,j＝8.4hz,2h),4.85(d,j＝7.4hz,1h),3.87(d,j＝11.6hz,1h),3.78(s,2h),3.67(dd,j＝12.0,4.8hz,1h),3.44(dd,j＝10.7,7.9hz,2h),3.37(d,j＝7.0hz,2h)。13c nmr(101mhz,cd3od)δ155.90,155.12,135.94,132.41,129.30,129.22,116.28,114.69,100.99,76.63,76.53,73.49,69.93,61.06,39.70。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd forc19h22o7na,385.1263,found 385.1262.hplc分析方法2,主峰保留时间＝5.16min,97.54％。[0172](2s,3r,4s,5s,6r)-2-(4-(3,4-二羟基苄基)苯氧基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(c-33)[0173]由中间体34t(250mg，0.63mmol)按procedure a得到c-33(100mg，42.0％for 2steps)。白色固体，熔点215.1-217.2℃，(c 0.25，甲醇)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.05(d,j＝8.5hz,2h),6.97(d,j＝8.5hz,2h),6.64(d,j＝8.0hz,1h),6.55(d,j＝1.5hz,1h),6.46(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),4.83(d,j＝7.3hz,1h),3.85(d,j＝11.6hz,1h),3.71(s,2h),3.66(dd,j＝12.0,4.7hz,1h),3.46-3.40(m,2h),3.39-3.35(m,2h)。13cnmr(101mhz,cd3od)δ155.88,144.73,142.97,135.92,133.21,129.26,119.65,116.25,115.55,114.81,101.01,76.61,76.53,73.50,69.94,61.06,39.93。hrms(esi)m/z：[m+na]+calcd for c19h22o8na,401.1212,found 401.1210.hplc分析方法2,主峰保留时间＝4.60min,96.65％。[0174]药理学活性、细胞及动物实验[0175]1化合物初步的理化性质及吸收、分布、代谢和排泄(adme)研究[0176]该部分研究内容在沈阳药科大学进行，涉及的实验动物为雄性sprague-dawley大鼠(7周，体重200±20g)，购自沈阳药科大学实验动物中心，获得沈阳药科大学动物实验伦理委员会批准。人血浆取自沈阳军区总医院，保存于沈阳军区总医院生物标本库。人血浆采集经沈阳军区总医院研究伦理委员会批准。[0177]①lgpo/w[0178]一定浓度(c0)的药物水溶液2ml和辛醇2ml加入到5ml的玻璃管中。室温摇匀3天,2500rpm离心10min，弃有机相，采用hplc(l-2320,hitachi,日本)，l-2420uv检测器(hitachi)测定液相(cw)中的药物浓度。色谱柱为diamonsil·c18(200mm×4.6mm,5μm)(迪马科技，beijing，china)。检测条件：波长275nm；柱温：35.0℃；流速：0.7ml/min；进样量：20μl；流动相比例(甲醇/水(v/v))：91/18salidroside，70/30c-29,c-30和c-31,50/50c-32和c-33。表观油水分布系数(po/w)按公式计算:po/w＝(c0-cw)/cw[0179]②溶解度[0180]过量的药物加入水中，超声5min，在室温下振荡3天，10000转离心5min。上层清液用水稀释，然后取20μl稀释液，注入hplc(l-2320,hitachi,日本)记录峰面积，利用标定曲线计算药物的表观溶解度。[0181]③pka[0182]采用分光光度法测定各药物在不同ph值下的吸光度，然后通过ig[in-]/[hin]～ph线性曲线得到pka值。[0183]④血浆稳定性[0184]在1.5ml ep管中加入100μl大鼠血浆，并分别加入10μl样品液，使sa和c-30浓度分别为6.25、12.5和25mg/l(3个重复)。混合30s后，在室温静置12h，加入300ml甲醇淬灭反应。涡旋2min，10000rpm离心5min，用hplc测定上清液中药物浓度。[0185]⑤血浆绑定率[0186]采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率。将1ml人血浆加入之前在pbs缓冲液(ph7.4)中浸泡数小时的透析袋中。将透析袋浸泡在10ml药液中，置于4℃，直至药物扩散达到平衡。蛋白试验阳性的透析液弃用。采用hplc(l-2320,hitachi，日本)测定透析前后药物浓度。血浆蛋白结合率按以下公式计算:[0187]ppb＝(dt-df)/dt×100％＝(1-df/dt)×100％[0188]ppb：血浆蛋白结合率；dt：透析前药物浓度；df：透析后游离药物浓度。[0189]⑥肌肉稳定性[0190]试剂和仪器放置4℃预冷。大鼠处死后，取腓肠肌。肌肉匀浆由100mg肌肉在400ml生理盐水中研磨制成。取50μl的匀浆加入250μl药液中，37℃孵育30min，加入900ml甲醇停止反应，10,000rpm离心5min。采用hplc(l-2320,hitachi,日本)测定上清液中药物浓度。[0191]⑦肝微粒体稳定性[0192]大鼠禁食一夜后处死。冰水浴条件下，用组织匀浆器将100mg肝脏和400ml蔗糖溶液制备肝匀浆。将匀浆于20,000×g,4℃离心20min。上清液于100,000×g,4℃离心60min。沉淀用tris-hcl缓冲液(ph值7.4,包含10mm mgcl2和10mm氯化钾)重悬浮。10μl的微粒体添加入不同浓度的药物溶液中，置37℃预孵育10分钟。加入1mm的nadph的开始反应，孵化30分钟后，加入3倍体积甲醇停止反应。10,000rpm离心5min。hplc(l-2320,hitachi,日本)测定上清液中药物浓度。[0193]⑧caco-2细胞渗透性实验[0194]将传代数为35至45的caco-2细胞接种在12孔板中的transwell小室(1.12cm2表面，0.4μm孔径，12mm直径；corning costar,corning,ny)上以1-1.5×105个细胞/cm2的密度生长21天。单层细胞的teer使用millicell ers-2(millipore,billerica,ma)测量，电阻teer值应超过400ω·cm2。酚红的表观渗透系数papp(ab)和地高辛(一种p-gp底物)的流出率(er)作为caco-2单层模型成功建立的参考对照。[0195]将所有化合物溶解在100％hbss中以提供50μg/ml并用作药物溶液。在渗透实验之前，将caco-2细胞单层用预热(37℃)的hbss轻轻冲洗两次，并在37℃下孵育30分钟。对于从顶端(ap)侧向基底外侧(bl)侧转运的实验，在ap侧加入0.5ml药物溶液，在bl侧加入1.5ml hbss。在37℃下孵育120分钟后，从bl侧收集样品(0.4ml)。对于从bl到ap的渗透实验，在bl侧添加1.5ml样品，在ap侧添加0.5ml hbss。在上述时间间隔内，从ap侧收集了0.4ml样品。样品中的药物浓度通过hplc-uv分析方法确定。所有孵育均一式三份进行。[0196]2细胞培养[0197]①细胞培养[0198]小鼠成肌细胞c2c12、血管内皮细胞人脐血管内皮细胞(huvec)、平滑肌细胞movas及人结肠上皮细胞系caco-2细胞购自american type culture collection(atcc)。所有细胞在杜尔贝克改良的eagle培养基(dmem)(gibco，life technologies，grand island，ny)中添加10％胎牛血清(fbs；biological industries，贝特·哈梅克，以色列)，在高湿度的孵化器中培养(37℃，5％co2)。c2c12细胞使用前，在含1％胎牛血清的dmem中培养5天分化为成熟的骨骼肌细胞(watanabe y,et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.2016,113,6011-6016)。[0199]②基因敲减实验[0200]在hif-1α敲除实验中，按照lipofectamine 2000(invitrogen，grand island，ny)使用说明，将用空白载体(shcon)或靶向hif-1α的shrna表达载体(shhif-1α)转染入c2c12细胞中。6小时后换培养基，继续孵育24小时后，用嘌呤霉素(2.5μg/ml，36小时)清除未转染的细胞。[0201]③高血糖或正常血糖条件下低氧实验[0202]细胞分别培养在含有25μm(高糖浓度)或5.5μm(正常糖浓度)葡萄糖的dmem培养基中培养24小时，然后加入相应的不含fbs的dmem，加药或不加药处理12小时后，然后将细胞置于低氧盒(anaeropouch box，0.1％o2，mitsubishi gas chemical，东京，日本)中，再将低氧盒放置于孵育箱中培养直到设定的实验时间。[0203]3质粒构建[0204]①双荧光素酶报告基因质粒的构建[0205]1)5×hre-luc报告基因质粒[0206]荧光素酶报告基因质粒是由五个串联缺氧反应元件(5×hre)驱动的荧光素酶报告载体质粒。[0207]2)pdgf-b-luc报告基因质粒[0208]a.使用tianamp genomic dna kit(天根生物科技，北京，中国)试剂盒从小鼠c2c12细胞中提取基因组dna作为模板，小鼠pdgf-b(nc_000081.7)的-673～+268区域使用max dna聚合酶(takara bio,大连,中国))进行扩增。(上游引物为5’—cgcgatatcgcatcttggtggcagtcctt—3’，下游引物为5’—ctgaagcttgctcgggtcagtctgtctat—3’)，扩增的产物用凝胶电泳分离，胶回收，获得纯化的目标dna片段。[0209]b.将上述扩增得到的dna片段和pgl4.13报告基因载体质粒分别用ecori和hindiii进行双酶切，将双酶切后的载体质粒进行凝胶电泳，通过胶回收试剂盒获得所需的载体片段。[0210]c.双酶切后的目的dna片段与纯化后的载体片段进行酶链接，转化入大肠杆菌，涂板，37℃培养过夜。[0211]d.挑取一定数量的单个菌落，进行菌落pcr。[0212]e.对菌落pcr获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，将能够扩增出目的条带的菌落，在37℃下小量摇菌培养过夜。[0213]f.用小量提取试剂盒提质粒后ecori和hindiii进行双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，将双酶切后能电泳出目的片段的质粒进行测序。[0214]g.比对测序结果与目的片段序列，序列比对一致者表示质粒构建已经成功。[0215]②shhif-1α敲减质粒的构建[0216]对于敲减hif-1α，通过靶向小鼠hif-1α(nm_001313919)的shrna表达载体，靶点:gtgaaaggattcatatcta(shhif-1α-1)，或gacacagcctcgatatgaa(shhif-1α-2))按照文献(miyagishi m,et al.,oligonucleotides,2003,13(5):325-33)描述的方式构建。对于空白载体(shcon)，则使用了u6启动子下游含有7个胸腺嘧啶的载体。4双荧光素酶报告基因活性筛选实验[0217]①24孔板每孔中种入1×104个c2c12细胞，高糖条件下培养24小时。[0218]②按照lipofectamine 2000(invitrogen,grand island，ny)说明书，将5xhre-luc或pdgf-b-luc报告基因载体和作为内参的海肾荧光素酶表达质粒(prl-sv40，promega,fitchburg,wi)混合后，共同转染入c2c12细胞中。[0219]③质粒转染6小时后，置换无血清高糖培养基，加入指定浓度的化合物或空白溶剂，继续稳定孵育12小时，然后放入低氧盒中继续孵育24小时。[0220]④从低氧盒中取出24孔板，向每孔中加入报告基因细胞裂解液100μl，振摇15-20分钟，充分裂解细胞。[0221]⑤收集裂解液，10,000转/分钟离心5分钟，取上清液进行进行下一步测定，或放置-80℃待测。[0222]⑥避光条件下：取每孔裂解上清液20μl，加入96孔白色检测板中，每孔同步加入30μl的larii溶液，测定第一次化学发光值，并记录数据。[0223]⑦往上述检测孔中加入30μl stop&glo检测液，测定第二次化学发光值数据，并记录数据。[0224]⑧用第一次测得值比上第二次测得值，计算出相对发光值。[0225]5rna提取及实时荧光定量pcr(qpcr)[0226]①rna提取与反转录[0227]1)将6孔板中，高糖条件下化合物或其空白溶剂处理12小时后的c2c12细胞，放置在低氧条件下培养12小时。[0228]2)取出细胞，快速用pbs清洗2次，每孔分别加入1.0ml trizol裂解液，轻轻吹打细胞确保所有细胞完全脱离，将裂解液收集入1.5ml无菌ep管中。[0229]3)向裂解液中加入氯仿500μl，漩涡剧烈振荡30s，冰浴中静置5分钟。[0230]4)设定4℃下，10,000转/分钟，离心15分钟，然后将上清液转移到新的1.5ml无菌ep管中，加异丙醇500μl，上下颠倒混合3次，冰浴中静置10分钟，然后4℃下10,000转/分钟离心15分钟。[0231]5)倒掉上清，用1ml 75％乙醇小心吹打洗涤ep管底部的白色固体。然后4℃下10,000转/分钟离心5分钟。[0232]6)倒掉上层乙醇，将ep管放置于冰盒上，小心吸除或晾干管壁残余的乙醇，用适量的depc水完全溶解ep管底部沉淀，得到样品rna溶液。[0233]7)用nanodrop 2000(thermo,waltham,ma)测定每个rna样品浓度，各取1μg rna参照试剂盒primescript reagent kit with gdna eraser(takara bio,大连,中国)的说明书进行反转录。多余rna置-80℃储存。将反转录得到的cdna溶液用depc水稀释10倍，作为后续实时荧光定量模板溶液，-20℃保存待用。[0234]②实时荧光定量pcr(qpcr)[0235]1)按下表1准备每孔pcr的反应液:[0236]表1.qpcr反应体系[0237][0238]2)在bio-rad荧光定量pcr仪器中按下表2设定以下温度及时间控制流程进行qpcr反应。本实施例中，qpcr实验中所用的内参基因为β-actin。[0239]表2.qpcr设定的温度及时间控制流程[0240][0241]6蛋白质提取和蛋白质印迹分析[0242]①正常或高糖条件下，化合物或其空白溶剂处理12小时后的c2c12细胞，放置在低氧条件下培养24小时。[0243]②洗涤细胞，加入含有蛋白酶抑制剂(pmsf和磷酸酶抑制剂(complete cocktail)混合物的ripa裂解液。刮下细胞，将细胞和裂解液全部转移入1.5ml ep管中，冰浴放置裂解10分钟。[0244]③10,000转/分钟，4℃离心15分钟，将上清液转移到1.5ml新的ep管中。[0245]④样品蛋白浓度用bca蛋白定量试剂盒(碧云天,上海,中国)检测。[0246]⑤取等量蛋白质在sds-page凝胶上电泳分离，结束后，将蛋白质条带转移到孔径为0.45μm或0.22μm(对于蛋白质≤10kda)的聚偏氟乙烯(pvdf)膜(millipore，billerica，ma)上，整膜蛋白质面放置朝上，加入5％脱脂奶粉/pbs溶液，4℃封闭过夜。[0247]⑥倒掉奶液，加入按比列配制好的一抗稀释液，室温慢摇1.5小时，tbst洗膜3次，每次5～10分钟。[0248]⑦室温下加入二抗稀释液，慢摇1.5小时，tbst洗3次，每次5-10分钟。[0249]⑧使用supersignal west femto maximum sensitivity substrate显影液(thermo,waltham,ma)进行蛋白显影拍照。[0250]7细胞活力测定[0251]①将细胞接种于96孔板(4x103个/孔)，在高血糖条件下培养24小时，并使用指定浓度化合物或空白处理细胞，12小时后，再将孔板置于低氧盒中，在孵育箱中孵育12小时，24小时或36小时。使用cck-8试剂盒(dojindo,熊本,日本)，按使用说明书制作标准曲线。[0252]②按指定时间检测各板中每个孔的吸光度，并利用吸光度根据标准曲线计算每孔细胞数。[0253]8edu细胞增殖检测(5-乙基-2'-脱氧尿苷掺入标记)[0254]按照试剂盒cell-lighttmedu488in vitro imaging kit(锐博生物，广州,中国)使用说明书进行测定，具体实验步骤如下：[0255]①样品准备：24孔板中，c2c12细胞在正常或高糖状态下用指定的化合物或其空白溶剂处理12小时，然后低氧状态下孵育24小时。[0256]②将edu试剂用培养基按1:1,000稀释，加入每孔细胞中，终浓度为25μm。[0257]③孵箱中放置1.5小时，去除培养基，pbs清洗细胞2次，每次5分钟。[0258]④向每孔加入200μl 4％多聚甲醛液，固定10分钟，pbs清洗细胞2次，每次5分钟。[0259]⑤向每孔加入200μl渗透剂(0.3％tritonx-100)静置10分钟，pbs清洗细胞2次，每次5分钟。[0260]⑥加入200μl按照说明书配制的azide 488反应液，室温避光反应30分钟，pbs清洗细胞3次，每次5分钟。[0261]⑦加入hoechst 3342稀释液200μl染色细胞核，室温静置10分钟。pbs清洗细胞[0262]3次，每次5分钟。[0263]⑧每孔加入抗荧光淬灭剂200μl。[0264]⑨使用荧光显微镜dmi6000b(leica，海德堡，德国)采集图像，使用软件image j进行计数定量。[0265]9细胞迁移实验[0266]①正常或高血糖条件下培养c2c12细胞，用指定的化合物或空白溶剂处理细胞12小时后，再低氧培养12小时。[0267]②低氧后的细胞分别接种于transwell(corning costar,corning,ny)室上室(8×103个/室)，而下室则加入相应的培养基。然后细胞被放置在低氧状态下24小时，让细胞迁移。[0268]③用棉签轻轻擦拭掉上室中未迁移下来的细胞，迁移到下室(transwell外侧)的细胞用结晶紫染色1小时后，吸掉结晶紫染色液，pbs洗涤transwell内外侧各1次(注：不宜多次洗涤，染色的细胞也会被洗掉色)，用棉签或滤纸吸掉小室上多余水分。[0269]④奥林巴斯ix71(olympus，东京，日本)对迁移到下室的细胞拍照，记录每张照片中细胞数量进行统计。[0270]在使用条件培养基(conditioned medium,cm)的实验中，huvecs或movas细胞被种在上室，transwell的下室也加入相应的条件培养基，然后放置低氧环境中24小时。[0271]10酶联免疫吸附试验[0272]使用小鼠vegf-a elisa试剂盒(欣博盛生物科技,深圳,中国)和小鼠pdgf-bbelisa试剂盒(四正柏生物科技h,北京,中国)分别测定条件培养基中vegf-a和pdgf-bb的含量。[0273]11f-actin鬼笔环肽(phalloidin)染色[0274]①细胞种于15mm玻璃底细胞培养皿中，8×103/孔，用指定的化合物或空白溶剂在指定的培养基条件下处理12小时后，再低氧放置12小时。[0275]②去除培养基，pbst洗涤2次，每培养皿中加入500μl 4％多聚甲醛固定细胞10分钟，pbst洗涤2次。[0276]③用0.1％triton x-100渗透10min，pbst洗涤2次。[0277]④用1％牛血清白蛋白封闭1小时。[0278]⑤倒掉封闭液，按phalloidin(invitrogen，grand island，ny)使用说明书所示，每个培养皿中加入phalloidin稀释液200μl(5μl phalloidin+195μl 1％牛血清白蛋白)。室温下避光染色30分钟。[0279]⑥移除染色液，pbst洗涤2次，加入200μl抗荧光淬灭液。[0280]⑦使用共聚焦显微镜(microsystems-tcs sp5，leica,韦茨拉尔，德国)获得细胞f-actin图像，使用软件image j进行分形维数定量。[0281]使用条件培养基的实验中，huvecs或movas细胞种于指定的条件培养基中，放置于低氧条件孵育12小时，再按上述流程进行f-actin染色。[0282]12凋亡率测定[0283]c2c12细胞在正常或高血糖下用指定化合物或空白溶液处理12小时，再置于低氧下孵育24小时。使用annexin v/pi(.翌圣生物，上海，中国)染色细胞，并使用流式细胞术测定凋亡率。[0284]13下肢缺血模型体内实验[0285]①糖尿病模型小鼠的建立[0286]雄性c57 bl/6小鼠(8周)购自中国重庆第三军医大学。所有动物实验均在第三军医大学进行，并获得第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准，按照卫生部《实验动物护理与使用指南》进行。采用氯胺酮/甲苯噻嗪腹腔注射麻醉小鼠(每千克体重注射量分别为5mg和80mg)。[0287]糖尿病小鼠模型建立如文献(surwit r s,et al.,diabetes,1991,40(1):82-7)所述。简要地说，将小鼠随机分组，饲喂高脂饮食(20％蛋白质、20％白糖、60％脂肪)3周，然后连续5天注射新鲜配制的链脲佐菌素(45mg/kg，sigma aldrich，st.louis，mo)。末次注射完等待1周后，先将小鼠空腹过夜，取尾部血液，用accu-chek integra血糖仪(罗氏诊断,上海,中国)检测小鼠血糖浓度。若血糖水平≥16.7mmol/l，则认为糖尿病诱导成功。[0288]②糖尿病或非糖尿病hli模型小鼠的建立给药周期及损伤评估[0289]为了建立hli模型，将糖尿病或非糖尿病小鼠按上述方法麻醉，然后将后肢区脱毛，完全切除左侧股动脉近端(scholz d,et al.,j mol cell cardiol,2002,34(7):775-87；stabile e,et al.,circulation,2003,108(2):205-10；wu s,et al.,mol ther,2008,16(7):1227-34)右侧股动脉未做手术，作为对照。从动脉切除术后一天开始，每3天向缺血下肢肌肉中注射指定化合物或空白溶液。手术后随机分配小鼠，在评估过程中，研究者不知道分组情况。对缺血损伤评估评分为0-4，如文献所述，0＝与非缺血后肢无差异；1＝轻度变色；2＝中度变色；3＝严重变色、皮下组织丢失或坏死；4＝截肢，直到动脉切除术后21天(stabile e,et al.，circulation,2003,108(2):205-10.)。[0290]③激光多普勒血流灌注成像[0291]按上述方法对小鼠进行麻醉。使用激光多普勒灌注成像仪(moor instruments ltd，德文郡阿克明斯特，英国)在手术前后以及术后按指定时间(第0、3、7、14和21天)对缺血(左)和非缺血(右)后肢进行血液灌注测量。左侧缺血后肢的血液灌注测得值与右侧非缺血后肢的血液灌注测得值的比值为恢复的血流灌注率。[0292]14苏木精-伊红染色(h&e)和免疫荧光染色h&e染色时，组织先用4％多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋。然后在低温恒温器下以10μm厚度切片。切片使用二甲苯脱蜡和再水合。使用苏木精和伊红(碧云天,上海,中国)按说明进行染色。[0293]对于免疫荧光染色，取10μm厚度的小鼠下肢腓肠肌组织横向切片，用pecam-1抗体孵育1小时。然后用偶联上cy3染料的单克隆抗体α-sma(sigma-aldrich,st.louis,mo)和alexa fluor 488(invitrogen,grand island，ny)山羊抗大鼠igg孵育(碧云天,上海,中国)。图像由microsystems-tps sp8(leica,海德堡，德国)获得。[0294]15tunel测定[0295]将组织载玻片在0.1％triton x-100中透化，并根据fluorescein in situ cell deathdetection kit(roche applied science,曼海姆,德国)制造商的说明检测tunel阳性细胞。图像使用pannoramic midi(3dhistech,布达佩斯，匈牙利)拍摄。[0296]16统计分析[0297]实验结果均以平均值±sd表示，实验结果参见表3-表6。采用spss statisticsv.23.0进行统计分析。在细胞实验中采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析。动物实验采用非参数mann-whitney检验。两组间差异采用学生t检验进行统计学意义分析。以*p《0.05为显著值。[0298]表3.衍生物活性检测结果[0299][0300][0301][0302][0303]表4.红景天苷及其衍生物caco-2细胞渗透性测试结果[0304][0305]表观渗透系数(papp)使用以下公式计算：dc/dt×v是受体侧的传输速率(μg/s)，其中d为样品渗透后的检测浓度，dt为取样时间，v为取样体积；a是膜表面积(1.12cm2)，c0是供体隔室中的初始药物浓度(μg/ml)；[0306]流出率(er)，即papp(底侧到顶侧)与papp(顶侧到底侧)的比率，使用以下公式计算：[0307]所有数据代表平均±标准误差(三次独立实验)[0308]表5.红景天苷和c-30的初步adme研究[0309][0310][0311]表6.糖尿病下肢缺血性疾病小鼠的血糖[0312][0313]以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。